甲基莲心碱对心肌细胞Ina、Ica-L及稳态外向K+电流的影响*
作者：王嘉陵 宗贤刚 姚伟星 江明性
单位：(同济医科大学药理学教研室，武汉 430030)
关键词：甲基莲心碱；心室肌细胞；膜片钳技术；L型钙电流；钠电流
摘要 目的 为证明甲基莲心碱
摘要 目的 为证明甲基莲心碱(Neferine, Nef)对单个心肌细胞离子通道电流的影响及抗心律失常作用的离子通道机制。方法 采用全细胞记录膜片钳技术，记录了Nef对培养大鼠心室肌细胞钠电流(INa)及豚鼠心室肌细胞动作电位、INa、L型钙电流(ICa-L)及稳态外向K+电流的影响。结果 Nef 30，100μmol.L-1明显抑制培养大鼠心室肌细胞INa，分别从对照水平的(3.4±0.7) nA降至(2.1±0.5)和(0.4±0.2) nA。Nef 10μmol.L-1可降低豚鼠心室肌细胞动作电位振幅、静息电位，延长动作电位时程。Nef 10，30μmol.L-1分别使豚鼠心室肌细胞INa及ICa-L从给药前的(7.9±2.1) nA和(689±243) pA降至(4.0±1.4)、(1.3±0.6) nA和 (374±172)、(109±67) pA。Nef 10μmol.L-1还抑制INa、稳态外向K+电流和ICa-L的I-V曲线并使后者的峰值电流电位略右移。结论 Nef有钠、L型钙通道阻滞作用并抑制稳态外向K+电流，这些可解释其广泛的抗心律失常作用机制。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R 284.1； R 541.705； R 972.2
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0357-04
Effects of neferine on INa，ICa-L and
steady-state outward K+ current of ventricular myocytes
WANG Jia-Ling, ZONG Xian-Gang, YAO Wei-Xin，JIANG Ming-Xing
(Dept of Pharmacology, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
, 百拇医药
ABSTRACT AIM To evaluate the effects of neferine (Nef) on the action potentials, sodium current (INa), L-type calcium current (ICa-L) and steady-state outward K+ current of the ventricular myocardial cells. METHODS The whole cell recording patch clamp technique was used in cultured rat cardiac cells and isolated guinea pig ventricular myocytes. RESULTS Nef 30，100μmol.L-1 could inhibit the INa of cultured rat cardiac cells from (3.4±0.7) nA as control to (2.1±0.5) and (0.4±0.2) nA respectively. Nef 10μmol.L-1 could obviously reduce the resting potentials, action potential amplitude and prolong the action potential duration of guinea pig ventricular myocytes. Nef 10, 30 μmol.L-1 decreased INa and ICa-L respectively from (7.9±2.1) nA and (689±243) pA as control level to (4.0±1.4), (1.3±0.6) nA and (374±172)、(109±67) pA. Nef 10μmol.L-1 could also inhibit the I-V curves of INa , Steady-state outward K+ current and ICa-L and slightly shift the maximal current potential of the latter to the right. CONCLUSION Nef has blocking actions on sodium and calcium channel and inhibit steady-state outward K+ currents, which may explain the mechanism of extensive antiarrhythmic actions of Nef.
