L-苯丙氨酸抑制自发性高血压大鼠心肌成纤维细胞增殖*
作者：李振波 赵光胜
单位：赵光胜：上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所 200025；李振波：博士生现在中国医学科学院北京天坛医院(100050)
关键词：L-苯丙氨酸；自发性高血压大鼠；心肌成纤维细胞；DNA合成；细胞培养
高血压杂志990227
目的 旨在观察L-苯丙氨酸对自发性高血压大鼠心肌成纤维细胞的增殖作用的影响。方法 取1天龄自发性高血压大鼠心脏组织培养心肌成纤维细胞,分别以不同浓度的L-苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸干预一定时间后，利用3H-胸腺嘧啶掺入技术和细胞计数测定各不同浓度的氨基酸对心肌成纤维细胞DNA合成和细胞增殖数目的影响。结果 随着L-苯丙氨酸浓度的增加，心肌成纤维细胞的DNA合成量减少，细胞增殖数目减低。而L-酪氨酸和组氨酸随着浓度的增加对心肌成纤维细胞DNA的合成量和细胞增殖数目无影响。结论 L-苯丙氨酸可以特异性地抑制SHR心肌成纤维细胞的增殖。
, 百拇医药
中图分类号：N33;Q2-33;R331.3;R972 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)02-0163-03
L-Phenylalanine Specifically Inhibited the Proliferation of Myocardial Fibroblast in Spontaneously Hypertensive Rat
LI Zhenbo, ZHAO Guangsheng
(Shanghai Institute of Hypertension, Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025)
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective To observe the effect of L-Phenylalanine on proliferation of myocardial fibroblast in spontaneosly hypertensive rat.Methods Amino acids in different concerntration were added to myocardial fibroblast cultured from 1 day-old spontaneously hypertensive rat for a defined time.The3H-thymidine incorporation was applied to reflect the fibroblasts proliferation activity with counts of3H-thymidine per minute divided by the number of fibroblasts.Result The DNA synthesis/cell count were decreased with the Phenylalanine in a dose dependet manner, but not with tyrosine and histidine.Conclusion L-Phenylalanine inhibited the proliferation of myocardial fibroblast in spontaneously hypertensive rat, which may explain the proven cases of phenylalanine preventing blood pressure rise and myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rat.
, http://www.100md.com
Key Words L-Phenylalanine;Spontaneously hypertensive rat;myocardial fibroblast cell
高血压时病理性肥厚的心肌组织都有不同程度的纤维化。表现为心肌细胞肥大和冠脉血管周围的胶原沉积，以及心肌组织细胞外间质胶原的沉积增多。后者主要由心肌组织成纤维细胞及其所分泌的胶原增多所引起[1]。为了探索L-苯丙氨酸预防自发性高血压大鼠(SHR)血压升高和心肌肥厚[2]和有效地预防和逆转高血压患者正常血压子女所存在的遗传性心脏异常性变化[3]的作用机制，观察L-苯丙氨酸对SHR心肌组织中的心肌成纤维细胞及其分泌胶原的影响，从细胞水平探索L-苯丙氨酸预防心肌肥厚发生的机理，我们以SHR的心肌成纤维细胞为实验材料，采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入技术和细胞计数的方法分别观察L-苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸对心肌成纤维细胞增生作用的影响。
