L-苯丙氨酸抑制SHR心肌组织I型胶原α2链mRNA表达*
作者：李振波 赵光胜
单位：李振波：现在中国医学科学院北京天坛医院 100050；赵光胜：上海第二医科大学瑞金医院上海市高血压研究所 200025
关键词：L-苯丙氨酸；自发性高血压大鼠；胶原；心肌；Northern分析
高血压杂志990228
目的 旨在观察L-苯丙氨酸对自发性高血压大鼠心肌胶原组织的影响。方法：8只断奶雄性自发性血压大鼠随机分为两组。实验组饲以含3%L-苯丙氨酸的大鼠饲料，对照组饲以标准饲料，共8周。以大鼠心肌组织的总mRNA为实验材料，以大鼠I型胶原α2链[α2(I)]的cDNA探针进行Northern杂交分析。结果 实验组的α2(I)mRNA表达强度较对照组明显减低。结论 L-苯丙氨酸抑制SHR心肌组织α2(I)mRNA表达，可能是L-苯丙氨酸预防SHR心肌肥厚的机理所在。
, http://www.100md.com
中图分类号:R544.1;R331.3;Q51;R972 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)02-0165-02
L-Phenylalanine Inhibited the Expression of Collagen Type Ⅰα2 Chain mRNA in SHR
LI Zhenbo,ZHAO Guangsheng
(Shanghai Institute of Hypertension,Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)
ABSTRACT Objective The purpose of the study was to investigate the effect of L-Phenylalanine(Phe) on expression of α2 chain[α2(I)] mRNA of collagen type I in myocardium of spontaneously hypertensive rat(SHR).Methods 8 weanling male SHRs were randomly divided into experimental and control groups.The former was fed with chow supplemented 3% Phe,the latter with standard rat chow in standard condition for 8 weeks.Total mRNA from SHR myocardium of the two groups was extracted and then Northern blot analysis was performed with probe of α2(I) cDNA and α-actin as inner standard.Results The exprssion level of α2(I)mRNA was reduced significantly in experimental group.Conclusion L-Phe might inhibited the expression of α2(I) mRNA in SHR,which may be the mechanism of Phe.preventing myocardium hypertrophy of SHR.
, 百拇医药
Key Words L-Phenylalanine; SHR; Collagen; myocardium; Northern blot analysis
人群血压水平与血浆游离L-苯丙氨酸(L-Phe)浓度呈负相关[1]。给自发性高血压大鼠(SHR)饲喂Phe可以预防血压升高和心肌肥厚[2]。并反复证明L-苯丙氨酸可以有效地预防和逆转高血压患者正常血压子女所存在的遗传性心脏异常性变化[3]。因此，探明L-Phe对高血压心血管组织的作用机理具有重要的理论和临床实践意义。另据我们的研究结果表明：L-Phe可以抑制SHR血管平滑肌细胞和心肌成纤维细胞的增殖。I型胶原由心肌成纤维细胞合成和分泌，是参与心肌肥厚过程的重要细胞外间质成分。为了进一步探索L-Phe对SHR心血管组织作用的影响，以SHR为实验对象，观察其对α2(I)mRNA表达水平的影响，旨在从分子水平探索其预防心肌肥厚作用的机理。
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MATERIALS AND METHODS
1 材料与试剂
1.1 20×SSPE：NaCl 173.5 g、NaH2PO4.H2O 27.6 g、EDTA 7.4 g,用NaOH溶液调pH值至7.4，加水定容至1000 ml，分装后高压灭菌，4℃放置备用。
1.2 预杂交液：0.1% SDS,2×SSPE,50%去离子甲酰胺，0.15 mmol dNTP,100 μg/ml经超声断裂的鲱鱼精DNA。