, http://www.100md.com
KEY WORDS neferine; ventricular myocyte; whole cell recording patch clamp; L-calcium channel current; sodium channel current
甲基莲心碱(neferine, Nef)系从中药莲子心中提取纯化的一种活性单体生物碱，属双苄基异喹啉类[1]。Nef具有抗多种实验性心律失常作用，它降低快及慢反应动作电位振幅(Action potential amplitude, APA)、零相最大上升速率(Maximum velocity of 0 phase depolarization, Vmax)和静息电位(Resting potential, RP)，延长动作电位时程(Action potential duration, APD)及窦房结细胞动作电位的窦房结周长[2](Sinus cycle length, SCL)；其抗心律失常作用机制可能与阻滞Na+、K+、Ca2+跨膜转运有关[3]；Nef还降低血压、抗血小板聚集[4]等，这些也与其抗钙作用[5]有关。常规电生理法难以精确区分Nef对Na+、K+、Ca2+电流的阻滞作用，故本文采用全细胞膜片钳技术，研究了Nef对钠电流(Sodium current,INa)、L型钙电流(L-type calcium current,ICa-L)、稳态外向K+电流的影响，旨在从细胞通道水平确证其作用，探讨其抗心律失常作用机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药品 甲基莲心碱(neferine)由本教研室植化组提供，波谱及理化常数与文献[1]相符。河豚毒素(TTX)为青岛海洋研究所产品；维拉帕米(verapamil, Ver)为Knoll AG公司产品；四乙基铵(TEA)为Aldrich 公司产品；lemakalim(Lema)为Beecham公司产品；牛磺酸(taurine) 为Fluka公司产品；胶原酶I型(collagenase type I)、奎尼丁(quinidine,Qui)及HEPES为Sigma公司产品。培养大鼠心室肌细胞所用试剂同文献[6]，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 心室肌细胞及全细胞电流记录
1.2.1 培养大鼠心室肌细胞及电流记录 按文献[6]法分离、培养新生大鼠心室肌细胞，用标准膜片钳技术，经L/M-EPC 7放大器(List-Eletrconic)记录全细胞INa。细胞外液(mmol.L-1) ：NaCl 69，CsCl 69, MgCl2 2，KCl 5.4，CaCl2 0.1, 葡萄糖10，HEPES 10, pH 7.3；电极内液：CsCl 108, NaCl 14，MgCl2 2，CaCl2 1.0, EDTA 11，葡萄糖10，HEPES 10, pH 7.3。
, 百拇医药
1.2.2 豚鼠心室肌细胞及电流记录 豚鼠(同济医科大学实验动物部提供)，体重(246±38) g，♀♂兼用，同文献[7]法配制各种溶液，进行Langendorff心脏灌流、用酶法(胶原酶I型)分离心室肌细胞；拉制、抛光电极，电极阻抗1.5～2.5 MΩ。全细胞方式记录动作电位(Action potential, AP)及各种全细胞电流。记录AP及INa电极内液(mmol.L-1) ：KCl 120, NaCl 10，CaCl2 1.0，Mg-ATP 5.0, EDTA 11, HEPES 10, 用KOH调节pH至7.3；ICa-L电极内液：CsCl 120, NaCl 1.0, CaCl2 1.0, Mg-ATP 5.0, EDTA 11, HEPES 10, CsOH调节pH至7.3；钾电流电极内液：KCl 45, K-Aspartate 85, Na-Pyruate 5, MgCl2 4, K2-ATP 3, EDTA 10，HEPES 10, 葡萄糖11, 用KOH调节pH至7.3。
, http://www.100md.com
1.3 统计处理 实验数据用
±s表示, 显著性检验采用配对t检验。
2 结果
2.1 Nef对培养大鼠心室肌细胞INa的影响 保持电位(holding potential,Vh)为-100 mV，去极至-30 mV，持续时间100 ms，可记录到大鼠心室肌细胞INa。用双微管灌流系统，细胞外给药，如图1a所示，Nef可时间依赖性地抑制该电流；Nef 30,100μmol.L-1分别使INa从对照水平的(3.4±0.7) nA降至(2.1±0.5) nA和(0.4±0.2) nA(3只大鼠，5个细胞, P<0.05)，(见图1b)。
, http://www.100md.com
Fig 1 (1a) The time-effect curve of Nef 30μmol.L-1 and (1b) the inhibitory effect of Nef on maximum sodium channel current(INa), originally recording from a single cultured rat cardiac cell.