, 百拇医药
MATERIALS AND METHODS
小牛血清白蛋白：购自中国科学院上海生化研究所。II型胶原酶、DNase、台盼蓝、PPO：购自美国Sigma化学公司。DMEM培养基，胎牛血清：购自美国Gibcol BrlI公司。L-苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸为美国Sigma公司产品。50 ml培养瓶和培养板为丹麦Nucon公司产品。3H-胸腺嘧啶核苷：购自中国科学院上海原子能研究所。液闪计数器：美国Bio-Rad公司产品。组织培养箱：美国Precision Scientific公司生产。1天龄的SHR乳鼠：由上海市高血压研究所动物室提供。
试剂配制：0.3%Ⅱ型胶原酶：取Ⅱ型胶原酶0.3 g，小牛血清白蛋白0.2 g，溶于经高压消毒的无钙镁的Hanks液中，摇匀，置4℃冰箱中备用。0.05%的胰蛋白酶：取胰蛋白酶0.05 g，加入经高压消毒的无钙镁的Hanks液少许,再加入0.01克的DNase,混匀,定容至100 ml，置于4℃冰箱中备用。DMEM培养液：取1袋DMEM培养粉，按要求加入所需容量三蒸水，调定pH值至7.3，以无菌滤器滤过，无菌分装，按需加入灭活的胎牛血清，置于-30℃冰箱保存备用。
, http://www.100md.com
心肌成纤维细胞的培养与鉴定：采用Simpson P.的方法进行[4]，取1天龄自发性高血压乳鼠3只，常规体表消毒，开胸取其心脏，将全心剪成3块～4块，置于无钙镁的Hanks液中，洗净血迹，置于直径2 cm的无菌玻璃平皿中，以虹膜剪将其剪成1 mm3大小，加入含0.3%Ⅱ型胶原酶的2%小牛血清白蛋白溶液少许，使之浸盖全部心肌组织，加盖后，置于40 rpm的小型摇床上，放入37℃ 5%CO2的培养箱中3分钟，使心肌组织变软。取出后，将平皿中的液体吸弃。继后加入0.05%胰蛋白酶和0.01%DNase混合液约1 ml，以完全浸没组织块为止。以吸管轻轻吹吸组织块，使之散开，加盖，置于培养箱的摇床上，以与前同样的频率振摇3分钟。期间，可取出平皿置于倒置显微镜下观察，使细胞呈单个分散状即可。将消化下的心肌细胞以吸管轻轻吸出，置于用冰预冷的含20%胎牛血清的DMEM培养液中混匀。反复消化和收集心肌组织细胞5次～6次，将收集的细胞悬液4℃，1 000 rpm离心5 min，弃上清，细胞沉淀以含20%胎牛血清的DMEM培养液重新洗涤一次，以同样条件离心，弃上清液。在沉淀的细胞中加入5 ml 20%胎牛血清的DMEM培养液，混匀，放入50 ml培养瓶中于标准条件下温育40 min取出，使成纤维细胞充分贴壁，将培养瓶中的细胞悬液全部倾弃后，再向培养瓶中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液5 ml，旋好瓶盖，置37℃，5%CO2培养箱中，至细胞融合时，以0.2%胰蛋白酶消化后传代。以P3代细胞为实验材料。
, 百拇医药
采用β-actin和VⅢ因子荧光抗体进行鉴定,培养细胞95%均呈阴性反应,证明为心肌成纤维细胞。
心肌成纤维细胞3H-胸腺嘧啶核苷掺入及细胞生长计数：参照Raghvendra K.D和Chen Shi 的方法进行[5,6]。
收集P3代细胞于一培养瓶中,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,适当稀释并混匀，以台盼蓝染色计算活细胞的百分率,调节其浓度,使活细胞数为105/ml,取0.5 ml细胞悬液于24孔细胞培养板中,使细胞分散均匀,于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞生长至融合状态。之后，吸弃培养液，加入0.4%胎牛血清的DMEM培养液0.5 ml，置培养箱中48小时,使细胞进入G0期。之后，吸弃培养液,在每一培养孔中加入20%胎牛血清的DMEM培养液和干预药物,使L-苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸的浓度依次为0、5、10、15、20、25 mmol。每种药物的每个浓度均做5个复孔,混匀,置37℃培养20小时。届时,吸弃培养液,加入0.5 ml含20%胎牛血清的DMEM培养液和1 μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，每种药物留5个孔不加同位素作为空白对照。温育4小时。届时,将培养液吸弃于一放射性废液收集瓶中,以0.2%胰蛋白酶消化细胞并计数，收集每一个培养孔中的细胞于0.22 μm的醋酸纤维滤膜上,依次以3ml无钙镁的PBS、3 ml6%(W/V)三氯醋酸和3ml无水乙醇洗膜.将膜置于80℃烘箱中2小时,取出置于液闪瓶中，加入6 ml 0.5%PPO二甲苯溶液，放置过夜，测cpm值，记录每5×104个细胞的cpm值。测定值以