1.3 大鼠α2(I)cDNA 探针质粒[4]：美国康涅狄格大学健康中心 Genovess博士惠赠，0.9kb,EcoRI/PstI双酶切位点,氨苄青霉素抗性。特异性cDNA探针核苷酸序列如下：
, 百拇医药
5'-CCT GTC TGT TTC AAA TAA GTG AAC TCA ACC TAA
AAT AAA AAA CAA AAA CCC CCG AAA AAA ACT TTC
TCT TTG CCA TTT CTT CCT TTA AAA ACA AAA AAA
AAA
1.4 β-actin探针质粒:中国科学院上海生物化学研究所199组惠赠(1.1 kb,EcolRI、HindⅢ双酶切位点，氨苄青霉素抗性)1.8.L-苯丙氨酸：Sigma公司产品，上海伯奥生物化学公司分装。甲酰胺、MOPs、琼脂糖：Sigma化学公司产品。Nylon膜：Gene Screen公司产品。TRIZOL总mRNA抽提试剂盒：美国GIBCOL BRL公司产品。EcoRI、PstI和Hind Ⅲ 、λDNA/HindⅢ marker、琼脂糖:美国Promega公司产品。X线胶片：日本FUJI公司产品。紫外分光光度计：Backerman公司产品。VIDAS图象处理系统：德国Tsess光学公司产品。其余试剂均为市售分析纯级。
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2 实验动物： 断奶的雄性SHR,由上海市高血压研究所动物室提供，共8只。随机分为两组,每组4只。对照组饲以标准饲料；实验组饲以含3%L-Phe的大鼠标准饲料,在标准条件下饲养8周。
3 方法
3.1 β-actin和α2(I)cDNA探针的制备：采用碱裂解法小量质粒DNA的制备方法抽提质粒DNA[5]。按常规方法转化β-actin和α2(I)cDNA质粒并扩增后，采用碱裂解法小量质粒DNA的方法抽提小量探针质粒DNA。取4μg的质粒DNA分别以其相应的内切酶进行酶切,将与探针片断相应的DNA marker和酶切体系置于含溴乙啶的0.8%琼脂糖凝胶中电泳。待探针片断分离良好后,以用酒精灯烧红过的刀片切下含探针DNA的凝胶置于一小Eppendorf管中盖紧,置-80℃冰箱中放置10分钟取出,吸取冻缩出的探针DNA液,测定其浓度。
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3.2 探针的标记： 按试剂盒所提供的protocol以32P-CTP进行探针标记，并测其放射活性。
3.3 心肌组织mRNA的抽提： 按TRIzol试剂盒所提供的操作方法进行。将SHR断头，取心脏。用以DEPC处理的水配制的冷PBS冲洗血迹。取0.1 g新鲜的心肌组织置于冰浴的玻璃匀浆器中,加入TRIzol试剂1 ml,在冰浴中匀浆。之后,室温放置5分钟,加入0.2 ml氯仿,充分混匀,室温放置5分钟,4℃ 12 000 g离心15分钟。小心抽取上层水相于一Eppendorf管中,加入0.5 ml异丙醇混匀,20℃放置10分钟,4℃ 12 000 g离心15分钟,吸弃上清液,用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀,4℃ 750 g离心5分钟,沉淀以DEPC水溶解。以紫外分光光度计测OD260 nm/280 nm值，计算其浓度,以0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品的纯度
3.4 Northern杂交分析： 参照Bhambi B等的方法进行[6]。每一被检样品各取30 μg总mRNA于50%甲酰胺,17.5%福尔马林和1×MOPs缓冲液中,70℃变性5分钟。取出后置冰浴5分钟,使RNA解旋。加8 μl加样缓冲液混合后加样于0.8%琼脂糖凝胶中,5 V/cm电压电泳,待溴酚蓝泳出凝胶后停止电泳取出凝胶,以DEPC水淋洗两次,用7.5 mmol的NaOH转膜过夜,-80℃真空炉中烤2小时。将膜置于2×SSPE中浸泡10分钟,加入预杂交液封口后,于水浴摇床中42℃预杂交4小时。倾弃预杂交液加入含有以32P-标记好的α2(I) cDNA 探针的杂交液中,置水浴摇床中42℃ 24小时,取出后,室温条件下,以0.1%SDS和1×SSC混合液洗膜10分钟,0.1%SDS,0.1×SSC 20分钟,共两次。用滤纸将膜吸干后,保鲜膜封好,在暗室中压片。置-80℃放置72小时放射自显影。之后,将滤膜以0.1×SSC,0.1%SDS于95℃煮沸5分钟,去除已杂交的α2(I)cDNA探针[5],以32P-标好的β-actin探针按相同的方法进行Northern杂交后作内参照,以消除总mRNA上样量的误差。用VIDAS图像处理系统分别对实验组和对照组的杂交信号密度进行扫描,对 α2(I) mRNA表达进行定量分析。测定值以
±s表示,采用两样本均数的t检验,P<0.05为有显著性差异。
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RESULTS
1 β-actin和α2(I)cDNA探针的制备和纯化结果良好,如Fig 1.
