重组腺病毒介导HSV-TK基因对胶质瘤细胞的生长抑制
作者：史国利 房 欣 王金环 冯宇新 罗 勇 陈德风
单位：南开大学分子生物学研究所分子遗传室(300071)
关键词：重组腺病毒；HSV-TK基因；更昔洛韦(GCV)；胶质母细胞瘤细胞系TJ905
中国临床神经科学/990103摘要 本文构建了带有HSV-TK基因的腺病毒包装质粒pACCMVTK，并获得重组腺病毒AdCMVTK，用其感染胶质母细胞瘤细胞系TJ905，研究了HSV-TK/GCV系统对该细胞系的生长影响。结果发现该系统对胶质母细胞瘤细胞系TJ905生长有明显的抑制作用，以100 MOI(重复感染率)的病毒剂量感染细胞，GCV半数抑制浓度IC50仅为5 μmol，同时发现HSV-TK/GCV系统对TJ905细胞系有明显的旁观效应。表明该系统有治疗胶质瘤的应用前景。
The Growth Inhibition of Glioma Cell
, 百拇医药
by Adenovirus-mediated HSV-TK Gene
Shi Guoli,Fang Xin,Wang Jinhuman,Feng Yuxing,Luo Yong,Chen Defeng
Insititute for Molecular Biology,Nankai University,Tianjin 300071
The plasmid pACCMVTK that expresses simple virus thymidine kinase (HSV-TK) gene was constructed,and recombinant adnovirus AdCMVTK was gained. Glioblastoma cells TJ905 were infected by AdCMVTK.The effect of HSV-TK/GCV system to growth of glioma cell was observed.The results showed HSV-TK/GCV can inhibit the growth of TJ905 cells efficiently,the IC50 was 5 μM when 100 MOI(multipicity of infection)recombinant adenovirus AdCMVTK infected TJ905 cells.Otherwise,a strong “bystander effect” of HSV-TK/GCV system was noted in tumor cell lines.The study indicated that AdCMVTK/GCV system may be used in treatment of glioma in the future.
, 百拇医药
Key Words Recombinant Adenovirus HSV-TK gene GCV Glioblastoma cell TJ905
人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。目前的常规治疗预后不良。近年来发展起来的基因治疗给胶质瘤的治疗提供了可能。国内已有少数单位构建并在临床应用了携带HSV-TK基因的逆转录病毒载体，该载体的优点是能将病毒基因组永久地插入受其转染的细胞染色体中，但同时也有可能引起插入突变，且逆转录病毒滴度低，感染宿主的范围小。为寻求更安全有效的方法，本文构建了携带自杀基因的腺病毒载体，探讨了其抑瘤作用，为临床应用提供参考。
材料和方法
TJ905神经胶质母细胞瘤细胞系为天津医科大学神经病研究所神经肿瘤室浦佩玉教授惠赠，293细胞为美国阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。质粒pACCMVplpA，pBluescriptⅡ-TK及pJM17为美国阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。
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pACCMVTK质粒的构建参照文献[1，2]及《分子克隆》[3]，将pBluescriptⅡ-TK中HSV-TK插入到pACCMVplpA质粒的多克隆位点而成。细胞用含10%小牛血清的高糖DMEM(BRL)培养基培养。采取磷酸钙沉淀法将pACCMVTK与pJM17共转染293细胞，获得重组腺病毒。转染后8～10 d出现病毒空斑，筛选病毒克隆在293细胞中扩增培养，提取病毒DNA。采用PCR方法鉴定重组病毒中HSV-TK基因，HSV1型TK基因的特异引物序列如下：5′端引物序列为5′CACAACACCGCCTCGACCAG3′，3′端引物序列为5′GCCAGGTCAAGCCGCTCGCC-3′。两引物之间的碱基对为382 bp，PCR的反应体系为30 μl，反应条件为95℃ 40 s，72 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，30个循环，产物于1%琼脂糖凝胶电泳。
