重症肌无力患者血清IgG-乙酰胆硷受体抗体亚型研究
作者：李继民 刘道宽 吕传真 蒋雨平 肖保国 乔健
单位：李继民(南京医科大学附属脑科医院神经内科 210029)；刘道宽 吕传真 蒋雨平 肖保国 乔健(上海医科大学华山医院神经病学研究所)
关键词：重症肌无力；乙酰胆硷受体抗体；IgG亚型
临床神经病学杂志000502 【摘要】 目的 探讨重症肌无力(MG)患者血清IgG-乙酰胆硷受体抗体(AChRAb)亚型的分布规律及其临床意 义。方法 采用ABC-ELISA法检测43例MG组和25例临床对照组、20例正常对照组血清中IgG-AChRAb亚 型IgG1-4。结果 MG组与两对照组相比IgG1和IgG4亚型抗体无显著差别，IgG2亚型抗体显著升高(P <0.05)，IgG3亚型抗体显著降低(P<0.05)；MG组各临床类型间各亚型抗体无显著 差别。结论 IgG-AChRAb亚型以IgG2活性为主，但未显示与MG临床类型有关。
, 百拇医药
Study on the subclasses of IgG-AChR antibodies in serum in patients with myasth enia g ravis
Li Jimin Liu Daokuan Lü Chuanzhen et al
(Department of Neurology, Brain Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To investigate the role and its clinical signific ance on the subclasses of IgG-AChR ant ibodies in serum in patients with myasthenia gravis.Methods ABC-ELISA technique was used to detect the subclasses IgG1-4 of IgG-AChR antibodies in sera from 43 patients w ith MG, 25 clinical controls and 20 normal controls.Results The re was no obvious difference on IgG1 and IgG4 subclass antibodies b etween MG group and two control groups.IgG2 subclass antibodies increased significantly (P<0.05), IgG3 sub class antibodies decreased significantly(P<0.05).There were no di fferences the various subclass antibodies among various clinical types in MG gro up.Conclusion IgG-AChR antibodies subclasses might take IgG2 activity as the dominant facto r,but there was no any correlation with the clinical types of the disease.
, 百拇医药
【Key words】 Myasthenia gravis Acetylcholine receptor antibody IgG subclass
重症肌无力(MG)是目前论证最清楚的自身免疫性疾病。乙酰胆硷受体抗体(AChRAb)被认为是 MG主要的致病因子。IgG型AChRAb是AChRAb的主要抗体，IgG是由IgG1-44种亚型组 成，故有必要进一步研究IgG-AChRAb亚型抗体。我们采用ABC-ELISA法检测了43例MG患者 血清中IgG-AChRAb亚型，以探讨其在MG中的分布规律及在MG发病机理中的意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 MG组43例，男26例，女17例，年龄5～63岁，平均33.8岁。依据病史、体征 和疲劳试验、新斯的明试验诊断，部分病人经肌电图、胸腺影像学检查、AChRAb检测进一步 证实。根据Osserman法分型：Ⅰ型20例，Ⅱa型11例，Ⅱb型5例，Ⅲ型4例，Ⅳ型2例和Ⅴ型1 例。临床对照组25例，男11例，女14例，年龄16～65岁，平均35.8岁，均为同期住院病人 ，多发性硬化17例，癫痫7例，多发性肌炎1例。正常对照组20名，男8名，女12名，年龄22 ～43岁，平均34岁，均为正常献血员。
, 百拇医药
1.2 方法 均取外周静脉血3 ml，分离血清，-30℃保存备用。IgG-AChRAb亚型抗体测定 采用ABC-ELISA法。首先将5 μg/ml的α-银环蛇毒素(广西医学院蛇毒研究所提供)按 每孔100 μl 包板(聚苯乙烯微量反应板，上海塑料三厂生产)，37℃，2小时，加10%小牛血 清封 板，4℃过夜；加1:25稀释肌肉粗提液(按Lindstnom法[1]改良提取)，37℃，2小时 ；加1:10稀释待测血清，37℃，1小时；加1:400鼠抗人单克隆IgG1-4(Sigma公司生 产)，37℃，1小时；加1:1000辣根过氧化物酶联羊抗鼠IgG(Sigma公司生产)，37℃，1小时 ，加邻苯二胺为底物显色，室温5分钟，用4N硫酸终止反应后立即在511酶标仪(上海分析仪 器三厂生产)上比色，波长为429 nm，自动打印结果。直接以实际测得的OD值为各标本的结 果。
