脑缺血再灌流后海马区细胞凋亡的研究△
作者：张敬军 陈 青
单位：山东省泰山医学院附属医院微循环研究所，泰安卫校(271000)
关键词：沙土鼠；脑缺血；再灌流；海马；细胞凋亡
中国临床神经科学/990113 摘要 目的：观察脑缺血再灌流后海马区细胞凋亡。方法：钳夹沙土鼠的双侧颈总动脉制造脑缺血模型，应用Tunel法染色。结果：短暂性前脑缺血不同时间再灌流后海马CA1区锥体细胞发生凋亡，CA2、CA3区锥体细胞层、水平层、放射层、分子层及齿状回部位未见细胞凋亡。结论：短暂性脑缺血可导致CA1区锥体细胞凋亡。
细胞凋亡是维持神经系统正常生长发育的重要机制，近年研究表明，凋亡在某些疾病发生中起重要的作用。有研究提出，脑缺血可导致细胞凋亡，但导致细胞凋亡出现的时间、部位、程度及机制还待进一步探讨。本实验用短暂性前脑缺血再灌注沙土鼠模型，用Tunel法染色，观察脑缺血后不同时间再灌流细胞凋亡的发生情况，并对细胞凋亡与迟发性神经元坏死的关系进行了初步探讨。
, 百拇医药
材料和方法
1.实验动物 雄性沙土鼠体重70～80 g(约12周龄)32只，随机分为4组，5 min前脑缺血再灌流2d、3d、4d及假手术对照组，各8只。
2.试剂与仪器 Apoptag试剂盒(美国ONCOR公司)。温差电偶仪TME300(日本unique公司)。
3.脑缺血的制作及海马脑片的制备 1.5%三氟溴氯乙烷吸入麻醉沙土鼠，选择一侧脑区，在前囟前及前囟一侧各2 mm的交叉点，用温差电偶探针垂直进针2 mm，监测脑温并维持在(37 ±0.2)℃。暴露两侧颈总动脉，停止麻醉药至动物清醒，用无损伤的血管夹立即夹闭双侧颈总动脉，5 min后撤夹恢复血流分别存活2d、3d、及4d，假手术对照组8只除不夹闭双侧颈总动脉外，其他步骤同实验组。模型成功标准是：阻断双侧颈总动脉血流后，动物立即出现呼吸加快，肢体痉挛，在10s～1min内昏迷，血流复通后，动物分别在5～10 min苏醒，不合上述标准者弃去不用。动物在戊巴比妥钠麻醉下，经心依次灌注下列溶液：①PBS 50 ml。②4%的多聚甲醛300 ml。取出大脑，脱水透明，石蜡包埋。每只动物取出前囟后1.0～1.3 mm间的连续6张冠状背侧海马切片，片厚5 μm。
, 百拇医药
4.Tunel染色[1] ①二甲苯冲洗2次，每次5 min。②100%乙醇洗2次，每次5 min；95%乙醇洗3 min；70%乙醇洗3 min。③室温下PBS冲洗3次，每次5 min。④蛋白酶K(20 μg/ml)消化，室温孵育20 min。⑤同③。⑥2% H2O2孵育5 min。⑦同③。⑧平衡液(S7100-1)室温孵育20 min；反应液(S7100-2∶S7100-3为1∶2)37℃孵育1 h；停止液(S7100-4：蒸溜水为1∶34)室温孵育20 min。⑨同③。10用过氧化物酶标记抗Digoxigene抗体室温孵化30 min。11同③。120.05%DAB显色、脱水、透明、封片、镜检。空白对照不加TDT酶(S7100-3)，余同上。
结果
实验组均可观察到凋亡细胞——DNA片段末端标记的阳性细胞：细胞皱缩，核染色阳性，核固缩，可见核碎片，单个圆形凋亡小体。脑缺血再灌流2 d，CA1区有少量锥体细胞凋亡；再灌流3d，CA1区锥体细胞凋亡数量达高峰；再灌流4 d，CA1区锥体细胞凋亡开始减少。凋亡细胞都是CA1区锥体细胞，短暂性前脑缺血不同时间再灌流后海马CA1区锥体细胞凋亡数量变化不一，其定量分析结果见表1。CA2、CA3区及齿状回各时间点均未见细胞凋亡。假手术对照组未见细胞凋亡。空白对照结果为阴性。
, 百拇医药
表1 短暂性前脑缺血不同时间再灌流后海马CA1区锥体细胞凋亡(N/mm) 组 别
n
±s
对照组
8
0
缺血再灌流2d
8
13.8±1.7
缺血再灌流3d
8
, 百拇医药 145.6±2.9
缺血再灌流4d
8
38.4±2.1
注：与对照组相比，*P<0.01
讨论
短暂性前脑缺血再灌流2 d就有细胞凋亡发生，再灌流3 d细胞凋亡达高峰，再灌流4 d细胞凋亡开始下降。脑缺血诱发细胞凋亡的机制尚未完全阐明，其可能机制是：脑缺血时兴奋性神经递质谷氨酸从突触前膜释放，作用于突触后膜上的谷氨酸受体，突触后膜去极化达一定程度降低了镁离子对谷氨酸受体的阻断，钙离子通过离子通道进入细胞内，使细胞内钙离子浓度增加，细胞液钙浓度升高被认为是凋亡的始动因素[2]：它激活与凋亡有关的各种酶，激活钙依赖性核酸内切酶使DNA降解[3]导致细胞凋亡。它激活诱生型NOS，引起NO合成增加，高浓度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脱氨基，造成突变和DNA链断裂[4]；NO降低胞浆的pH[5]及抑制蛋白质和核酸的合成[6]；NO还增加p53表达[7]及减少细胞ATP合成[8]，NO的这些细胞毒性可导致细胞凋亡。