2.2 Nef对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响 室温下(22～25℃)，豚鼠心室肌细胞经台氏灌流5～10min，电流钳制模式，给予3ms, 0.5 Hz, 700～900pA的内向电流刺激，引出AP。细胞外液中给药，7min时，Nef 10μmol.L-1显著地降低RP和APA，分别从对照水平的(-73±6)和(-121±10) mV降至(-64±9) mV和(-111±12) mV；并明显延长APD50和APD90，分别从对照水平的(79±15)和(117±18) ms延长至(102±15)和(148±20) ms(n=6,P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.3 Nef对INa的影响 当Vh为-80 mV，去极从-70 mV至+30mV，持续时间30ms，刺激频率0.3 Hz时，可记录到尖锐向下(内向)、快速失活、幅度很大的电流，即为钠电流(fast sodium inward current, INa)。 TTX 2μmol.L-1, 5～7 min可抑制该电流，10μmol.L-1可取消该电流；该电流也能被Qui 100μmol.L-1所强烈抑制，故确认该电流为INa。细胞外液中累积给药，间隔5～7min, Nef 10，30μmol.L-1可抑制豚鼠心肌细胞的INa，分别使峰值INa(去极至-30mV)从给药前的(7.9±2.1) nA降至(4.0±1.4)和(1.3±0.5) nA(n=5,P<0.05)。Nef 10 μmol.L-1使电流-电压(I-V)曲线上移，但对峰值电流电位(Maximum current potential)无明显影响(见图2)。
, http://www.100md.com
Fig 2 Effects of Nef 10 μmol.L-1 on peak sodium current-voltage relationship in guinea pig ventricular myocytes. I-V curves were obtained in response to 30 ms voltage steps ranging from -70 mV to +30 mV from holding potential -80 mV.n=5
2.4 Nef对ICa-L的影响 当Vh为-40 mV去极化从-30mV至+40mV，持续时间300ms，频率0.3Hz时，可记录到一缓慢失活的内向电流(slow inward Ca2+ current), 即为ICa-L。该电流可为Ver 10μmol.L-1所取消，Cd2+200μmol.L-1所削弱，冲洗标本后可部分恢复，Nef 10, 30 μmol*L-1可使峰值ICa-L(去极至0mV)从(689±243) pA降至(374±172)和(109±67) pA(n=6, P<0.01)。 Nef 10μmol.L-1(5～7min)使I-V曲线上移，并使峰值电流电位向正电位方向移动(见图3)。
, http://www.100md.com
2.5 Nef对稳态外向K+电流的影响 Vh为-40mV去极化从-30 mV至+60mV，持续时间500ms，频率0.3 Hz时，可记录到一外向、于复极前(去极末期)趋于稳定平坦的电流，测定回到保持电位前的此电流与基线间的高度即为稳态外向K+电流(Steady-state outward K+ current)。该电流为TEA 300μmol.L-1所强烈抑制，而为Lema 30μmol.L-1所增大，故确认是稳态外向K+电流。 Nef 10μmol.L-1使稳态K+电流从给药前的(534±167) pA(去极至+30 mV)降至(289±103) pA (n=4, P<0.05)。Nef还显著降低豚鼠心肌细胞的稳态外向K+电流的I-V曲线(见图4)。
, 百拇医药
Fig 3 Effects of Nef 10 μmol*L-1 on peak L-type calcium current-voltage relationship in guinea pig ventricular myocytes. I-V curves were obtained in response to 300 ms voltage steps ranging from -30 mV to +60 mV from holding potential -40 mV(n=6)
Fig 4 Effects of Nef 10μmol.L-1 on peak steady-state outward potassium current-voltage relationship in guinea pig ventricular myocytes. I-V curves were obtained in response to 500 ms voltage steps ranging from -30 mV to +60 mV from holding potential -40 mV(n=5)
, 百拇医药
3 讨论
采用标准全细胞膜片钳技术研究药物对离子通道阻滞作用，常遇到的问题是发生Run-down现象,为减少因其发生而干扰对结果的判断，在豚鼠心室肌细胞实验中，数据取自给药后10min 内的结果，在此期间各电流衰减并不严重；经典的离子通道阻滞剂，在本实验条件下也大多在7～8 min显效，可见取自10min 内的数据较合理。另外，我们在电极内液中加入了EDTA(10mmol.L-1)和ATP(5mmol.L-1)，基本可保证电流在20min内衰减不足10%。在培养大鼠心室肌细胞INa实验中，采用双微管灌流系统给药，Nef迅速发挥作用，整个给药后记录过程仅3min，可排除Run-down现象的干扰，故实验结果应是可靠的。
为减少实验记录的失真，实验中特别注意选用中等大小的豚鼠心室肌细胞，其膜电容在80～160pF，与文献值相似。在本实验条件下，记录到的钙电流应是较纯净的L型钙电流，Nef 10 μmol.L-1即可抑制ICa-L，这与文献[5]认为其有较强的抗钙作用相符。Nef使L型钙电流的峰值电流电位略向正电位方向移动，提示其可能影响通道动力学特性。
, http://www.100md.com
稳态外向K+电流不是单一成分[8]，其中可能主要为延迟整流钾电流(IK)，后者又可分为快激活IK(IKr)和慢激活IK(IKs)；本实验条件下并不能加以区分；Nef 明显地抑制稳态外向K+电流，提示其对IKr有抑制作用，也不排除对IKs的抑制。Ikr过度抑制是长Q-T综合征(long-QT syndrome)发生的原因之一，而对Iks的适度抑制或将有利于防治长Q-T综合征。
Nef对3种不同的离子流均有抑制作用，这与先前的结果相吻合[2]，再次表明Nef广泛地抗心律失常作用机制与非特异性地阻滞离子通道有关，其应归属何类抗心律失常药，尚需通道动力学及希氏束电图实验结果补充，目前来看似难明确归于Ia类抗心律失常药。
, 百拇医药
*武汉市科委重点资助课题，No 94103048
作者简介：王嘉陵，男，48岁，博士，留美博士后，副教授，硕士导师，主要从事天然及合成药物的心血管药理研究