1.3 统计学处理 各组检测数据用方差分析进行处理。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 MG组及临床对照组、正常对照组血清IgG-AChRAb亚型抗体检测结果 见表1。
表1 3组IgG-AChRAb亚型抗体检测结果(
±s)
例数
IgG-AChRAb亚型抗体
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
, 百拇医药
MG组
43
0.0782±0.0279
0.1830±0.1609*
0.0522±0.0140*
0.0895±0.0951
临床对照组
25
0.0815±0.0227
0.0798±0.0171
0.0766±0.0233
, 百拇医药
0.0721±0.0284
正常对照组
20
0.0773±0.0163
0.0719±0.0140
0.0808±0.0250
0.0737±0.0131
与正常对照组比较*P<0.05
结果表明：正常对照组 和临床对照组组内4种亚型抗体检测结果方差分析无显著性差别(P>0.05)，而MG组组内 4种亚型抗体有极显著性差别(P<0.01)；3组之间相互比较发现，IgG1和IgG4两种 亚型抗体组间均无显著性差别(P>0.05)，而IgG2和IgG3两种亚型抗体组间均有显 著性差别(P<0.05)，其中MG组中IgG2亚型抗体显著高于其它两组，IgG3亚型抗体 则是显著低于其它两组，在正常对照组与临床对照组间无显著性差别(P>0.05)。
, 百拇医药
2.2 MG组临床各型IgG-AChRAb亚型抗体检测结果 见表2。各型之间均无显著差别(P >0.05)。
表2 MG组临床各型间IgG-AChRAb亚型抗体检测结果(±s)
例数
IgG-AChRAb亚型抗体
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
Ⅰ型
, 百拇医药
20
0.0725±0.0259
0.1786±0.1597
0.0508±0.0127
0.0874±0.0838
Ⅱa+Ⅱb型
16
0.0823±0.0302
0.1854±0.1681
0.0533±0.0139
0.0907±0.0981
, http://www.100md.com
Ⅲ+Ⅳ+Ⅴ型
7
0.0851±0.0318
0.1901±0.1732
0.0537±0.0151
0.0928±0.1082
3 讨 论 MG病人AChRAb的特性是多克隆性或异质性。这主要体现在下列几个方面：(1)分型：AChRA b极大部分是IgG型抗体，其在MG病人血清中检出阳性率为63%～93%[2～6]，但也存 在其它类型的抗体。Lefvert[5]发现2例MG病人在疾病的早期IgG型抗体出现之前有 IgM型抗体存在；Tindall[7]发现92例MG中有5例IgM型抗体阳性，48例中有2例IgA 型抗体阳性，但同时都伴有IgG型抗体存在；乔健等[8]报道96例MG检出IgM型抗体 阳性18例。(2)IgG亚型：根据IgG分子主链(r链)抗原性差别及二硫键数目和位置的不同可 将IgG分为IgG1～44个亚型，它们在正常人体 中含量分别为65%、23%、8%和4%左右。在MG的各个病例中AChRab也是由不同的IgG亚型组 成的[7，9，10]，其中以IgG1和IgG2占优势。有研究表明IgG亚型与全身型M G病人的各种 临床状态以及与不同的AChR来源之间不存在相关性，但在眼肌型MG中IgG3亚型抗体显著增 高 ，且这些抗体对从眼肌和正常肢体肌来源的AChR的反应较去神经来源的AChR明显[11] 。在日 本人MG患者IgG亚型分析中[12]，发现极大部分为IgG1抗体，而IgG2和IgG3 活性很低。(3) 抗α-BGT(α-Bungarotoxin)结合位点抗体：Whiting等[13]应用含有饱和α-BG T的人AChR亲和层析柱分离出抗 α-BGT结合位点抗体和结合在AChR其它位点的抗体，并发现分离到的2例病人的抗α-BGT 结 合位点抗体全部为IgG3型抗体。(4)单克隆抗体(mAbs)：应用杂交瘤技术已能产生对人ACh R的mAbs[14]，应用抗主要免疫源区域的mAbs直接注入动物可诱导出实验性自身免 疫性MG[15]。
, 百拇医药
本研究结果表明，中国人MG患者AChRAb亚型分布明显以IgG2为主，IgG1和IgG4活性一 般，而 IgG3活性明显低于正常，这与国外及日本人的报道不完全一致，可能提示MG的AChRab亚 型 分布存在有种族差异。4种亚型抗体在MG各临床分型间无明显差异，说明IgG亚型抗体与MG 的临床表现无明显的相关性，与国外报道结果相一致。至于IgG3活性明显降低，可能提示 少数MG患者存在IgG3量的不足或缺乏。
参 考 文 献
1，Lindstrom JM,Lambert EH.Content of acetylcholine receptor and antibodies bound to receptor in myasthenia gravis,experimental autoimmune myasthenia gravis,and Eaton-Lambert syndrome.Neurology, 1978,28:130
, 百拇医药