±s表示。两相邻浓度之间的cpm值和细胞增长数目的比较采用t检验。P<0.005为有显著性差异。
, 百拇医药
RESULTS
1 随着L-苯丙氨酸浓度的增加，心肌成纤维细胞DNA的合成减少。而酪氨酸对心肌成纤维细胞的DNA合成有轻微的刺激作用，组氨酸对之无影响，如Fig 1。
图1 L-苯丙氨酸特异性抑制心肌成纤维细胞DNA的合成
Fig 1 DNA synthesis of myocardial fibroblasts inhibited by L-phenylalanine
2 随着L-苯丙氨酸浓度的增加，心肌成纤维细胞数目减少，而酪氨酸和组氨酸无影响，如Fig 2。
, 百拇医药
图2 L-苯丙氨酸特异性抑制SHR心肌成纤维细胞增殖
Fig 2 Myocardial fibroblasts proliferation was inhibited by L-phenylalanine
DISCUSSION
心肌组织的细胞外间隙由细胞外间质所填充。胶原蛋白是细胞外间质的主要成分。胶原蛋白的自然降解率极低，合成、分泌和降解之间存在着动态平衡[7]。因此，心肌成纤维细胞的增生和其生物学活性决定着心肌组织细胞外间质胶原的生成和降解而最终影响心肌肥厚的发生与否。高血压时的压力负荷和体液因素是引起心肌肥厚的重要因素，从研究结果可以看出，L-苯丙氨酸不仅可以通过预防升压而防治SHR心肌肥厚，而且可以通过其直接抑制作用使胶原蛋白合成减少而发挥预防心肌肥厚的作用。L-苯丙氨酸抑制心肌成纤维细胞增生作用的机理尚不清楚。推测可能作用于心肌成纤维细胞增生过程的信号传递过程使细胞内相关原癌基因的表达减弱或终止有关[8]。为了证明L-苯丙氨酸对心肌成纤维细胞的特异性增生抑制作用，我们选取了与L-苯丙氨酸代谢有关的L-酪氨酸和不相关的L-组氨酸作对照。结果证明，L-苯丙氨酸对心肌成纤维细胞的增生抑制具有特异性。我们的结论认为，L-苯丙氨酸以其本身的作用特异性地直接抑制心肌成纤维细胞的增生而减少心肌细胞外间质中胶原和弹性蛋白的合成和分泌，可能是其发挥预防心肌肥厚作用的主要机制。
, http://www.100md.com
*:国家自然科学基金资助课题(N0.39470626)
REFERENCES
1 Krzesinski J.M, Rorive G., Gauwenberge H.V., Hypertension and ventricular hypertrophy[J] Acta Cardiologica 1996；2:143-154
2 赵光胜，顾天华，陈庄.苯丙氨酸预防自发性高血压大鼠升压的实验研究[J]中国慢性病预防与控制 1992,1(2):15～18
3 赵光胜，邱慧丽，范明昌,等.苯丙氨酸对高血压病后代的遗传性心脏改变的作用[J] 中华医学杂志 1997，77(1):58～61
4 Simpson P., Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating non-myocardial cells:Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol[J]Cir Res 1982；50:101-116
, http://www.100md.com
5 Raghvendra K.D,Vasodilator-derived nitric oxide inhibits fetal calf serum and angiotension Ⅱ-induced growth of renal arteriolar smooth muscle cells[J]J of Pharma and Experi Terapeutics 1994；269(1):402
6 Chen Shi, Monteis G.R,Roufogalis B.D,Characterization of enhanced45Ca2+efflux in cultured vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rat[J]Ame J Hypertens 1995；8:1015
7.Gibbons G.H, Dzau V.J.The emerging concept of vascular remodeling[J]New Engl Med 1996,330(20):1431-1438
收稿日期：1998-12-01, 百拇医药
单位：赵光胜：上海第二医科大学附属瑞金医院上海市高血压研究所 200025；李振波：博士生现在中国医学科学院北京天坛医院(100050)