, 百拇医药
不同神经细胞对缺血缺氧的敏感性有很大差异，如果在相同缺血、缺氧条件下，脑组织中某一区域的神经细胞易受损害，而邻近区域或其他部位的神经细胞较有耐受性，表现为选择性易损，其机制尚不清楚。本实验结果CA1区锥体细胞最早且最易发生细胞凋亡，虽然人们对这一现象进行了深入的研究，提出了许多假说：包括兴奋性氨基酸毒性、Ca2+超载、自由基损伤、信息传递、基因转录、蛋白质合成等，然而这些假说均不能完全解释CA1区锥体细胞为何选择性易损。我们认为其作用机制可能与下列因素有关：(1)细胞的固有结构、信息传递及胞内代谢存在着明显差异，是不同细胞对缺血耐受性不同的基础原因之一。(2)从排列结构上，CA1区锥体细胞可能更易受到有毒物质的侵袭。(3)CA1区锥体细胞解毒、代偿及修复、复制功能差。
CA1区锥体细胞凋亡为何主要发生于脑缺血再灌流后2～4 d，其机制可能是：细胞凋亡发生过程中需要基因转录和蛋白质的合成，细胞死亡前Ca2+依赖性核酸内切酶将DNA切断形成多核苷酸片段，电泳可见DNA的梯形条带，形态学表现为染色质浓缩和核转移位，整个过程需2～4 d时间。文献报道：脑缺血再灌流后海马CA1区锥体细胞最早且最易发生迟发性神经元坏死(Delayed neuronal death,DND)，且主要发生于脑缺血再灌流后2～4d，机制未明。结合本实验结果CA1区锥体细胞选择性易发生细胞凋亡与选择性易发生DND时间一致，如果其内容一致，这些理论解释了细胞凋亡或迟发性神经元坏死为何发生于脑缺血再灌流后2～4 d这一现象。
, 百拇医药
△山东省自然科学基金资助课题(Y98C19048)
参考文献
[1].Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119:493.
[2].Takei,Endo Y.Ca2+ionophore-induced apoptosis on cultured embryonic rat cortical neurons.Brain Res,1994,652:65.
[3].Evans VG.Multiple pathways to apoptosis.Cell Biol Int.1993,17:461
, 百拇医药
[4].Nguyen T,Brunson CL,Crespi BW, et al. DNA damage and mutation in human cells esposed to nitric oxide in vitro.Proc Natl Acadsci USA.1992,89:3030.
[5].Xie K,Dong Z,Fidler IJ.Activation of nitric oxide synthase gene for inhibition of cancer metastasis.J Leukoc Biol,1996,59:797.
[6].Lepoivre M,Chenais B,Yapo A, et al. Alterations of ribonucleotide reductase activity following induction of the nitrite-generating pathway in adenocarcinoma cells.J Biol Chem.1990,265:14143.
, 百拇医药
[7].Messmer UK,Lapetina EG,Brune B.Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages in antagonized by protein kinase C-and protein kinase A-activating compounds.Mol Pharmacol.1995,47:757.
[8].Albina TE,Cui S, Mateo RB, et al.Nitric oxide-mediated apoptosis inmurine peritoneal macrophages.J Immunol,1993,150:5080.