2，Lindstrom JM,Seybold ME,Lennon VA,et al.Antibody to acetylcholine receptor in myasthenia gravis,prevalence,clinical correlates,and diagnostic value.Neurology, 1976,26:1054
3，Hinman CL,Hudson RA,Burek CL,et al. An enzymelinked immunosorbent assay for an tibody against acetylcholine receptor.J Neurosci Methods,1983,9:141
4，Hinman CL,Ernstoff RM,Montgomery IN,et al.Clinical correlates of enzymeimmunoa ssay versus radioimmumoassay measurements of antibody against acetylcholine rece ptor in patients with myasthenia gravis.J Neurol Sci,1986,75:305
, 百拇医药
5，Lefvert AK,Bergstrom K,Matell G,et al.Determination of acetylcholine receptor antibody in myasthenia gravis:Clinical usefulness and pathogenic implications.J Neurol Neurosurg Psychiat,1978,41:394
6，Vincent A,Newsom-Davis J.Acetylcholine receptor antibody as a diagnostic test for myasthenia gravis.Results in 153 validated cases and 2969 diagnostic assays .J Neurol Newrosury Psychiat,1985,48:1246
7，Tindall RSA.Humoral immunity in myasthenia gravis biochemical characteriaztion f acguired anti-receptor antibodies and clinical correlation.Ann Neurol,1981, 10:437
, 百拇医药
8，乔健，李继民，肖保国,等.重症肌无力病人血液中IgM型乙酰胆碱受体，突触前膜抗体检测 及临床意义.临床神经病学杂志,1998;11:87
9，Vincent A,Newsom-Davis J,et al.Anti-acetylcholine receptor antibodies.J Neur ol Nourosurg Psychiat,1980,43:590
10，Lefvert AK.The human acetylcholine receptor antibody:studies of kinetic prope rties and the reaction with antidiotypic antibodies.Ann NY Acad Sci,1981,377:125
11，Vincent A,Newsom-Davis J.Acetylcholine receptor antibody characteristics in myasthenia gravis. I Patients with generalized myasthenia or disease restricted to ocular muscles.Clin Exp Immunol,1982,49:257
, http://www.100md.com
12，Ohta M, Tada H, Kanaoka H, et al, Heterogeneity of anti-acetylcholine recept or antibody. Adv Neurol Sci,1986,30:106
13，Whiting PJ.Acetylcholine receptor antibody characteristics in myasthenia grav is . Fraction of α-bungarotoxin binding site antibodies and their relationship to IgG subclass. J Neuroimmunol,1983,5:1
14，Garabedian B,Morel E. Monoclonal antibodies against the human acetylcholine r eceptor. Biochem Biophys Res Commun,1983,113:1
15，Tzartos SJ.Passive transfer of experimental autoimmune myasthenia gravis by m onoclonal antibodies to the main immunogenic region of the acetylcholine recepto r.J Neuroimmunol,1987,15:18
收稿2000-05-18
