箬叶多糖及其衍生物对小鼠艾滋病作用的研究
作者：陈春英 蒋 岩 周井炎 徐辉碧
单位：陈春英 现在中国科学院高能物理研究所核技术应用研究部博士后流动站，北京 100080；蒋 岩 中国预防医学科学院卫生部艾滋病参比试验室，北京 100052；周井炎 徐辉碧(华中理工大学化学系，武汉 430074)
关键词：箬叶多糖；硫酸酯多糖；硒酸酯多糖；艾滋病；抗氧化剂
中国药理学通报990415
摘要 目的 研究箬叶多糖及其衍生物硫酸酯多糖和硒酸酯多糖对小鼠艾滋病的治疗作用。方法 采用LP-BM5鼠白血病病毒(MuLV)感染C57 BL/6J小鼠的方法建立艾滋病模型。结果 硫酸酯多糖50mg.kg-1.d-1(ip)具有较好地抑制小鼠脾肿大、血清IgG增高的作用，硒酸酯多糖在两种给药方式中有一定的保护作用。此外，还首次发现感染小鼠出现GSH-Px活力下降，脂质过氧化产物升高，这与HIV感染的病人的症状是一致的，硒多糖对提高机体的抗氧化功能有较好的作用。多糖经硫酸酯化、硒酸酯化等化学修饰后，活性有不同程度的提高。结论 作为抗氧化剂和免疫增强剂的微量元素硒和多糖类可能对HIV感染的病人有一定的治疗作用。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R-332； R 512.91；R 979.5； R 979.9
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0336-05
Effects of Ruoye polysacchrides and their derivatives
on mice infected with LP-BM5 MuLV, a murine AIDS model
ZHOU Jing-Yan XU Hui-Bi
(Dept of Chemistry, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074)
, 百拇医药 CHEN Chun-Ying
Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080
JIANG Yan
Institute of Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medical Science, Beijing 100052
ABSTRACT AIM To report antiretrovial activities of polysaccharide(PS) isolated from Chinese traditional medicine Ruoye (Indocalamus tesselatus) grown in Enshi, Hubei and its derivative selenopolysaccharide (Se-PS) and sulfated polysaccharide (S-PS). Effect of these compounds on the development of murine AIDS (MAIDS) caused by the LP-BM5 murine leukemia virus (MuLV) was studied. METHOD C57BL/6J female mice were inoculated intraperitoneally (ip) with LP-BM5 murine virus and treated with drugs (ip or ig) every day. RESULTS S-PS 50 mg.kg-1 per day (ip) inhibited splenomegaly and serum IgG elevation, in agreement with AZT(10mg.kg-1.d-1,ig) 4 weeks later. In addition, Se-PS and S-PS could increase blood GSH-Px activity significantly, and only Se-PS decreased lipid peroxidative product of spleen effectively.CONCLUSION Antioxidant molecules may be of therapeutic value in the treatment of HIV-infected patients.
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KEY WORDS Indocalamus tesselatus polysaccharide; polysaccharide sulfate; polysaccharide selenate; AIDS; antioxidant
艾滋病，又称获得性免疫缺陷症，是一种由艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的严重传染病，被称为“超级肿瘤”。国内外开展了大量的抗艾滋病药物的开发和研究，至今无预防的疫苗和治愈的药物。目前，许多经硫酸酯化的多糖如香菇多糖、地衣多糖、右旋糖酐、裂褶菌多糖、木聚糖等的硫酸酯具有明显的抑制HIV活性[1]。硫酸右旋糖酐(DS)和多硫酸聚戊糖在美国已进行了Ⅰ期临床试验。对DS临床研究表明有增加P24抗原，血小板计数减少等副作用。人工合成的木聚糖硫酸酯(Hoe/Bay 946)在西德已试用于临床，给30名带病毒者连续治疗3 mon，12.5～50mg.kg-1给药，发现此药能很好地被患者耐受，获得满意的结果，但具有抗凝血活性的副作用[2]。日本Ajinomoto公司开发的curdlan硫酸酯(CRDS)是以1-3-β-D-葡萄糖为主链，分子质量8.1×104 u，硫含量14.1%的硫酸酯多糖，已进入Ⅰ期临床试验中，能很好地为病人所耐受。HIV病人静脉注射(iv)CRDS 7 d，剂量为每天每70 kg体重予40，100，140 mg，在高剂量CD4及CD8淋巴细胞显著增加，有些病例在1次剂量后计数增加5×108.L-1，在24 h后回到原来水平。其半衰期约为2 h[3]。因此，硫酸酯多糖对HIV-1具有较高的选择抑制作用，副作用小，是一类治疗艾滋病有发展前途的新药。但也存在着许多有待解决的问题，而在国内有关研究尚未见报道。