TJ905细胞按1×104细胞/孔接种于24孔板，每个数据重复3个孔。当细胞生长到融合度达80%时，实验组以100 MOI(重复感染率，multiplicity of infection)的病毒剂量感染细胞12 h，吸出病毒液，换入新鲜培养基，培养24 h后加入不同浓度的GCV继续培养5 d，细胞计数；未加药组细胞处理同试验组，换液后不加GCV；GCV对照组细胞不用病毒感染，换液24 h后加入不同浓度的GCV；另外以不经病毒和GCV处理的一组细胞为空白对照组。将各组的细胞数与空白对照组细胞数相比，得出细胞存活率。将感染病毒和未感染病毒的细胞按1∶0、1∶1、1∶4、1∶9、1∶19及0∶1比例接种于24孔板，混合培养24 h，每孔加入终浓度为500 μmol/L GCV，隔日换液培养5 d，细胞计数，测定旁观效应。
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结果
1、pACCMVTK质粒构建
XbaI,Hind Ⅲ双酶切pBluescriptⅡTK，低熔点琼脂糖电泳回收1.8 kb HSVTK基因片段，插入pACCMVplpA质粒的Xbal，HindⅢ多克隆位点，构建pACCMVTK(图1)。质粒酶切鉴定图谱见图2所示。
图1 pACCMVTK的构建路线
图2 pACCMVTK酶切鉴定
2.重组腺病毒的获得与鉴定
pJM17与pACCMVTK用磷酸钙共沉淀法转染293细胞，pJM17是一被替换插入4.3 kb外源片段环状腺病毒基因组DNA，它提供除腺病毒E1区的主要腺病毒基因，利用同源重组可获得表达TK基因的重组腺病毒。提取病毒DNA，PCR扩增得到380 bp左右的片段，说明得到AdCMVTK(图3)。293细胞空斑法测得AdCMVTK，滴度为1.1×108pfu/ml(plaque forming unit,空斑形成单位)左右。
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1.PACCMVTK DNA为模板的扩增结果
2.AdCMVTK DNA为模板的扩增结果
3.λDNA/Hind Ⅲ
图3 AdCMVTK的PCR鉴定
3.GCV对感染AdCMVTK的TJ905细胞生长的影响
实验表明，100MOI病毒粒子对TJ905细胞生长无明显影响。用100MOI AdCMVTK感染细胞，加入不同浓度GCV培养6d，从图4可看出其对细胞生长抑制明显，半数抑制浓度约为5 μmol。
图4 GCV对感染与未感染AdCMVTK的TJ905细胞生长的影响
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4.旁观效应
用同样浓度GCV药物处理按不同比例混合培养的感染和非感染细胞，细胞存活率的测定结果表明，按1∶19比例混合培养5 d时，细胞只存活10%，而按1∶1，1∶9比例接种的细胞则大部分死亡，显示了很强的旁观效应，见图5。
图5 感染AdCMVTK的TJ905细胞的旁观效应
讨论
HSVTK基因是单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因，该酶底物特异性不强，可催化核苷类似物无环鸟苷(GCV)磷酸化，使之可以在DNA复制过程掺入DNA链，阻碍DNA复制，抑制细胞分裂，导致细胞在GCV存在时发生凋亡。与之相邻不表达TK基因的细胞也产生凋亡，称为“旁观效应”[4]。重组腺病毒载体比逆转录病毒载体更具安全性，能感染不同组织，滴度高，且能感染分裂缓慢的细胞[1，5]。本文构建了AdCMVTK，并用100个重组腺病毒/细胞的低剂量感染TJ905细胞系，24 h后应用 GCV治疗，细胞的生长受到明显的抑制。尽管有人[1]在其他肿瘤细胞系实验过高剂量的病毒如500～2 000个重组腺病毒/细胞具有非常满意的效果，但考虑到体内只能采取局部注射，病毒会从注射部位向周围扩散而形成浓度梯度，边缘处的浓度是观察重组腺病毒赋予肿瘤细胞对GCV药物敏感性的最佳点，因而使用最低有效剂量，得到的数据对临床治疗来讲最具参考价值。GCV对于未感染重组腺病毒的瘤细胞，即使浓度达到100 μmol/L仍无明显影响，但对于感染过重组腺病毒的瘤细胞，IC50仅为5 μmol，随着剂量的增加，效果更明显。
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从实验结果还可看出，GCV药物作用后，感染AdCMV-TK重组腺病毒的TJ905细胞产生的旁观效应非常明显。这种旁观效应增强了AdCMV-TK/GCV系统治疗胶质瘤的可行性，提高了此系统杀伤肿瘤细胞的效率。
AdCMV-TK/GCV系统治疗肿瘤的不足在于缺乏靶向性。另外，腺病毒衣壳五邻体蛋白造成的细胞毒副作用在动物体内也会产生严重后果，有报道1.5×109 pfu病毒粒子与GCV共同作用引起狒狒死亡[6]，因此必须严格控制实验中病毒浓度。
