EGFR反义RNA抑制人脑恶性胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡的研究
作者：刘旭文 浦佩玉 刘爱学 王广秀 王春艳
单位：天津医科大学总医院神经外科(300052)
关键词：EGFR反义RNA；基因转染；胶质瘤细胞；细胞增殖；凋亡
中国临床神经科学/990101摘要 目的：研究表皮生长因子受体(EGFR)反义RNA对抑制胶质瘤细胞增殖及诱导凋亡的作用。方法：将互补于EGFR 3′端部分序列的反义cDNA转染胶质瘤细胞，检测其生长率、增殖活性、EGFR mRNA及其蛋白表达和细胞凋亡。结果：胶质瘤细胞转染EGFR反义RNA后生长率及增殖活性下降，EGFRmRNA及蛋白表达减低，出现大量细胞凋亡。结论：EGFR有可能成为胶质瘤基因治疗的候选基因。
The Effect of Antisense EGFR RNA on the Proliferation
, http://www.100md.com
and Apoptosis of Human Glioblastoma Cells
Liu Xuwen,Pu Peiyu,Liu Aixue,et al
Dept of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin,300052
Objective:The effect of antisense EGFR RNA on the proliferation and apoptosis of malignant glioma cells was studied.Methods:Antisense EGFRcDNA complementary to 3′ partial sequence of EGFR cDNA was transfected to glioma cells.The growth rate,proliferation activity,EGFR mRNA and protein expression as well as apoptosis of transfected cells were measured.Results:The decrease of growth rate and proliferation activity,the lowering of EGFR mRNA and Protein expression,as well as massive apoptosis were found in glioma cells transfected with antisense EGFR RNA.Conclusion:It is possible to use EGFR as a candidate gene for gene therapy of malignant gliomas.
, http://www.100md.com
Key Words Antisense EGFR RNA Glioma cells Gene transfection Cell proliferation Apoptosis
许多研究表明EGFR基因在恶性胶质瘤中常被扩增和过表达，且其表达水平与脑肿瘤的恶性程度呈正相关，由此推测EGFR基因可能是恶性胶质瘤的分子标志[1]。我们先前的研究表明我科建立的TJ905胶质母细胞瘤体外细胞系有高水平EGFR表达；因此设想将反义EGFR基因转移至肿瘤细胞内以抑制EGFR表达，观察所引起的细胞生物学特征变化，以期为胶质瘤的基因治疗提供候选基因。
材料与方法
1.含反义EGFRcDNA 3′端部分序列(552 bp)的质粒pactQsR3，含新霉素抗性基因的载体质粒pSV2-neo及质粒pactQs(无反义基因片段)[2]，由意大利Beguinot博士惠赠。质粒DNA制备参照文献[3]进行。
, http://www.100md.com
2.细胞培养及转染：采用TJ905细胞系(以下简称为G细胞)，其特性已经鉴定。培养方法参照文献[4]进行。以Lipofectamine(Gibco,USA)介导，将质粒pactQsR3及pactQs与质粒pSV2-neo分别按5∶1比例共转染G细胞，经G418(400 μg/ml)筛选，14 d后获抗G418阳性克隆(分别命名为GPR3与GP细胞)。分别随机挑取6个克隆移到96孔板培养并逐步扩增，传代。
3.Southern和Northern印迹杂交及随机引物标记DNA探针参见文献[3]进行。
4.细胞原位mRNA杂交：参照文献[5]进行。
5.细胞生长率测定：细胞接种于96孔板，4 000个(200 μl)孔，分别于接种后24，48，72，96，120，144 h用MTT法检测，取每组6孔吸光度(A值)的均值。以未转染的细胞作为对照组，方法详见文献[6]。
, http://www.100md.com
6.EGFR免疫组化染色及检测细胞增殖活性所用核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNOR)计数的银染，方法参照文献[7]。
7.TUNEL法原位细胞凋亡检测：原位细胞检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，严格按说明书进行。