关键词：L-苯丙氨酸；自发性高血压大鼠；心肌成纤维细胞；DNA合成；细胞培养
高血压杂志990227
目的 旨在观察L-苯丙氨酸对自发性高血压大鼠心肌成纤维细胞的增殖作用的影响。方法 取1天龄自发性高血压大鼠心脏组织培养心肌成纤维细胞,分别以不同浓度的L-苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸干预一定时间后，利用3H-胸腺嘧啶掺入技术和细胞计数测定各不同浓度的氨基酸对心肌成纤维细胞DNA合成和细胞增殖数目的影响。结果 随着L-苯丙氨酸浓度的增加，心肌成纤维细胞的DNA合成量减少，细胞增殖数目减低。而L-酪氨酸和组氨酸随着浓度的增加对心肌成纤维细胞DNA的合成量和细胞增殖数目无影响。结论 L-苯丙氨酸可以特异性地抑制SHR心肌成纤维细胞的增殖。
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中图分类号：N33;Q2-33;R331.3;R972 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)02-0163-03
L-Phenylalanine Specifically Inhibited the Proliferation of Myocardial Fibroblast in Spontaneously Hypertensive Rat
LI Zhenbo, ZHAO Guangsheng
(Shanghai Institute of Hypertension, Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025)
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ABSTRACT Objective To observe the effect of L-Phenylalanine on proliferation of myocardial fibroblast in spontaneosly hypertensive rat.Methods Amino acids in different concerntration were added to myocardial fibroblast cultured from 1 day-old spontaneously hypertensive rat for a defined time.The3H-thymidine incorporation was applied to reflect the fibroblasts proliferation activity with counts of3H-thymidine per minute divided by the number of fibroblasts.Result The DNA synthesis/cell count were decreased with the Phenylalanine in a dose dependet manner, but not with tyrosine and histidine.Conclusion L-Phenylalanine inhibited the proliferation of myocardial fibroblast in spontaneously hypertensive rat, which may explain the proven cases of phenylalanine preventing blood pressure rise and myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rat.
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Key Words L-Phenylalanine;Spontaneously hypertensive rat;myocardial fibroblast cell
高血压时病理性肥厚的心肌组织都有不同程度的纤维化。表现为心肌细胞肥大和冠脉血管周围的胶原沉积，以及心肌组织细胞外间质胶原的沉积增多。后者主要由心肌组织成纤维细胞及其所分泌的胶原增多所引起[1]。为了探索L-苯丙氨酸预防自发性高血压大鼠(SHR)血压升高和心肌肥厚[2]和有效地预防和逆转高血压患者正常血压子女所存在的遗传性心脏异常性变化[3]的作用机制，观察L-苯丙氨酸对SHR心肌组织中的心肌成纤维细胞及其分泌胶原的影响，从细胞水平探索L-苯丙氨酸预防心肌肥厚发生的机理，我们以SHR的心肌成纤维细胞为实验材料，采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入技术和细胞计数的方法分别观察L-苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸对心肌成纤维细胞增生作用的影响。