参考文献
[1].Smythe WR, et al. Use of recombinant adenovirus of transfering the herpes simplex virus thymidine kinese (HSVtk) gene to thoracic neoplasms: an effective in vitroing drug sensitization system.Cancer Res.1994, 54:2055.
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[2].Englehardt JF, et al. Direct gene transfer of human CFIR into human bronchial epithelia of xenografts with E1-deleted adenoviruses.Nature Genet,1993,4:27.
[3].Sambrook J, et al. 分子克隆.第二版.北京：科学出版社，1992：16.
[4].Hamel W, et al. Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-mediated apoptotic death of bystander cells.Cancer Res.1996,56:2607.
[5].Ross C, et al. Gene therapy in the United States:a five year status report.Human Gene Therapy,1996,7:1781.
[6].Goodman JC, et al. Adenoviral-mediated thymidine kinase gene transfer into the primate brain followed by systemic ganciclovir pathologic,radiologic and molecular studies.Human Gene Therapy.1996,7:1241.
(1998年9月15日收稿 1998年12月25日修回), 百拇医药
单位：南开大学分子生物学研究所分子遗传室(300071)
关键词：重组腺病毒；HSV-TK基因；更昔洛韦(GCV)；胶质母细胞瘤细胞系TJ905
中国临床神经科学/990103摘要 本文构建了带有HSV-TK基因的腺病毒包装质粒pACCMVTK，并获得重组腺病毒AdCMVTK，用其感染胶质母细胞瘤细胞系TJ905，研究了HSV-TK/GCV系统对该细胞系的生长影响。结果发现该系统对胶质母细胞瘤细胞系TJ905生长有明显的抑制作用，以100 MOI(重复感染率)的病毒剂量感染细胞，GCV半数抑制浓度IC50仅为5 μmol，同时发现HSV-TK/GCV系统对TJ905细胞系有明显的旁观效应。表明该系统有治疗胶质瘤的应用前景。
The Growth Inhibition of Glioma Cell
, 百拇医药
by Adenovirus-mediated HSV-TK Gene
Shi Guoli,Fang Xin,Wang Jinhuman,Feng Yuxing,Luo Yong,Chen Defeng
Insititute for Molecular Biology,Nankai University,Tianjin 300071
The plasmid pACCMVTK that expresses simple virus thymidine kinase (HSV-TK) gene was constructed,and recombinant adnovirus AdCMVTK was gained. Glioblastoma cells TJ905 were infected by AdCMVTK.The effect of HSV-TK/GCV system to growth of glioma cell was observed.The results showed HSV-TK/GCV can inhibit the growth of TJ905 cells efficiently,the IC50 was 5 μM when 100 MOI(multipicity of infection)recombinant adenovirus AdCMVTK infected TJ905 cells.Otherwise,a strong “bystander effect” of HSV-TK/GCV system was noted in tumor cell lines.The study indicated that AdCMVTK/GCV system may be used in treatment of glioma in the future.