图1 β-actin 和 α2(I)cDNA 探针的纯化
Fig 1 Purification of β-actin and α2(I)cDNA
2 SHR心肌组织总mRNA纯度良好,18S和28S清晰,RNA基本无降解。如Fig 2.
图2 心肌组织总mRNA的18S和28S清晰，基本无降解
, 百拇医药
Fig 2 Total 18S and 28S mRNA were clear in heart muscle
3 实验组α2(I)mRNA的表达量1.32±0.15,对照组:2.62±0.19,P<0.005,两组有明显差异如Fig 3。
图3 Phe 抑制SHR心肌组织α2(I)mRNA的表达
Fig 3 Phe inhibited the expression of α2(I)mRNA in myocardium of SHR heart muscle
, http://www.100md.com DISCUSSION
心肌组织中的I型胶原由心肌成纤维细胞合成并分泌到细胞外间质，是心肌组织细胞外间质的主要成分。高血压时,由于外周阻力、体液因素和各种生长因子等的作用使心肌组织中胶原的绝对含量增多,各型胶原间的比例失调,致使心肌组织的顺应性减小,心功能减退，是其它各型心肌肥厚所表现的共同特征[7]。减少心肌组织细胞外间质中的胶原含量,尤其是I型胶原含量是改善心肌顺应性的重要策略。有些抗高血压药物可以抑制心肌组织中胶原的合成，但因其副作用限制了其临床应用。我们的结论认为，L-Phe抑制SHR心肌组织I型胶原α2链mRNA表达。可能是其预防SHR心肌肥厚的机理所在。过去的研究显示的L-Phe.预防SHR血压升高和有效预防和逆转高血压患者正常血压子女所存在的遗传性心脏异常性变化的结果也可能与此有关[1,2]。但L-苯丙氨酸是否还可以加速肥厚心肌组织中胶原的分解尚不清楚,有待进一步研究。L-Phe作为机体的必需氨基酸具有此作用，将为临床高血压的防治提供新的疗法，具有重要的临床意义。
, 百拇医药
*：国家自然科学基金资助课题(No:39470626)
REFERENCES
1 赵光胜.我国八个人群血清氨基酸与血压的相关分析[J]营养学报 1990;12：355～359
2 赵光胜，顾天华，陈庄.苯丙氨酸预防自发性高血压大鼠升压的实验研究[J]中国慢性病预防与控制 1992;1(2):15～18
3 赵光胜，邱慧丽，范明昌,等.苯丙氨酸逆转高血压的前期病理变化:遗传性心血管肥厚的研究[J]1995;3(3):1196～1203
4 Genovese C， Rowe D， Kream B.Construction of DNA sequences complementary to rat α1(I) and β2(I) collagen mRNA and their use in studying the regulation of type I collagen synthesis by 1,25-dihydroxy-vitamine D[J]Biochemistry 1984;23:6210～6216
, http://www.100md.com
5 金冬雁,黎孟枫 译.分子克隆[M]第二版,科学出版社.1992年,北京.pp55～56
6 Bhambi B,Eghbali M.Effect of norepinpherine on myocardial collagen gene expression and responese of cardiac fibrobasts after norephinephrine treatment[J] Am.J.Pathol 1991；139(5):1131～1142
7 Weber K,Brilla C.Pathological hypertension and cardiac instritium[J]Circulation 1991;83:1849～1865
收稿日期：1998-12-01, http://www.100md.com
单位：李振波：现在中国医学科学院北京天坛医院 100050；赵光胜：上海第二医科大学瑞金医院上海市高血压研究所 200025
关键词：L-苯丙氨酸；自发性高血压大鼠；胶原；心肌；Northern分析
高血压杂志990228
目的 旨在观察L-苯丙氨酸对自发性高血压大鼠心肌胶原组织的影响。方法：8只断奶雄性自发性血压大鼠随机分为两组。实验组饲以含3%L-苯丙氨酸的大鼠饲料，对照组饲以标准饲料，共8周。以大鼠心肌组织的总mRNA为实验材料，以大鼠I型胶原α2链[α2(I)]的cDNA探针进行Northern杂交分析。结果 实验组的α2(I)mRNA表达强度较对照组明显减低。结论 L-苯丙氨酸抑制SHR心肌组织α2(I)mRNA表达，可能是L-苯丙氨酸预防SHR心肌肥厚的机理所在。