8.细胞凋亡的超微结构观察：细胞终止培养后用PBS洗3次，经6%戊二醛磷酸缓冲液及1% S4O4固定，包埋，切片，染色，H600透射电镜下检测。
结果
1.Southern印迹杂交：
GPR3，GP及G细胞均显示一9 kb内源性杂交信号，而GPR3细胞尚有一0.5 kb的外源性杂交带，证明外源性反义EGFR基因已在GPR3细胞中整合。
, 百拇医药
2.Northern印迹杂交：
以GPR3，GP及G细胞自身β-actin杂交信号作内标，结果显示GP及G细胞均有一5.8 kb的内源性杂交带，GPR3细胞仅有一0.5 kb外源性杂交带；说明反义EGFR基因已表达并有效封闭内源性EGFR的表达。
3.细胞原位mRNA杂交：
未转染EGFR反义RNA的G及GP细胞浆核内可见蓝色杂交信号，而转染后的GPR3细胞浆核内蓝染强度明显减弱(图1)。
图1 GPR3及G细胞EGFRmRNA原位杂交
A.G细胞 B.GPR3细胞
4.细胞生长率测定：
, http://www.100md.com
GPR3细胞生长率明显低于GP及G细胞，而GP与G细胞生长率无明显差别(表1)。
5.EGFR免疫组化染色及AgNOR计数：
EGFR免疫组化染色可见GPR3细胞较G细胞胞核及胞浆棕黑色着色变浅，阳性细胞数减少。AgNOR计数结果显示GPR3细胞AgNOR计数明显低于GP及G细胞，而GP及G细胞无明显差别(表2)。
表1 GPR3，GP及G细胞生长率 培养天数
n
G
GP(
±s)
GPR3
, http://www.100md.com
F值
P<
1
6
100.00
101.15±13.57
85.97±7.16
55.27
0.0001
2
6
100.00
99.58±7.06
, 百拇医药
74.36±11.82
104.19
0.0001
3
6
100.00
100.27±29.81
71.92±17.22
70.68
0.0001
4
6
100.00
, 百拇医药
103.66±6.75
66.40±11.41
295.55
0.0001
5
6
100.00
101.43±24.39
49.13±9.38
331.24
0.0001
6
, 百拇医药
6
100.00
99.06±22.83
33.05±4.75
713.89
0.0001
培养1～6 d：GPR3与GP，G组相比，P<0.01，GP与G组相比：P>0.05表2 GPR3，GP及G细胞AgNOR计数 细胞
n
AgNOR计数
F值
P
, 百拇医药
G
6
14.58±0.60
GP
6
13.60±0.99
125.03
<0.0001
GPR3
6
7.63±0.45
GPR3与GP，G组相比：P<0.01，GP与G组相比：P>0.05 6.细胞凋亡检测
, http://www.100md.com
原位细胞凋亡检测可见GPR3细胞出现许多蓝染的处于凋亡过程的细胞，而GP及G细胞未检出细胞凋亡。透射电镜下见GPR3细胞核染色质凝聚成团块，有的成典型的新月状改变，附于核膜下，并可见凋亡小体形成(图2)，而GP及G细胞未见有这种凋亡的特征性改变。
图2 GPR3细胞电镜检测显示调亡
讨论
许多研究表明，EGFR过表达的发生率与胶质瘤级别密切相关，EGFR基因在恶性胶质瘤中常被扩增和过表达，由此推测EGFR的阳性表达可能是恶性胶质瘤的分子标志，在胶质瘤恶性进展中起重要作用。因此，EGFR基因有可能成为胶质瘤基因治疗的候选基因。Kalofonos已报道采用EGFR的单克隆抗体治疗胶质瘤得到令人满意的结果[8]。
, 百拇医药
目前有关EGFR反义RNA对恶性胶质瘤的抑瘤作用的研究，国内外尚未见报道。EGFR反义RNA对其他肿瘤的抑瘤作用的研究也仅见于人结肠癌、胰腺癌及人KB肿瘤细胞系的报道[2，9，10]。
我们采用Lipofectamine介导，成功地将EGFR反义基因转染恶性胶质瘤细胞，发现它可以有效抑制EGFRmRNA及蛋白的表达，从而影响了肿瘤细胞的生长与增殖。再者，目前认为肿瘤的发生除与细胞增殖失控有关外，也与细胞凋亡的抑制有关。所以某种治疗肿瘤的药物或措施能否诱导细胞凋亡对评估其疗效有参考价值。我们发现经转染EGFR反义RNA的胶质瘤细胞出现许多凋亡细胞，而未转染细胞并未检出凋亡现象，这说明EGFR反义RNA可有效诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡，显示其潜在的治疗价值。
本实验结果提示EGFR在恶性胶质瘤细胞的生长增殖过程中起重要作用，并有可能成为恶性胶质瘤基因治疗的候选基因，值得进一步研究。
, http://www.100md.com
*国家自然科学基金资助课题，编号39570715
参考文献
[1].刘旭文，浦佩玉.人脑胶质瘤中表皮生长因子受体的研究.国外医学神经病学神经外科分册.1995，22：296
[2].Mornoni MC, Willingham MC,Beguinot L.EGFR antisense RNA blocks expression of epidermal growth factor receptor and suppresses the transforming phenotype of a human caarcimona cell line. J Biol Chem. 1992,267:2714