修回2000-06-20, 百拇医药
单位：李继民(南京医科大学附属脑科医院神经内科 210029)；刘道宽 吕传真 蒋雨平 肖保国 乔健(上海医科大学华山医院神经病学研究所)
关键词：重症肌无力；乙酰胆硷受体抗体；IgG亚型
临床神经病学杂志000502 【摘要】 目的 探讨重症肌无力(MG)患者血清IgG-乙酰胆硷受体抗体(AChRAb)亚型的分布规律及其临床意 义。方法 采用ABC-ELISA法检测43例MG组和25例临床对照组、20例正常对照组血清中IgG-AChRAb亚 型IgG1-4。结果 MG组与两对照组相比IgG1和IgG4亚型抗体无显著差别，IgG2亚型抗体显著升高(P <0.05)，IgG3亚型抗体显著降低(P<0.05)；MG组各临床类型间各亚型抗体无显著 差别。结论 IgG-AChRAb亚型以IgG2活性为主，但未显示与MG临床类型有关。
, 百拇医药
Study on the subclasses of IgG-AChR antibodies in serum in patients with myasth enia g ravis
Li Jimin Liu Daokuan Lü Chuanzhen et al
(Department of Neurology, Brain Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing 210029)
【Abstract】 Objective To investigate the role and its clinical signific ance on the subclasses of IgG-AChR ant ibodies in serum in patients with myasthenia gravis.Methods ABC-ELISA technique was used to detect the subclasses IgG1-4 of IgG-AChR antibodies in sera from 43 patients w ith MG, 25 clinical controls and 20 normal controls.Results The re was no obvious difference on IgG1 and IgG4 subclass antibodies b etween MG group and two control groups.IgG2 subclass antibodies increased significantly (P<0.05), IgG3 sub class antibodies decreased significantly(P<0.05).There were no di fferences the various subclass antibodies among various clinical types in MG gro up.Conclusion IgG-AChR antibodies subclasses might take IgG2 activity as the dominant facto r,but there was no any correlation with the clinical types of the disease.
, 百拇医药
【Key words】 Myasthenia gravis Acetylcholine receptor antibody IgG subclass
重症肌无力(MG)是目前论证最清楚的自身免疫性疾病。乙酰胆硷受体抗体(AChRAb)被认为是 MG主要的致病因子。IgG型AChRAb是AChRAb的主要抗体，IgG是由IgG1-44种亚型组 成，故有必要进一步研究IgG-AChRAb亚型抗体。我们采用ABC-ELISA法检测了43例MG患者 血清中IgG-AChRAb亚型，以探讨其在MG中的分布规律及在MG发病机理中的意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 MG组43例，男26例，女17例，年龄5～63岁，平均33.8岁。依据病史、体征 和疲劳试验、新斯的明试验诊断，部分病人经肌电图、胸腺影像学检查、AChRAb检测进一步 证实。根据Osserman法分型：Ⅰ型20例，Ⅱa型11例，Ⅱb型5例，Ⅲ型4例，Ⅳ型2例和Ⅴ型1 例。临床对照组25例，男11例，女14例，年龄16～65岁，平均35.8岁，均为同期住院病人 ，多发性硬化17例，癫痫7例，多发性肌炎1例。正常对照组20名，男8名，女12名，年龄22 ～43岁，平均34岁，均为正常献血员。
, 百拇医药
1.2 方法 均取外周静脉血3 ml，分离血清，-30℃保存备用。IgG-AChRAb亚型抗体测定 采用ABC-ELISA法。首先将5 μg/ml的α-银环蛇毒素(广西医学院蛇毒研究所提供)按 每孔100 μl 包板(聚苯乙烯微量反应板，上海塑料三厂生产)，37℃，2小时，加10%小牛血 清封 板，4℃过夜；加1:25稀释肌肉粗提液(按Lindstnom法[1]改良提取)，37℃，2小时 ；加1:10稀释待测血清，37℃，1小时；加1:400鼠抗人单克隆IgG1-4(Sigma公司生 产)，37℃，1小时；加1:1000辣根过氧化物酶联羊抗鼠IgG(Sigma公司生产)，37℃，1小时 ，加邻苯二胺为底物显色，室温5分钟，用4N硫酸终止反应后立即在511酶标仪(上海分析仪 器三厂生产)上比色，波长为429 nm，自动打印结果。直接以实际测得的OD值为各标本的结 果。