参考文献
1 王嘉陵，胡学民，蔡鸿生,尹武华. 莲子心中生物碱成分的研究. 中国中药杂志,1991,16:673～5
2 李贵荣，李孝光，吕富华. 甲基莲心碱对兔窦房结细胞和培养的乳鼠跨膜动作电位的影响.中国药理学报，1989；10：328～30
3 陈维洲.五年来我国心血管药理学研究概况. 见：陈维洲，陈 修，韩启德，苏定冯主编.心血管药理学进展，北京：人民卫生出版社，1995：24～5
4 史宵燕，胡文叔. 甲基莲心碱对高脂血症患者及健康成人血小板聚集的影响. 中国药理学通报，1998；14：237～9
, 百拇医药
5 潘竞先，陆 军，张建军et al.莲子心钙拮抗活性成分的研究. 北京医科大学学报，1989；21：401～3
6 Dugus M, Honerjager P, Masslich U. Tetrodotoxin block of single germitrine-actived sodium channels in culured rat cardiac cells. J Physiol, 1989；411:611～26
7 Sheng Y, Li XH, Yao WX et al. The effects of benzyltetrahydropalmatine(BTHP) on action potentials and the two components of delayed rectifying potassium currents in guinea pig ventricular myocytes. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1998; 7:214～6
8 Sanguinetti MC, Jurkiewiz NK. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differentials sensitivity to class Ⅲ antiarrhythmic agents. J Gen Physiol, 1990;96:195～215
1999-02-15收稿，1999-05-27修回, 百拇医药
单位：(同济医科大学药理学教研室，武汉 430030)
关键词：甲基莲心碱；心室肌细胞；膜片钳技术；L型钙电流；钠电流
摘要 目的 为证明甲基莲心碱
摘要 目的 为证明甲基莲心碱(Neferine, Nef)对单个心肌细胞离子通道电流的影响及抗心律失常作用的离子通道机制。方法 采用全细胞记录膜片钳技术，记录了Nef对培养大鼠心室肌细胞钠电流(INa)及豚鼠心室肌细胞动作电位、INa、L型钙电流(ICa-L)及稳态外向K+电流的影响。结果 Nef 30，100μmol.L-1明显抑制培养大鼠心室肌细胞INa，分别从对照水平的(3.4±0.7) nA降至(2.1±0.5)和(0.4±0.2) nA。Nef 10μmol.L-1可降低豚鼠心室肌细胞动作电位振幅、静息电位，延长动作电位时程。Nef 10，30μmol.L-1分别使豚鼠心室肌细胞INa及ICa-L从给药前的(7.9±2.1) nA和(689±243) pA降至(4.0±1.4)、(1.3±0.6) nA和 (374±172)、(109±67) pA。Nef 10μmol.L-1还抑制INa、稳态外向K+电流和ICa-L的I-V曲线并使后者的峰值电流电位略右移。结论 Nef有钠、L型钙通道阻滞作用并抑制稳态外向K+电流，这些可解释其广泛的抗心律失常作用机制。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R 284.1； R 541.705； R 972.2
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0357-04
Effects of neferine on INa，ICa-L and
steady-state outward K+ current of ventricular myocytes
WANG Jia-Ling, ZONG Xian-Gang, YAO Wei-Xin，JIANG Ming-Xing
(Dept of Pharmacology, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
, 百拇医药
ABSTRACT AIM To evaluate the effects of neferine (Nef) on the action potentials, sodium current (INa), L-type calcium current (ICa-L) and steady-state outward K+ current of the ventricular myocardial cells. METHODS The whole cell recording patch clamp technique was used in cultured rat cardiac cells and isolated guinea pig ventricular myocytes. RESULTS Nef 30，100μmol.L-1 could inhibit the INa of cultured rat cardiac cells from (3.4±0.7) nA as control to (2.1±0.5) and (0.4±0.2) nA respectively. Nef 10μmol.L-1 could obviously reduce the resting potentials, action potential amplitude and prolong the action potential duration of guinea pig ventricular myocytes. Nef 10, 30 μmol.L-1 decreased INa and ICa-L respectively from (7.9±2.1) nA and (689±243) pA as control level to (4.0±1.4), (1.3±0.6) nA and (374±172)、(109±67) pA. Nef 10μmol.L-1 could also inhibit the I-V curves of INa , Steady-state outward K+ current and ICa-L and slightly shift the maximal current potential of the latter to the right. CONCLUSION Nef has blocking actions on sodium and calcium channel and inhibit steady-state outward K+ currents, which may explain the mechanism of extensive antiarrhythmic actions of Nef.