[3].Sambrook J,Fritsch EF,Manistis T.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989
, 百拇医药
[4].王淑兰，李峰，浦佩玉等.人脑恶性胶质母细胞瘤体外细胞系TJ899及TJ905的建立及其特征.天津医药，1996，24：416
[5].苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994
[6].Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods.1983,65:55
[7].刘旭文，浦佩玉，高之宪等.神经上皮组织起源的脑肿瘤增殖活性与表皮生长因子受体基因表达的相关性研究.中国神经精神疾病杂志.1997，23：130
[8].Kalofonos H,Pawlikowska TRB,Snook DE, et al. Radiolabelled monoclonal antibodies for localization and therapy of brain gliomas.Br J Cancer.1989,59:318
, 百拇医药
[9].Liu TH,Chen J,Zeng CX.Effects of antisense epidermal growth factor and its receptor retroviral expression vectors on cell growth of human pancreatic carcinoma cell line.Chinese Med J.1995,108:653
[10].Rajagopal S,Shuang H,Moskal TL,et al. Epidermal growth factor expression in human colon and colon carcinomas:Antisense epidermal growth factor receptor RNA down-regulates the proliferation of human colon cancer cells.Int J Cancer,1995,62:661
(1998年7月28日收稿 1998年10月5日修回), 百拇医药
单位：天津医科大学总医院神经外科(300052)
关键词：EGFR反义RNA；基因转染；胶质瘤细胞；细胞增殖；凋亡
中国临床神经科学/990101摘要 目的：研究表皮生长因子受体(EGFR)反义RNA对抑制胶质瘤细胞增殖及诱导凋亡的作用。方法：将互补于EGFR 3′端部分序列的反义cDNA转染胶质瘤细胞，检测其生长率、增殖活性、EGFR mRNA及其蛋白表达和细胞凋亡。结果：胶质瘤细胞转染EGFR反义RNA后生长率及增殖活性下降，EGFRmRNA及蛋白表达减低，出现大量细胞凋亡。结论：EGFR有可能成为胶质瘤基因治疗的候选基因。
The Effect of Antisense EGFR RNA on the Proliferation
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and Apoptosis of Human Glioblastoma Cells
Liu Xuwen,Pu Peiyu,Liu Aixue,et al
Dept of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin,300052
Objective:The effect of antisense EGFR RNA on the proliferation and apoptosis of malignant glioma cells was studied.Methods:Antisense EGFRcDNA complementary to 3′ partial sequence of EGFR cDNA was transfected to glioma cells.The growth rate,proliferation activity,EGFR mRNA and protein expression as well as apoptosis of transfected cells were measured.Results:The decrease of growth rate and proliferation activity,the lowering of EGFR mRNA and Protein expression,as well as massive apoptosis were found in glioma cells transfected with antisense EGFR RNA.Conclusion:It is possible to use EGFR as a candidate gene for gene therapy of malignant gliomas.