1.3 统计学处理 各组检测数据用方差分析进行处理。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 MG组及临床对照组、正常对照组血清IgG-AChRAb亚型抗体检测结果 见表1。
表1 3组IgG-AChRAb亚型抗体检测结果(
±s)例数
IgG-AChRAb亚型抗体
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
, 百拇医药
MG组
43
0.0782±0.0279
0.1830±0.1609*
0.0522±0.0140*
0.0895±0.0951
临床对照组
25
0.0815±0.0227
0.0798±0.0171
0.0766±0.0233
, 百拇医药
0.0721±0.0284
正常对照组
20
0.0773±0.0163
0.0719±0.0140
0.0808±0.0250
0.0737±0.0131
与正常对照组比较*P<0.05
结果表明：正常对照组 和临床对照组组内4种亚型抗体检测结果方差分析无显著性差别(P>0.05)，而MG组组内 4种亚型抗体有极显著性差别(P<0.01)；3组之间相互比较发现，IgG1和IgG4两种 亚型抗体组间均无显著性差别(P>0.05)，而IgG2和IgG3两种亚型抗体组间均有显 著性差别(P<0.05)，其中MG组中IgG2亚型抗体显著高于其它两组，IgG3亚型抗体 则是显著低于其它两组，在正常对照组与临床对照组间无显著性差别(P>0.05)。
, 百拇医药
2.2 MG组临床各型IgG-AChRAb亚型抗体检测结果 见表2。各型之间均无显著差别(P >0.05)。
表2 MG组临床各型间IgG-AChRAb亚型抗体检测结果(
±s)例数
IgG-AChRAb亚型抗体
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
Ⅰ型
, 百拇医药
20
0.0725±0.0259
0.1786±0.1597
0.0508±0.0127
0.0874±0.0838
Ⅱa+Ⅱb型
16
0.0823±0.0302
0.1854±0.1681
0.0533±0.0139
0.0907±0.0981
, http://www.100md.com
Ⅲ+Ⅳ+Ⅴ型
7
0.0851±0.0318
0.1901±0.1732
0.0537±0.0151
0.0928±0.1082
3 讨 论 MG病人AChRAb的特性是多克隆性或异质性。这主要体现在下列几个方面：(1)分型：AChRA b极大部分是IgG型抗体，其在MG病人血清中检出阳性率为63%～93%[2～6]，但也存 在其它类型的抗体。Lefvert[5]发现2例MG病人在疾病的早期IgG型抗体出现之前有 IgM型抗体存在；Tindall[7]发现92例MG中有5例IgM型抗体阳性，48例中有2例IgA 型抗体阳性，但同时都伴有IgG型抗体存在；乔健等[8]报道96例MG检出IgM型抗体 阳性18例。(2)IgG亚型：根据IgG分子主链(r链)抗原性差别及二硫键数目和位置的不同可 将IgG分为IgG1～44个亚型，它们在正常人体 中含量分别为65%、23%、8%和4%左右。在MG的各个病例中AChRab也是由不同的IgG亚型组 成的[7，9，10]，其中以IgG1和IgG2占优势。有研究表明IgG亚型与全身型M G病人的各种 临床状态以及与不同的AChR来源之间不存在相关性，但在眼肌型MG中IgG3亚型抗体显著增 高 ，且这些抗体对从眼肌和正常肢体肌来源的AChR的反应较去神经来源的AChR明显[11] 。在日 本人MG患者IgG亚型分析中[12]，发现极大部分为IgG1抗体，而IgG2和IgG3 活性很低。(3) 抗α-BGT(α-Bungarotoxin)结合位点抗体：Whiting等[13]应用含有饱和α-BG T的人AChR亲和层析柱分离出抗 α-BGT结合位点抗体和结合在AChR其它位点的抗体，并发现分离到的2例病人的抗α-BGT 结 合位点抗体全部为IgG3型抗体。(4)单克隆抗体(mAbs)：应用杂交瘤技术已能产生对人ACh R的mAbs[14]，应用抗主要免疫源区域的mAbs直接注入动物可诱导出实验性自身免 疫性MG[15]。
, 百拇医药
本研究结果表明，中国人MG患者AChRAb亚型分布明显以IgG2为主，IgG1和IgG4活性一 般，而 IgG3活性明显低于正常，这与国外及日本人的报道不完全一致，可能提示MG的AChRab亚 型 分布存在有种族差异。4种亚型抗体在MG各临床分型间无明显差异，说明IgG亚型抗体与MG 的临床表现无明显的相关性，与国外报道结果相一致。至于IgG3活性明显降低，可能提示 少数MG患者存在IgG3量的不足或缺乏。
参 考 文 献
1，Lindstrom JM,Lambert EH.Content of acetylcholine receptor and antibodies bound to receptor in myasthenia gravis,experimental autoimmune myasthenia gravis,and Eaton-Lambert syndrome.Neurology, 1978,28:130
, 百拇医药