, http://www.100md.com
KEY WORDS neferine; ventricular myocyte; whole cell recording patch clamp; L-calcium channel current; sodium channel current
甲基莲心碱(neferine, Nef)系从中药莲子心中提取纯化的一种活性单体生物碱，属双苄基异喹啉类[1]。Nef具有抗多种实验性心律失常作用，它降低快及慢反应动作电位振幅(Action potential amplitude, APA)、零相最大上升速率(Maximum velocity of 0 phase depolarization, Vmax)和静息电位(Resting potential, RP)，延长动作电位时程(Action potential duration, APD)及窦房结细胞动作电位的窦房结周长[2](Sinus cycle length, SCL)；其抗心律失常作用机制可能与阻滞Na+、K+、Ca2+跨膜转运有关[3]；Nef还降低血压、抗血小板聚集[4]等，这些也与其抗钙作用[5]有关。常规电生理法难以精确区分Nef对Na+、K+、Ca2+电流的阻滞作用，故本文采用全细胞膜片钳技术，研究了Nef对钠电流(Sodium current,INa)、L型钙电流(L-type calcium current,ICa-L)、稳态外向K+电流的影响，旨在从细胞通道水平确证其作用，探讨其抗心律失常作用机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药品 甲基莲心碱(neferine)由本教研室植化组提供，波谱及理化常数与文献[1]相符。河豚毒素(TTX)为青岛海洋研究所产品；维拉帕米(verapamil, Ver)为Knoll AG公司产品；四乙基铵(TEA)为Aldrich 公司产品；lemakalim(Lema)为Beecham公司产品；牛磺酸(taurine) 为Fluka公司产品；胶原酶I型(collagenase type I)、奎尼丁(quinidine,Qui)及HEPES为Sigma公司产品。培养大鼠心室肌细胞所用试剂同文献[6]，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 心室肌细胞及全细胞电流记录
1.2.1 培养大鼠心室肌细胞及电流记录 按文献[6]法分离、培养新生大鼠心室肌细胞，用标准膜片钳技术，经L/M-EPC 7放大器(List-Eletrconic)记录全细胞INa。细胞外液(mmol.L-1) ：NaCl 69，CsCl 69, MgCl2 2，KCl 5.4，CaCl2 0.1, 葡萄糖10，HEPES 10, pH 7.3；电极内液：CsCl 108, NaCl 14，MgCl2 2，CaCl2 1.0, EDTA 11，葡萄糖10，HEPES 10, pH 7.3。
, 百拇医药
1.2.2 豚鼠心室肌细胞及电流记录 豚鼠(同济医科大学实验动物部提供)，体重(246±38) g，♀♂兼用，同文献[7]法配制各种溶液，进行Langendorff心脏灌流、用酶法(胶原酶I型)分离心室肌细胞；拉制、抛光电极，电极阻抗1.5～2.5 MΩ。全细胞方式记录动作电位(Action potential, AP)及各种全细胞电流。记录AP及INa电极内液(mmol.L-1) ：KCl 120, NaCl 10，CaCl2 1.0，Mg-ATP 5.0, EDTA 11, HEPES 10, 用KOH调节pH至7.3；ICa-L电极内液：CsCl 120, NaCl 1.0, CaCl2 1.0, Mg-ATP 5.0, EDTA 11, HEPES 10, CsOH调节pH至7.3；钾电流电极内液：KCl 45, K-Aspartate 85, Na-Pyruate 5, MgCl2 4, K2-ATP 3, EDTA 10，HEPES 10, 葡萄糖11, 用KOH调节pH至7.3。
, http://www.100md.com
1.3 统计处理 实验数据用
±s表示, 显著性检验采用配对t检验。2 结果
2.1 Nef对培养大鼠心室肌细胞INa的影响 保持电位(holding potential,Vh)为-100 mV，去极至-30 mV，持续时间100 ms，可记录到大鼠心室肌细胞INa。用双微管灌流系统，细胞外给药，如图1a所示，Nef可时间依赖性地抑制该电流；Nef 30,100μmol.L-1分别使INa从对照水平的(3.4±0.7) nA降至(2.1±0.5) nA和(0.4±0.2) nA(3只大鼠，5个细胞, P<0.05)，(见图1b)。
, http://www.100md.com
Fig 1 (1a) The time-effect curve of Nef 30μmol.L-1 and (1b) the inhibitory effect of Nef on maximum sodium channel current(INa), originally recording from a single cultured rat cardiac cell.