(1998年9月28日收稿), 百拇医药
单位：山东省泰山医学院附属医院微循环研究所，泰安卫校(271000)
关键词：沙土鼠；脑缺血；再灌流；海马；细胞凋亡
中国临床神经科学/990113 摘要 目的：观察脑缺血再灌流后海马区细胞凋亡。方法：钳夹沙土鼠的双侧颈总动脉制造脑缺血模型，应用Tunel法染色。结果：短暂性前脑缺血不同时间再灌流后海马CA1区锥体细胞发生凋亡，CA2、CA3区锥体细胞层、水平层、放射层、分子层及齿状回部位未见细胞凋亡。结论：短暂性脑缺血可导致CA1区锥体细胞凋亡。
细胞凋亡是维持神经系统正常生长发育的重要机制，近年研究表明，凋亡在某些疾病发生中起重要的作用。有研究提出，脑缺血可导致细胞凋亡，但导致细胞凋亡出现的时间、部位、程度及机制还待进一步探讨。本实验用短暂性前脑缺血再灌注沙土鼠模型，用Tunel法染色，观察脑缺血后不同时间再灌流细胞凋亡的发生情况，并对细胞凋亡与迟发性神经元坏死的关系进行了初步探讨。
, 百拇医药
材料和方法
1.实验动物 雄性沙土鼠体重70～80 g(约12周龄)32只，随机分为4组，5 min前脑缺血再灌流2d、3d、4d及假手术对照组，各8只。
2.试剂与仪器 Apoptag试剂盒(美国ONCOR公司)。温差电偶仪TME300(日本unique公司)。
3.脑缺血的制作及海马脑片的制备 1.5%三氟溴氯乙烷吸入麻醉沙土鼠，选择一侧脑区，在前囟前及前囟一侧各2 mm的交叉点，用温差电偶探针垂直进针2 mm，监测脑温并维持在(37 ±0.2)℃。暴露两侧颈总动脉，停止麻醉药至动物清醒，用无损伤的血管夹立即夹闭双侧颈总动脉，5 min后撤夹恢复血流分别存活2d、3d、及4d，假手术对照组8只除不夹闭双侧颈总动脉外，其他步骤同实验组。模型成功标准是：阻断双侧颈总动脉血流后，动物立即出现呼吸加快，肢体痉挛，在10s～1min内昏迷，血流复通后，动物分别在5～10 min苏醒，不合上述标准者弃去不用。动物在戊巴比妥钠麻醉下，经心依次灌注下列溶液：①PBS 50 ml。②4%的多聚甲醛300 ml。取出大脑，脱水透明，石蜡包埋。每只动物取出前囟后1.0～1.3 mm间的连续6张冠状背侧海马切片，片厚5 μm。
, 百拇医药
4.Tunel染色[1] ①二甲苯冲洗2次，每次5 min。②100%乙醇洗2次，每次5 min；95%乙醇洗3 min；70%乙醇洗3 min。③室温下PBS冲洗3次，每次5 min。④蛋白酶K(20 μg/ml)消化，室温孵育20 min。⑤同③。⑥2% H2O2孵育5 min。⑦同③。⑧平衡液(S7100-1)室温孵育20 min；反应液(S7100-2∶S7100-3为1∶2)37℃孵育1 h；停止液(S7100-4：蒸溜水为1∶34)室温孵育20 min。⑨同③。10用过氧化物酶标记抗Digoxigene抗体室温孵化30 min。11同③。120.05%DAB显色、脱水、透明、封片、镜检。空白对照不加TDT酶(S7100-3)，余同上。
结果
实验组均可观察到凋亡细胞——DNA片段末端标记的阳性细胞：细胞皱缩，核染色阳性，核固缩，可见核碎片，单个圆形凋亡小体。脑缺血再灌流2 d，CA1区有少量锥体细胞凋亡；再灌流3d，CA1区锥体细胞凋亡数量达高峰；再灌流4 d，CA1区锥体细胞凋亡开始减少。凋亡细胞都是CA1区锥体细胞，短暂性前脑缺血不同时间再灌流后海马CA1区锥体细胞凋亡数量变化不一，其定量分析结果见表1。CA2、CA3区及齿状回各时间点均未见细胞凋亡。假手术对照组未见细胞凋亡。空白对照结果为阴性。
, 百拇医药
表1 短暂性前脑缺血不同时间再灌流后海马CA1区锥体细胞凋亡(N/mm) 组 别
n
±s对照组
8
0
缺血再灌流2d
8
13.8±1.7
缺血再灌流3d
8
, 百拇医药 145.6±2.9
缺血再灌流4d
8
38.4±2.1
注：与对照组相比，*P<0.01
讨论
短暂性前脑缺血再灌流2 d就有细胞凋亡发生，再灌流3 d细胞凋亡达高峰，再灌流4 d细胞凋亡开始下降。脑缺血诱发细胞凋亡的机制尚未完全阐明，其可能机制是：脑缺血时兴奋性神经递质谷氨酸从突触前膜释放，作用于突触后膜上的谷氨酸受体，突触后膜去极化达一定程度降低了镁离子对谷氨酸受体的阻断，钙离子通过离子通道进入细胞内，使细胞内钙离子浓度增加，细胞液钙浓度升高被认为是凋亡的始动因素[2]：它激活与凋亡有关的各种酶，激活钙依赖性核酸内切酶使DNA降解[3]导致细胞凋亡。它激活诱生型NOS，引起NO合成增加，高浓度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脱氨基，造成突变和DNA链断裂[4]；NO降低胞浆的pH[5]及抑制蛋白质和核酸的合成[6]；NO还增加p53表达[7]及减少细胞ATP合成[8]，NO的这些细胞毒性可导致细胞凋亡。