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MATERIALS AND METHODS
小牛血清白蛋白：购自中国科学院上海生化研究所。II型胶原酶、DNase、台盼蓝、PPO：购自美国Sigma化学公司。DMEM培养基，胎牛血清：购自美国Gibcol BrlI公司。L-苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸为美国Sigma公司产品。50 ml培养瓶和培养板为丹麦Nucon公司产品。3H-胸腺嘧啶核苷：购自中国科学院上海原子能研究所。液闪计数器：美国Bio-Rad公司产品。组织培养箱：美国Precision Scientific公司生产。1天龄的SHR乳鼠：由上海市高血压研究所动物室提供。
试剂配制：0.3%Ⅱ型胶原酶：取Ⅱ型胶原酶0.3 g，小牛血清白蛋白0.2 g，溶于经高压消毒的无钙镁的Hanks液中，摇匀，置4℃冰箱中备用。0.05%的胰蛋白酶：取胰蛋白酶0.05 g，加入经高压消毒的无钙镁的Hanks液少许,再加入0.01克的DNase,混匀,定容至100 ml，置于4℃冰箱中备用。DMEM培养液：取1袋DMEM培养粉，按要求加入所需容量三蒸水，调定pH值至7.3，以无菌滤器滤过，无菌分装，按需加入灭活的胎牛血清，置于-30℃冰箱保存备用。
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心肌成纤维细胞的培养与鉴定：采用Simpson P.的方法进行[4]，取1天龄自发性高血压乳鼠3只，常规体表消毒，开胸取其心脏，将全心剪成3块～4块，置于无钙镁的Hanks液中，洗净血迹，置于直径2 cm的无菌玻璃平皿中，以虹膜剪将其剪成1 mm3大小，加入含0.3%Ⅱ型胶原酶的2%小牛血清白蛋白溶液少许，使之浸盖全部心肌组织，加盖后，置于40 rpm的小型摇床上，放入37℃ 5%CO2的培养箱中3分钟，使心肌组织变软。取出后，将平皿中的液体吸弃。继后加入0.05%胰蛋白酶和0.01%DNase混合液约1 ml，以完全浸没组织块为止。以吸管轻轻吹吸组织块，使之散开，加盖，置于培养箱的摇床上，以与前同样的频率振摇3分钟。期间，可取出平皿置于倒置显微镜下观察，使细胞呈单个分散状即可。将消化下的心肌细胞以吸管轻轻吸出，置于用冰预冷的含20%胎牛血清的DMEM培养液中混匀。反复消化和收集心肌组织细胞5次～6次，将收集的细胞悬液4℃，1 000 rpm离心5 min，弃上清，细胞沉淀以含20%胎牛血清的DMEM培养液重新洗涤一次，以同样条件离心，弃上清液。在沉淀的细胞中加入5 ml 20%胎牛血清的DMEM培养液，混匀，放入50 ml培养瓶中于标准条件下温育40 min取出，使成纤维细胞充分贴壁，将培养瓶中的细胞悬液全部倾弃后，再向培养瓶中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液5 ml，旋好瓶盖，置37℃，5%CO2培养箱中，至细胞融合时，以0.2%胰蛋白酶消化后传代。以P3代细胞为实验材料。
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采用β-actin和VⅢ因子荧光抗体进行鉴定,培养细胞95%均呈阴性反应,证明为心肌成纤维细胞。
心肌成纤维细胞3H-胸腺嘧啶核苷掺入及细胞生长计数：参照Raghvendra K.D和Chen Shi 的方法进行[5,6]。
收集P3代细胞于一培养瓶中,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,适当稀释并混匀，以台盼蓝染色计算活细胞的百分率,调节其浓度,使活细胞数为105/ml,取0.5 ml细胞悬液于24孔细胞培养板中,使细胞分散均匀,于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞生长至融合状态。之后，吸弃培养液，加入0.4%胎牛血清的DMEM培养液0.5 ml，置培养箱中48小时,使细胞进入G0期。之后，吸弃培养液,在每一培养孔中加入20%胎牛血清的DMEM培养液和干预药物,使L-苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸的浓度依次为0、5、10、15、20、25 mmol。每种药物的每个浓度均做5个复孔,混匀,置37℃培养20小时。届时,吸弃培养液,加入0.5 ml含20%胎牛血清的DMEM培养液和1 μCi的3H-胸腺嘧啶核苷，每种药物留5个孔不加同位素作为空白对照。温育4小时。届时,将培养液吸弃于一放射性废液收集瓶中,以0.2%胰蛋白酶消化细胞并计数，收集每一个培养孔中的细胞于0.22 μm的醋酸纤维滤膜上,依次以3ml无钙镁的PBS、3 ml6%(W/V)三氯醋酸和3ml无水乙醇洗膜.将膜置于80℃烘箱中2小时,取出置于液闪瓶中，加入6 ml 0.5%PPO二甲苯溶液，放置过夜，测cpm值，记录每5×104个细胞的cpm值。测定值以