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中图分类号:R544.1;R331.3;Q51;R972 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)02-0165-02
L-Phenylalanine Inhibited the Expression of Collagen Type Ⅰα2 Chain mRNA in SHR
LI Zhenbo,ZHAO Guangsheng
(Shanghai Institute of Hypertension,Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)
ABSTRACT Objective The purpose of the study was to investigate the effect of L-Phenylalanine(Phe) on expression of α2 chain[α2(I)] mRNA of collagen type I in myocardium of spontaneously hypertensive rat(SHR).Methods 8 weanling male SHRs were randomly divided into experimental and control groups.The former was fed with chow supplemented 3% Phe,the latter with standard rat chow in standard condition for 8 weeks.Total mRNA from SHR myocardium of the two groups was extracted and then Northern blot analysis was performed with probe of α2(I) cDNA and α-actin as inner standard.Results The exprssion level of α2(I)mRNA was reduced significantly in experimental group.Conclusion L-Phe might inhibited the expression of α2(I) mRNA in SHR,which may be the mechanism of Phe.preventing myocardium hypertrophy of SHR.
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Key Words L-Phenylalanine; SHR; Collagen; myocardium; Northern blot analysis
人群血压水平与血浆游离L-苯丙氨酸(L-Phe)浓度呈负相关[1]。给自发性高血压大鼠(SHR)饲喂Phe可以预防血压升高和心肌肥厚[2]。并反复证明L-苯丙氨酸可以有效地预防和逆转高血压患者正常血压子女所存在的遗传性心脏异常性变化[3]。因此，探明L-Phe对高血压心血管组织的作用机理具有重要的理论和临床实践意义。另据我们的研究结果表明：L-Phe可以抑制SHR血管平滑肌细胞和心肌成纤维细胞的增殖。I型胶原由心肌成纤维细胞合成和分泌，是参与心肌肥厚过程的重要细胞外间质成分。为了进一步探索L-Phe对SHR心血管组织作用的影响，以SHR为实验对象，观察其对α2(I)mRNA表达水平的影响，旨在从分子水平探索其预防心肌肥厚作用的机理。
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MATERIALS AND METHODS
1 材料与试剂
1.1 20×SSPE：NaCl 173.5 g、NaH2PO4.H2O 27.6 g、EDTA 7.4 g,用NaOH溶液调pH值至7.4，加水定容至1000 ml，分装后高压灭菌，4℃放置备用。
1.2 预杂交液：0.1% SDS,2×SSPE,50%去离子甲酰胺，0.15 mmol dNTP,100 μg/ml经超声断裂的鲱鱼精DNA。
1.3 大鼠α2(I)cDNA 探针质粒[4]：美国康涅狄格大学健康中心 Genovess博士惠赠，0.9kb,EcoRI/PstI双酶切位点,氨苄青霉素抗性。特异性cDNA探针核苷酸序列如下：
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5'-CCT GTC TGT TTC AAA TAA GTG AAC TCA ACC TAA