, 百拇医药
不同神经细胞对缺血缺氧的敏感性有很大差异，如果在相同缺血、缺氧条件下，脑组织中某一区域的神经细胞易受损害，而邻近区域或其他部位的神经细胞较有耐受性，表现为选择性易损，其机制尚不清楚。本实验结果CA1区锥体细胞最早且最易发生细胞凋亡，虽然人们对这一现象进行了深入的研究，提出了许多假说：包括兴奋性氨基酸毒性、Ca2+超载、自由基损伤、信息传递、基因转录、蛋白质合成等，然而这些假说均不能完全解释CA1区锥体细胞为何选择性易损。我们认为其作用机制可能与下列因素有关：(1)细胞的固有结构、信息传递及胞内代谢存在着明显差异，是不同细胞对缺血耐受性不同的基础原因之一。(2)从排列结构上，CA1区锥体细胞可能更易受到有毒物质的侵袭。(3)CA1区锥体细胞解毒、代偿及修复、复制功能差。
CA1区锥体细胞凋亡为何主要发生于脑缺血再灌流后2～4 d，其机制可能是：细胞凋亡发生过程中需要基因转录和蛋白质的合成，细胞死亡前Ca2+依赖性核酸内切酶将DNA切断形成多核苷酸片段，电泳可见DNA的梯形条带，形态学表现为染色质浓缩和核转移位，整个过程需2～4 d时间。文献报道：脑缺血再灌流后海马CA1区锥体细胞最早且最易发生迟发性神经元坏死(Delayed neuronal death,DND)，且主要发生于脑缺血再灌流后2～4d，机制未明。结合本实验结果CA1区锥体细胞选择性易发生细胞凋亡与选择性易发生DND时间一致，如果其内容一致，这些理论解释了细胞凋亡或迟发性神经元坏死为何发生于脑缺血再灌流后2～4 d这一现象。
, 百拇医药
△山东省自然科学基金资助课题(Y98C19048)
参考文献
[1].Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119:493.
[2].Takei,Endo Y.Ca2+ionophore-induced apoptosis on cultured embryonic rat cortical neurons.Brain Res,1994,652:65.
[3].Evans VG.Multiple pathways to apoptosis.Cell Biol Int.1993,17:461
, 百拇医药
[4].Nguyen T,Brunson CL,Crespi BW, et al. DNA damage and mutation in human cells esposed to nitric oxide in vitro.Proc Natl Acadsci USA.1992,89:3030.
[5].Xie K,Dong Z,Fidler IJ.Activation of nitric oxide synthase gene for inhibition of cancer metastasis.J Leukoc Biol,1996,59:797.
[6].Lepoivre M,Chenais B,Yapo A, et al. Alterations of ribonucleotide reductase activity following induction of the nitrite-generating pathway in adenocarcinoma cells.J Biol Chem.1990,265:14143.
, 百拇医药
[7].Messmer UK,Lapetina EG,Brune B.Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages in antagonized by protein kinase C-and protein kinase A-activating compounds.Mol Pharmacol.1995,47:757.
[8].Albina TE,Cui S, Mateo RB, et al.Nitric oxide-mediated apoptosis inmurine peritoneal macrophages.J Immunol,1993,150:5080.
(1998年9月28日收稿), 百拇医药