±s表示。两相邻浓度之间的cpm值和细胞增长数目的比较采用t检验。P<0.005为有显著性差异。, 百拇医药
RESULTS
1 随着L-苯丙氨酸浓度的增加，心肌成纤维细胞DNA的合成减少。而酪氨酸对心肌成纤维细胞的DNA合成有轻微的刺激作用，组氨酸对之无影响，如Fig 1。
图1 L-苯丙氨酸特异性抑制心肌成纤维细胞DNA的合成
Fig 1 DNA synthesis of myocardial fibroblasts inhibited by L-phenylalanine
2 随着L-苯丙氨酸浓度的增加，心肌成纤维细胞数目减少，而酪氨酸和组氨酸无影响，如Fig 2。
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图2 L-苯丙氨酸特异性抑制SHR心肌成纤维细胞增殖
Fig 2 Myocardial fibroblasts proliferation was inhibited by L-phenylalanine
DISCUSSION
心肌组织的细胞外间隙由细胞外间质所填充。胶原蛋白是细胞外间质的主要成分。胶原蛋白的自然降解率极低，合成、分泌和降解之间存在着动态平衡[7]。因此，心肌成纤维细胞的增生和其生物学活性决定着心肌组织细胞外间质胶原的生成和降解而最终影响心肌肥厚的发生与否。高血压时的压力负荷和体液因素是引起心肌肥厚的重要因素，从研究结果可以看出，L-苯丙氨酸不仅可以通过预防升压而防治SHR心肌肥厚，而且可以通过其直接抑制作用使胶原蛋白合成减少而发挥预防心肌肥厚的作用。L-苯丙氨酸抑制心肌成纤维细胞增生作用的机理尚不清楚。推测可能作用于心肌成纤维细胞增生过程的信号传递过程使细胞内相关原癌基因的表达减弱或终止有关[8]。为了证明L-苯丙氨酸对心肌成纤维细胞的特异性增生抑制作用，我们选取了与L-苯丙氨酸代谢有关的L-酪氨酸和不相关的L-组氨酸作对照。结果证明，L-苯丙氨酸对心肌成纤维细胞的增生抑制具有特异性。我们的结论认为，L-苯丙氨酸以其本身的作用特异性地直接抑制心肌成纤维细胞的增生而减少心肌细胞外间质中胶原和弹性蛋白的合成和分泌，可能是其发挥预防心肌肥厚作用的主要机制。
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*:国家自然科学基金资助课题(N0.39470626)
REFERENCES
1 Krzesinski J.M, Rorive G., Gauwenberge H.V., Hypertension and ventricular hypertrophy[J] Acta Cardiologica 1996；2:143-154
2 赵光胜，顾天华，陈庄.苯丙氨酸预防自发性高血压大鼠升压的实验研究[J]中国慢性病预防与控制 1992,1(2):15～18
3 赵光胜，邱慧丽，范明昌,等.苯丙氨酸对高血压病后代的遗传性心脏改变的作用[J] 中华医学杂志 1997，77(1):58～61
4 Simpson P., Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating non-myocardial cells:Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol[J]Cir Res 1982；50:101-116
, http://www.100md.com
5 Raghvendra K.D,Vasodilator-derived nitric oxide inhibits fetal calf serum and angiotension Ⅱ-induced growth of renal arteriolar smooth muscle cells[J]J of Pharma and Experi Terapeutics 1994；269(1):402
6 Chen Shi, Monteis G.R,Roufogalis B.D,Characterization of enhanced45Ca2+efflux in cultured vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rat[J]Ame J Hypertens 1995；8:1015
7.Gibbons G.H, Dzau V.J.The emerging concept of vascular remodeling[J]New Engl Med 1996,330(20):1431-1438
收稿日期：1998-12-01, 百拇医药