AAT AAA AAA CAA AAA CCC CCG AAA AAA ACT TTC
TCT TTG CCA TTT CTT CCT TTA AAA ACA AAA AAA
AAA
1.4 β-actin探针质粒:中国科学院上海生物化学研究所199组惠赠(1.1 kb,EcolRI、HindⅢ双酶切位点，氨苄青霉素抗性)1.8.L-苯丙氨酸：Sigma公司产品，上海伯奥生物化学公司分装。甲酰胺、MOPs、琼脂糖：Sigma化学公司产品。Nylon膜：Gene Screen公司产品。TRIZOL总mRNA抽提试剂盒：美国GIBCOL BRL公司产品。EcoRI、PstI和Hind Ⅲ 、λDNA/HindⅢ marker、琼脂糖:美国Promega公司产品。X线胶片：日本FUJI公司产品。紫外分光光度计：Backerman公司产品。VIDAS图象处理系统：德国Tsess光学公司产品。其余试剂均为市售分析纯级。
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2 实验动物： 断奶的雄性SHR,由上海市高血压研究所动物室提供，共8只。随机分为两组,每组4只。对照组饲以标准饲料；实验组饲以含3%L-Phe的大鼠标准饲料,在标准条件下饲养8周。
3 方法
3.1 β-actin和α2(I)cDNA探针的制备：采用碱裂解法小量质粒DNA的制备方法抽提质粒DNA[5]。按常规方法转化β-actin和α2(I)cDNA质粒并扩增后，采用碱裂解法小量质粒DNA的方法抽提小量探针质粒DNA。取4μg的质粒DNA分别以其相应的内切酶进行酶切,将与探针片断相应的DNA marker和酶切体系置于含溴乙啶的0.8%琼脂糖凝胶中电泳。待探针片断分离良好后,以用酒精灯烧红过的刀片切下含探针DNA的凝胶置于一小Eppendorf管中盖紧,置-80℃冰箱中放置10分钟取出,吸取冻缩出的探针DNA液,测定其浓度。
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3.2 探针的标记： 按试剂盒所提供的protocol以32P-CTP进行探针标记，并测其放射活性。
3.3 心肌组织mRNA的抽提： 按TRIzol试剂盒所提供的操作方法进行。将SHR断头，取心脏。用以DEPC处理的水配制的冷PBS冲洗血迹。取0.1 g新鲜的心肌组织置于冰浴的玻璃匀浆器中,加入TRIzol试剂1 ml,在冰浴中匀浆。之后,室温放置5分钟,加入0.2 ml氯仿,充分混匀,室温放置5分钟,4℃ 12 000 g离心15分钟。小心抽取上层水相于一Eppendorf管中,加入0.5 ml异丙醇混匀,20℃放置10分钟,4℃ 12 000 g离心15分钟,吸弃上清液,用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀,4℃ 750 g离心5分钟,沉淀以DEPC水溶解。以紫外分光光度计测OD260 nm/280 nm值，计算其浓度,以0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品的纯度
3.4 Northern杂交分析： 参照Bhambi B等的方法进行[6]。每一被检样品各取30 μg总mRNA于50%甲酰胺,17.5%福尔马林和1×MOPs缓冲液中,70℃变性5分钟。取出后置冰浴5分钟,使RNA解旋。加8 μl加样缓冲液混合后加样于0.8%琼脂糖凝胶中,5 V/cm电压电泳,待溴酚蓝泳出凝胶后停止电泳取出凝胶,以DEPC水淋洗两次,用7.5 mmol的NaOH转膜过夜,-80℃真空炉中烤2小时。将膜置于2×SSPE中浸泡10分钟,加入预杂交液封口后,于水浴摇床中42℃预杂交4小时。倾弃预杂交液加入含有以32P-标记好的α2(I) cDNA 探针的杂交液中,置水浴摇床中42℃ 24小时,取出后,室温条件下,以0.1%SDS和1×SSC混合液洗膜10分钟,0.1%SDS,0.1×SSC 20分钟,共两次。用滤纸将膜吸干后,保鲜膜封好,在暗室中压片。置-80℃放置72小时放射自显影。之后,将滤膜以0.1×SSC,0.1%SDS于95℃煮沸5分钟,去除已杂交的α2(I)cDNA探针[5],以32P-标好的β-actin探针按相同的方法进行Northern杂交后作内参照,以消除总mRNA上样量的误差。用VIDAS图像处理系统分别对实验组和对照组的杂交信号密度进行扫描,对 α2(I) mRNA表达进行定量分析。测定值以
±s表示,采用两样本均数的t检验,P<0.05为有显著性差异。, http://www.100md.com
RESULTS
1 β-actin和α2(I)cDNA探针的制备和纯化结果良好,如Fig 1.