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Key Words Antisense EGFR RNA Glioma cells Gene transfection Cell proliferation Apoptosis
许多研究表明EGFR基因在恶性胶质瘤中常被扩增和过表达，且其表达水平与脑肿瘤的恶性程度呈正相关，由此推测EGFR基因可能是恶性胶质瘤的分子标志[1]。我们先前的研究表明我科建立的TJ905胶质母细胞瘤体外细胞系有高水平EGFR表达；因此设想将反义EGFR基因转移至肿瘤细胞内以抑制EGFR表达，观察所引起的细胞生物学特征变化，以期为胶质瘤的基因治疗提供候选基因。
材料与方法
1.含反义EGFRcDNA 3′端部分序列(552 bp)的质粒pactQsR3，含新霉素抗性基因的载体质粒pSV2-neo及质粒pactQs(无反义基因片段)[2]，由意大利Beguinot博士惠赠。质粒DNA制备参照文献[3]进行。
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2.细胞培养及转染：采用TJ905细胞系(以下简称为G细胞)，其特性已经鉴定。培养方法参照文献[4]进行。以Lipofectamine(Gibco,USA)介导，将质粒pactQsR3及pactQs与质粒pSV2-neo分别按5∶1比例共转染G细胞，经G418(400 μg/ml)筛选，14 d后获抗G418阳性克隆(分别命名为GPR3与GP细胞)。分别随机挑取6个克隆移到96孔板培养并逐步扩增，传代。
3.Southern和Northern印迹杂交及随机引物标记DNA探针参见文献[3]进行。
4.细胞原位mRNA杂交：参照文献[5]进行。
5.细胞生长率测定：细胞接种于96孔板，4 000个(200 μl)孔，分别于接种后24，48，72，96，120，144 h用MTT法检测，取每组6孔吸光度(A值)的均值。以未转染的细胞作为对照组，方法详见文献[6]。
, http://www.100md.com
6.EGFR免疫组化染色及检测细胞增殖活性所用核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNOR)计数的银染，方法参照文献[7]。
7.TUNEL法原位细胞凋亡检测：原位细胞检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，严格按说明书进行。
8.细胞凋亡的超微结构观察：细胞终止培养后用PBS洗3次，经6%戊二醛磷酸缓冲液及1% S4O4固定，包埋，切片，染色，H600透射电镜下检测。
结果
1.Southern印迹杂交：
GPR3，GP及G细胞均显示一9 kb内源性杂交信号，而GPR3细胞尚有一0.5 kb的外源性杂交带，证明外源性反义EGFR基因已在GPR3细胞中整合。
, 百拇医药
2.Northern印迹杂交：
以GPR3，GP及G细胞自身β-actin杂交信号作内标，结果显示GP及G细胞均有一5.8 kb的内源性杂交带，GPR3细胞仅有一0.5 kb外源性杂交带；说明反义EGFR基因已表达并有效封闭内源性EGFR的表达。
3.细胞原位mRNA杂交：
未转染EGFR反义RNA的G及GP细胞浆核内可见蓝色杂交信号，而转染后的GPR3细胞浆核内蓝染强度明显减弱(图1)。
图1 GPR3及G细胞EGFRmRNA原位杂交
A.G细胞 B.GPR3细胞
4.细胞生长率测定：
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GPR3细胞生长率明显低于GP及G细胞，而GP与G细胞生长率无明显差别(表1)。
5.EGFR免疫组化染色及AgNOR计数：
EGFR免疫组化染色可见GPR3细胞较G细胞胞核及胞浆棕黑色着色变浅，阳性细胞数减少。AgNOR计数结果显示GPR3细胞AgNOR计数明显低于GP及G细胞，而GP及G细胞无明显差别(表2)。
表1 GPR3，GP及G细胞生长率 培养天数
n
G
GP(
±s)GPR3
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F值
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99.58±7.06
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74.36±11.82
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331.24
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99.06±22.83
33.05±4.75
713.89
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培养1～6 d：GPR3与GP，G组相比，P<0.01，GP与G组相比：P>0.05表2 GPR3，GP及G细胞AgNOR计数 细胞
n
AgNOR计数
F值
P
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G
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14.58±0.60