2.2 Nef对豚鼠心室肌细胞动作电位的影响 室温下(22～25℃)，豚鼠心室肌细胞经台氏灌流5～10min，电流钳制模式，给予3ms, 0.5 Hz, 700～900pA的内向电流刺激，引出AP。细胞外液中给药，7min时，Nef 10μmol.L-1显著地降低RP和APA，分别从对照水平的(-73±6)和(-121±10) mV降至(-64±9) mV和(-111±12) mV；并明显延长APD50和APD90，分别从对照水平的(79±15)和(117±18) ms延长至(102±15)和(148±20) ms(n=6,P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.3 Nef对INa的影响 当Vh为-80 mV，去极从-70 mV至+30mV，持续时间30ms，刺激频率0.3 Hz时，可记录到尖锐向下(内向)、快速失活、幅度很大的电流，即为钠电流(fast sodium inward current, INa)。 TTX 2μmol.L-1, 5～7 min可抑制该电流，10μmol.L-1可取消该电流；该电流也能被Qui 100μmol.L-1所强烈抑制，故确认该电流为INa。细胞外液中累积给药，间隔5～7min, Nef 10，30μmol.L-1可抑制豚鼠心肌细胞的INa，分别使峰值INa(去极至-30mV)从给药前的(7.9±2.1) nA降至(4.0±1.4)和(1.3±0.5) nA(n=5,P<0.05)。Nef 10 μmol.L-1使电流-电压(I-V)曲线上移，但对峰值电流电位(Maximum current potential)无明显影响(见图2)。
, http://www.100md.com
Fig 2 Effects of Nef 10 μmol.L-1 on peak sodium current-voltage relationship in guinea pig ventricular myocytes. I-V curves were obtained in response to 30 ms voltage steps ranging from -70 mV to +30 mV from holding potential -80 mV.n=5
2.4 Nef对ICa-L的影响 当Vh为-40 mV去极化从-30mV至+40mV，持续时间300ms，频率0.3Hz时，可记录到一缓慢失活的内向电流(slow inward Ca2+ current), 即为ICa-L。该电流可为Ver 10μmol.L-1所取消，Cd2+200μmol.L-1所削弱，冲洗标本后可部分恢复，Nef 10, 30 μmol*L-1可使峰值ICa-L(去极至0mV)从(689±243) pA降至(374±172)和(109±67) pA(n=6, P<0.01)。 Nef 10μmol.L-1(5～7min)使I-V曲线上移，并使峰值电流电位向正电位方向移动(见图3)。
, http://www.100md.com
2.5 Nef对稳态外向K+电流的影响 Vh为-40mV去极化从-30 mV至+60mV，持续时间500ms，频率0.3 Hz时，可记录到一外向、于复极前(去极末期)趋于稳定平坦的电流，测定回到保持电位前的此电流与基线间的高度即为稳态外向K+电流(Steady-state outward K+ current)。该电流为TEA 300μmol.L-1所强烈抑制，而为Lema 30μmol.L-1所增大，故确认是稳态外向K+电流。 Nef 10μmol.L-1使稳态K+电流从给药前的(534±167) pA(去极至+30 mV)降至(289±103) pA (n=4, P<0.05)。Nef还显著降低豚鼠心肌细胞的稳态外向K+电流的I-V曲线(见图4)。
, 百拇医药
Fig 3 Effects of Nef 10 μmol*L-1 on peak L-type calcium current-voltage relationship in guinea pig ventricular myocytes. I-V curves were obtained in response to 300 ms voltage steps ranging from -30 mV to +60 mV from holding potential -40 mV(n=6)