图1 β-actin 和 α2(I)cDNA 探针的纯化
Fig 1 Purification of β-actin and α2(I)cDNA
2 SHR心肌组织总mRNA纯度良好,18S和28S清晰,RNA基本无降解。如Fig 2.
图2 心肌组织总mRNA的18S和28S清晰，基本无降解
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Fig 2 Total 18S and 28S mRNA were clear in heart muscle
3 实验组α2(I)mRNA的表达量1.32±0.15,对照组:2.62±0.19,P<0.005,两组有明显差异如Fig 3。
图3 Phe 抑制SHR心肌组织α2(I)mRNA的表达
Fig 3 Phe inhibited the expression of α2(I)mRNA in myocardium of SHR heart muscle
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心肌组织中的I型胶原由心肌成纤维细胞合成并分泌到细胞外间质，是心肌组织细胞外间质的主要成分。高血压时,由于外周阻力、体液因素和各种生长因子等的作用使心肌组织中胶原的绝对含量增多,各型胶原间的比例失调,致使心肌组织的顺应性减小,心功能减退，是其它各型心肌肥厚所表现的共同特征[7]。减少心肌组织细胞外间质中的胶原含量,尤其是I型胶原含量是改善心肌顺应性的重要策略。有些抗高血压药物可以抑制心肌组织中胶原的合成，但因其副作用限制了其临床应用。我们的结论认为，L-Phe抑制SHR心肌组织I型胶原α2链mRNA表达。可能是其预防SHR心肌肥厚的机理所在。过去的研究显示的L-Phe.预防SHR血压升高和有效预防和逆转高血压患者正常血压子女所存在的遗传性心脏异常性变化的结果也可能与此有关[1,2]。但L-苯丙氨酸是否还可以加速肥厚心肌组织中胶原的分解尚不清楚,有待进一步研究。L-Phe作为机体的必需氨基酸具有此作用，将为临床高血压的防治提供新的疗法，具有重要的临床意义。
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*：国家自然科学基金资助课题(No:39470626)
REFERENCES
1 赵光胜.我国八个人群血清氨基酸与血压的相关分析[J]营养学报 1990;12：355～359
2 赵光胜，顾天华，陈庄.苯丙氨酸预防自发性高血压大鼠升压的实验研究[J]中国慢性病预防与控制 1992;1(2):15～18
3 赵光胜，邱慧丽，范明昌,等.苯丙氨酸逆转高血压的前期病理变化:遗传性心血管肥厚的研究[J]1995;3(3):1196～1203
4 Genovese C， Rowe D， Kream B.Construction of DNA sequences complementary to rat α1(I) and β2(I) collagen mRNA and their use in studying the regulation of type I collagen synthesis by 1,25-dihydroxy-vitamine D[J]Biochemistry 1984;23:6210～6216
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5 金冬雁,黎孟枫 译.分子克隆[M]第二版,科学出版社.1992年,北京.pp55～56
6 Bhambi B,Eghbali M.Effect of norepinpherine on myocardial collagen gene expression and responese of cardiac fibrobasts after norephinephrine treatment[J] Am.J.Pathol 1991；139(5):1131～1142
7 Weber K,Brilla C.Pathological hypertension and cardiac instritium[J]Circulation 1991;83:1849～1865
收稿日期：1998-12-01, http://www.100md.com