GP
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13.60±0.99
125.03
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7.63±0.45
GPR3与GP，G组相比：P<0.01，GP与G组相比：P>0.05 6.细胞凋亡检测
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原位细胞凋亡检测可见GPR3细胞出现许多蓝染的处于凋亡过程的细胞，而GP及G细胞未检出细胞凋亡。透射电镜下见GPR3细胞核染色质凝聚成团块，有的成典型的新月状改变，附于核膜下，并可见凋亡小体形成(图2)，而GP及G细胞未见有这种凋亡的特征性改变。
图2 GPR3细胞电镜检测显示调亡
讨论
许多研究表明，EGFR过表达的发生率与胶质瘤级别密切相关，EGFR基因在恶性胶质瘤中常被扩增和过表达，由此推测EGFR的阳性表达可能是恶性胶质瘤的分子标志，在胶质瘤恶性进展中起重要作用。因此，EGFR基因有可能成为胶质瘤基因治疗的候选基因。Kalofonos已报道采用EGFR的单克隆抗体治疗胶质瘤得到令人满意的结果[8]。
, 百拇医药
目前有关EGFR反义RNA对恶性胶质瘤的抑瘤作用的研究，国内外尚未见报道。EGFR反义RNA对其他肿瘤的抑瘤作用的研究也仅见于人结肠癌、胰腺癌及人KB肿瘤细胞系的报道[2，9，10]。
我们采用Lipofectamine介导，成功地将EGFR反义基因转染恶性胶质瘤细胞，发现它可以有效抑制EGFRmRNA及蛋白的表达，从而影响了肿瘤细胞的生长与增殖。再者，目前认为肿瘤的发生除与细胞增殖失控有关外，也与细胞凋亡的抑制有关。所以某种治疗肿瘤的药物或措施能否诱导细胞凋亡对评估其疗效有参考价值。我们发现经转染EGFR反义RNA的胶质瘤细胞出现许多凋亡细胞，而未转染细胞并未检出凋亡现象，这说明EGFR反义RNA可有效诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡，显示其潜在的治疗价值。
本实验结果提示EGFR在恶性胶质瘤细胞的生长增殖过程中起重要作用，并有可能成为恶性胶质瘤基因治疗的候选基因，值得进一步研究。
, http://www.100md.com
*国家自然科学基金资助课题，编号39570715
参考文献
[1].刘旭文，浦佩玉.人脑胶质瘤中表皮生长因子受体的研究.国外医学神经病学神经外科分册.1995，22：296
[2].Mornoni MC, Willingham MC,Beguinot L.EGFR antisense RNA blocks expression of epidermal growth factor receptor and suppresses the transforming phenotype of a human caarcimona cell line. J Biol Chem. 1992,267:2714
[3].Sambrook J,Fritsch EF,Manistis T.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989
, 百拇医药
[4].王淑兰，李峰，浦佩玉等.人脑恶性胶质母细胞瘤体外细胞系TJ899及TJ905的建立及其特征.天津医药，1996，24：416
[5].苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994
[6].Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods.1983,65:55
[7].刘旭文，浦佩玉，高之宪等.神经上皮组织起源的脑肿瘤增殖活性与表皮生长因子受体基因表达的相关性研究.中国神经精神疾病杂志.1997，23：130
[8].Kalofonos H,Pawlikowska TRB,Snook DE, et al. Radiolabelled monoclonal antibodies for localization and therapy of brain gliomas.Br J Cancer.1989,59:318
, 百拇医药
[9].Liu TH,Chen J,Zeng CX.Effects of antisense epidermal growth factor and its receptor retroviral expression vectors on cell growth of human pancreatic carcinoma cell line.Chinese Med J.1995,108:653
[10].Rajagopal S,Shuang H,Moskal TL,et al. Epidermal growth factor expression in human colon and colon carcinomas:Antisense epidermal growth factor receptor RNA down-regulates the proliferation of human colon cancer cells.Int J Cancer,1995,62:661
(1998年7月28日收稿 1998年10月5日修回), 百拇医药