2，Lindstrom JM,Seybold ME,Lennon VA,et al.Antibody to acetylcholine receptor in myasthenia gravis,prevalence,clinical correlates,and diagnostic value.Neurology, 1976,26:1054
3，Hinman CL,Hudson RA,Burek CL,et al. An enzymelinked immunosorbent assay for an tibody against acetylcholine receptor.J Neurosci Methods,1983,9:141
4，Hinman CL,Ernstoff RM,Montgomery IN,et al.Clinical correlates of enzymeimmunoa ssay versus radioimmumoassay measurements of antibody against acetylcholine rece ptor in patients with myasthenia gravis.J Neurol Sci,1986,75:305
, 百拇医药
5，Lefvert AK,Bergstrom K,Matell G,et al.Determination of acetylcholine receptor antibody in myasthenia gravis:Clinical usefulness and pathogenic implications.J Neurol Neurosurg Psychiat,1978,41:394
6，Vincent A,Newsom-Davis J.Acetylcholine receptor antibody as a diagnostic test for myasthenia gravis.Results in 153 validated cases and 2969 diagnostic assays .J Neurol Newrosury Psychiat,1985,48:1246
7，Tindall RSA.Humoral immunity in myasthenia gravis biochemical characteriaztion f acguired anti-receptor antibodies and clinical correlation.Ann Neurol,1981, 10:437
, 百拇医药
8，乔健，李继民，肖保国,等.重症肌无力病人血液中IgM型乙酰胆碱受体，突触前膜抗体检测 及临床意义.临床神经病学杂志,1998;11:87
9，Vincent A,Newsom-Davis J,et al.Anti-acetylcholine receptor antibodies.J Neur ol Nourosurg Psychiat,1980,43:590
10，Lefvert AK.The human acetylcholine receptor antibody:studies of kinetic prope rties and the reaction with antidiotypic antibodies.Ann NY Acad Sci,1981,377:125
11，Vincent A,Newsom-Davis J.Acetylcholine receptor antibody characteristics in myasthenia gravis. I Patients with generalized myasthenia or disease restricted to ocular muscles.Clin Exp Immunol,1982,49:257
, http://www.100md.com
12，Ohta M, Tada H, Kanaoka H, et al, Heterogeneity of anti-acetylcholine recept or antibody. Adv Neurol Sci,1986,30:106
13，Whiting PJ.Acetylcholine receptor antibody characteristics in myasthenia grav is . Fraction of α-bungarotoxin binding site antibodies and their relationship to IgG subclass. J Neuroimmunol,1983,5:1
14，Garabedian B,Morel E. Monoclonal antibodies against the human acetylcholine r eceptor. Biochem Biophys Res Commun,1983,113:1
15，Tzartos SJ.Passive transfer of experimental autoimmune myasthenia gravis by m onoclonal antibodies to the main immunogenic region of the acetylcholine recepto r.J Neuroimmunol,1987,15:18
收稿2000-05-18
修回2000-06-20, 百拇医药