Fig 4 Effects of Nef 10μmol.L-1 on peak steady-state outward potassium current-voltage relationship in guinea pig ventricular myocytes. I-V curves were obtained in response to 500 ms voltage steps ranging from -30 mV to +60 mV from holding potential -40 mV(n=5)
, 百拇医药
3 讨论
采用标准全细胞膜片钳技术研究药物对离子通道阻滞作用，常遇到的问题是发生Run-down现象,为减少因其发生而干扰对结果的判断，在豚鼠心室肌细胞实验中，数据取自给药后10min 内的结果，在此期间各电流衰减并不严重；经典的离子通道阻滞剂，在本实验条件下也大多在7～8 min显效，可见取自10min 内的数据较合理。另外，我们在电极内液中加入了EDTA(10mmol.L-1)和ATP(5mmol.L-1)，基本可保证电流在20min内衰减不足10%。在培养大鼠心室肌细胞INa实验中，采用双微管灌流系统给药，Nef迅速发挥作用，整个给药后记录过程仅3min，可排除Run-down现象的干扰，故实验结果应是可靠的。
为减少实验记录的失真，实验中特别注意选用中等大小的豚鼠心室肌细胞，其膜电容在80～160pF，与文献值相似。在本实验条件下，记录到的钙电流应是较纯净的L型钙电流，Nef 10 μmol.L-1即可抑制ICa-L，这与文献[5]认为其有较强的抗钙作用相符。Nef使L型钙电流的峰值电流电位略向正电位方向移动，提示其可能影响通道动力学特性。
, http://www.100md.com
稳态外向K+电流不是单一成分[8]，其中可能主要为延迟整流钾电流(IK)，后者又可分为快激活IK(IKr)和慢激活IK(IKs)；本实验条件下并不能加以区分；Nef 明显地抑制稳态外向K+电流，提示其对IKr有抑制作用，也不排除对IKs的抑制。Ikr过度抑制是长Q-T综合征(long-QT syndrome)发生的原因之一，而对Iks的适度抑制或将有利于防治长Q-T综合征。
Nef对3种不同的离子流均有抑制作用，这与先前的结果相吻合[2]，再次表明Nef广泛地抗心律失常作用机制与非特异性地阻滞离子通道有关，其应归属何类抗心律失常药，尚需通道动力学及希氏束电图实验结果补充，目前来看似难明确归于Ia类抗心律失常药。
, 百拇医药
*武汉市科委重点资助课题，No 94103048
作者简介：王嘉陵，男，48岁，博士，留美博士后，副教授，硕士导师，主要从事天然及合成药物的心血管药理研究
参考文献
1 王嘉陵，胡学民，蔡鸿生,尹武华. 莲子心中生物碱成分的研究. 中国中药杂志,1991,16:673～5
2 李贵荣，李孝光，吕富华. 甲基莲心碱对兔窦房结细胞和培养的乳鼠跨膜动作电位的影响.中国药理学报，1989；10：328～30
3 陈维洲.五年来我国心血管药理学研究概况. 见：陈维洲，陈 修，韩启德，苏定冯主编.心血管药理学进展，北京：人民卫生出版社，1995：24～5
4 史宵燕，胡文叔. 甲基莲心碱对高脂血症患者及健康成人血小板聚集的影响. 中国药理学通报，1998；14：237～9
, 百拇医药
5 潘竞先，陆 军，张建军et al.莲子心钙拮抗活性成分的研究. 北京医科大学学报，1989；21：401～3
6 Dugus M, Honerjager P, Masslich U. Tetrodotoxin block of single germitrine-actived sodium channels in culured rat cardiac cells. J Physiol, 1989；411:611～26
7 Sheng Y, Li XH, Yao WX et al. The effects of benzyltetrahydropalmatine(BTHP) on action potentials and the two components of delayed rectifying potassium currents in guinea pig ventricular myocytes. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1998; 7:214～6
8 Sanguinetti MC, Jurkiewiz NK. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differentials sensitivity to class Ⅲ antiarrhythmic agents. J Gen Physiol, 1990;96:195～215
1999-02-15收稿，1999-05-27修回, 百拇医药