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Key Words Recombinant Adenovirus HSV-TK gene GCV Glioblastoma cell TJ905
人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。目前的常规治疗预后不良。近年来发展起来的基因治疗给胶质瘤的治疗提供了可能。国内已有少数单位构建并在临床应用了携带HSV-TK基因的逆转录病毒载体，该载体的优点是能将病毒基因组永久地插入受其转染的细胞染色体中，但同时也有可能引起插入突变，且逆转录病毒滴度低，感染宿主的范围小。为寻求更安全有效的方法，本文构建了携带自杀基因的腺病毒载体，探讨了其抑瘤作用，为临床应用提供参考。
材料和方法
TJ905神经胶质母细胞瘤细胞系为天津医科大学神经病研究所神经肿瘤室浦佩玉教授惠赠，293细胞为美国阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。质粒pACCMVplpA，pBluescriptⅡ-TK及pJM17为美国阿拉巴马大学唐代驹博士惠赠。
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pACCMVTK质粒的构建参照文献[1，2]及《分子克隆》[3]，将pBluescriptⅡ-TK中HSV-TK插入到pACCMVplpA质粒的多克隆位点而成。细胞用含10%小牛血清的高糖DMEM(BRL)培养基培养。采取磷酸钙沉淀法将pACCMVTK与pJM17共转染293细胞，获得重组腺病毒。转染后8～10 d出现病毒空斑，筛选病毒克隆在293细胞中扩增培养，提取病毒DNA。采用PCR方法鉴定重组病毒中HSV-TK基因，HSV1型TK基因的特异引物序列如下：5′端引物序列为5′CACAACACCGCCTCGACCAG3′，3′端引物序列为5′GCCAGGTCAAGCCGCTCGCC-3′。两引物之间的碱基对为382 bp，PCR的反应体系为30 μl，反应条件为95℃ 40 s，72 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，30个循环，产物于1%琼脂糖凝胶电泳。
TJ905细胞按1×104细胞/孔接种于24孔板，每个数据重复3个孔。当细胞生长到融合度达80%时，实验组以100 MOI(重复感染率，multiplicity of infection)的病毒剂量感染细胞12 h，吸出病毒液，换入新鲜培养基，培养24 h后加入不同浓度的GCV继续培养5 d，细胞计数；未加药组细胞处理同试验组，换液后不加GCV；GCV对照组细胞不用病毒感染，换液24 h后加入不同浓度的GCV；另外以不经病毒和GCV处理的一组细胞为空白对照组。将各组的细胞数与空白对照组细胞数相比，得出细胞存活率。将感染病毒和未感染病毒的细胞按1∶0、1∶1、1∶4、1∶9、1∶19及0∶1比例接种于24孔板，混合培养24 h，每孔加入终浓度为500 μmol/L GCV，隔日换液培养5 d，细胞计数，测定旁观效应。
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结果
1、pACCMVTK质粒构建
XbaI,Hind Ⅲ双酶切pBluescriptⅡTK，低熔点琼脂糖电泳回收1.8 kb HSVTK基因片段，插入pACCMVplpA质粒的Xbal，HindⅢ多克隆位点，构建pACCMVTK(图1)。质粒酶切鉴定图谱见图2所示。
图1 pACCMVTK的构建路线
图2 pACCMVTK酶切鉴定
2.重组腺病毒的获得与鉴定
pJM17与pACCMVTK用磷酸钙共沉淀法转染293细胞，pJM17是一被替换插入4.3 kb外源片段环状腺病毒基因组DNA，它提供除腺病毒E1区的主要腺病毒基因，利用同源重组可获得表达TK基因的重组腺病毒。提取病毒DNA，PCR扩增得到380 bp左右的片段，说明得到AdCMVTK(图3)。293细胞空斑法测得AdCMVTK，滴度为1.1×108pfu/ml(plaque forming unit,空斑形成单位)左右。
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1.PACCMVTK DNA为模板的扩增结果
2.AdCMVTK DNA为模板的扩增结果
3.λDNA/Hind Ⅲ
图3 AdCMVTK的PCR鉴定
3.GCV对感染AdCMVTK的TJ905细胞生长的影响
实验表明，100MOI病毒粒子对TJ905细胞生长无明显影响。用100MOI AdCMVTK感染细胞，加入不同浓度GCV培养6d，从图4可看出其对细胞生长抑制明显，半数抑制浓度约为5 μmol。
图4 GCV对感染与未感染AdCMVTK的TJ905细胞生长的影响
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4.旁观效应
用同样浓度GCV药物处理按不同比例混合培养的感染和非感染细胞，细胞存活率的测定结果表明，按1∶19比例混合培养5 d时，细胞只存活10%，而按1∶1，1∶9比例接种的细胞则大部分死亡，显示了很强的旁观效应，见图5。
图5 感染AdCMVTK的TJ905细胞的旁观效应
讨论
HSVTK基因是单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因，该酶底物特异性不强，可催化核苷类似物无环鸟苷(GCV)磷酸化，使之可以在DNA复制过程掺入DNA链，阻碍DNA复制，抑制细胞分裂，导致细胞在GCV存在时发生凋亡。与之相邻不表达TK基因的细胞也产生凋亡，称为“旁观效应”[4]。重组腺病毒载体比逆转录病毒载体更具安全性，能感染不同组织，滴度高，且能感染分裂缓慢的细胞[1，5]。本文构建了AdCMVTK，并用100个重组腺病毒/细胞的低剂量感染TJ905细胞系，24 h后应用 GCV治疗，细胞的生长受到明显的抑制。尽管有人[1]在其他肿瘤细胞系实验过高剂量的病毒如500～2 000个重组腺病毒/细胞具有非常满意的效果，但考虑到体内只能采取局部注射，病毒会从注射部位向周围扩散而形成浓度梯度，边缘处的浓度是观察重组腺病毒赋予肿瘤细胞对GCV药物敏感性的最佳点，因而使用最低有效剂量，得到的数据对临床治疗来讲最具参考价值。GCV对于未感染重组腺病毒的瘤细胞，即使浓度达到100 μmol/L仍无明显影响，但对于感染过重组腺病毒的瘤细胞，IC50仅为5 μmol，随着剂量的增加，效果更明显。
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从实验结果还可看出，GCV药物作用后，感染AdCMV-TK重组腺病毒的TJ905细胞产生的旁观效应非常明显。这种旁观效应增强了AdCMV-TK/GCV系统治疗胶质瘤的可行性，提高了此系统杀伤肿瘤细胞的效率。
AdCMV-TK/GCV系统治疗肿瘤的不足在于缺乏靶向性。另外，腺病毒衣壳五邻体蛋白造成的细胞毒副作用在动物体内也会产生严重后果，有报道1.5×109 pfu病毒粒子与GCV共同作用引起狒狒死亡[6]，因此必须严格控制实验中病毒浓度。
参考文献
[1].Smythe WR, et al. Use of recombinant adenovirus of transfering the herpes simplex virus thymidine kinese (HSVtk) gene to thoracic neoplasms: an effective in vitroing drug sensitization system.Cancer Res.1994, 54:2055.
, http://www.100md.com
[2].Englehardt JF, et al. Direct gene transfer of human CFIR into human bronchial epithelia of xenografts with E1-deleted adenoviruses.Nature Genet,1993,4:27.
[3].Sambrook J, et al. 分子克隆.第二版.北京：科学出版社，1992：16.
[4].Hamel W, et al. Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-mediated apoptotic death of bystander cells.Cancer Res.1996,56:2607.
[5].Ross C, et al. Gene therapy in the United States:a five year status report.Human Gene Therapy,1996,7:1781.
[6].Goodman JC, et al. Adenoviral-mediated thymidine kinase gene transfer into the primate brain followed by systemic ganciclovir pathologic,radiologic and molecular studies.Human Gene Therapy.1996,7:1241.
(1998年9月15日收稿 1998年12月25日修回), 百拇医药