, 百拇医药
小鼠白血病病毒(murine leukemia virus, MuLV)LP-BM5株，与HIV同属逆转录病毒，以它感染C57BL/6小鼠，可使小鼠脾肿大，出现高蛋白血症，T、B细胞功能紊乱，肿瘤发生，淋巴结肿大等类似人艾滋病的症状，是模拟艾滋病的一种小动物模型。该模型重复性好，危险程度低，许多抗HIV的药物，如临床已使用的AZT、ddI、ddC等以此模型进行筛选评价，并且运用此模型研究AIDS的发病机制[4,5]。具有抗HIV作用的多糖类对此模型的作用还未见报道。
氧化应激与多种疾病的发生有着密切关系，如炎症、退行性神经疾病、动脉硬化、心肌损伤及衰老等与过多的自由基产生有关。活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)在HIV感染潜伏期的活化及疾病发展过程的作用已为许多研究者所重视，为抗氧化剂可能控制疾病发展过程及疾病的治疗带来新的思考。
体外抗艾滋病病毒(HIV)实验已表明硫酸酯化箬叶多糖具有更高的抑制HIV引起的CD4细胞病变性的作用[6]。在此基础上，本文采用LP-BM5 MuLV小鼠艾滋病为模型，首先以脾指数，ELISA法测定血清IgG含量作为临床及免疫指标，进一步研究箬叶多糖及其硫酸酯、硒酸酯在体内对小鼠艾滋病(MAIDS)的治疗作用；其次以谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、脂质过氧化物产物(TBARS)为重要参数，研究小鼠在感染及治疗后抗氧化水平的变化。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 C57BL/6J小鼠，♀，18～20g，北京医科大学实验动物科学部提供。
1.1.2 病毒株 采用小鼠LP-BM5白血病病毒，以G6细胞体外传代培养，培养上清作感染病毒，保存于-70℃。
1.1.3 药物 中药箬叶为禾本科植物箬竹的叶，箬叶多糖(PS)制备及硫酸酯(S-PS)的合成见文献[6]，含硫9.6%；其硒酸酯衍生物(Se-PS)，含硒1mg.g-1。
1.2 方法
1.2.1 病毒ID50滴定 取C57 BL/6敏感小鼠40只，♀♂各半，随机分组。病毒培养上清用RPMI-1640培养液稀释为1∶1，1∶10，1∶100，1∶1 000，1∶10 000，1∶100 000，1∶1 000 000，同时设对照组，病毒组每只接种0.5 ml不同浓度的病毒，对照组接种培养液0.5 ml。1 mon后观察淋巴结、脾脏，测定抗原IgG，并观察肿瘤发生，死亡情况。以脾指数增大2～3倍时的病毒稀释度为ID50(1×10-4)，并作为小鼠艾滋病模型的实验浓度。
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1.2.2 小鼠艾滋病模型的建立及药物治疗 取C57 BL/6小鼠160只，♀，随机分组，每组8只，共20个组。设正常对照组，病毒对照组，药物对照组，药物治疗组。病毒对照组与药物治疗组小鼠在d 1腹腔接种病毒0.5ml，其余接种等量培养液。采用两种给药方式灌胃(ig)及腹腔注射(ip)，每天1次，每只0.5ml，连续28d，正常对照组与病毒对照组给生理盐水。28d后，观察毛发光泽，淋巴结是否肿大，称体重，眼眶取血，无菌取脾，称重。
1.2.3 检测指标 血清IgG水平采用ELISA即双抗体间接夹心酶联免疫法[5]，取微量反应板，以pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释羊抗鼠IgG 200倍，包被每孔100μl，4℃过夜。以含体积分数为10%小牛血清的磷酸缓冲液(pH 7.2)封闭30 min，洗净后，扣干，每孔加入100 μl 1∶200稀释的血清样本，置于37℃ 120 min。洗净后，扣干，加入已标定效价1∶3 000稀释的HRP-羊抗鼠IgG 100 μl，置于37℃ 60 min。洗净后，扣干，加入100 μl显色剂邻苯二胺-H2O2置于37℃反应 20min。取出，加入50 μl l mol.L-1 H2SO4终止反应，于Bio-Rad 450型酶标仪测定490 nm的吸光度(OD)，以OD值表示血清IgG水平。
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1.2.4 抗氧化指标 5，5′-二硝基苯(DTNB)法测全血GSH-Px[7]；硫代巴比妥酸法测匀浆脂质过氧化产物(TBARS)[8]；邻苯三酚法测匀浆SOD活力[9]；Ellman法测脾匀浆谷胱甘肽(GSH)含量[10]。
2 结果
2.1 C57 BL/6小鼠感染LP-BM5 MuLV致MAIDS模型的建立 感染LP-BM5 MuLV的小鼠28d，体重较正常反应小鼠无明显变化，但感染小鼠脾脏肿大明显，重量增加，脾指数明显上升，ip与ig组与病毒对照组情况基本一致，ip组脾指数稍大些。如果接种时间更长，如45d、60d或72d，脾肿大越严重，45d起，出现淋巴结肿大，颈部、腹腔及胸腔内亦有明显的实体瘤生长，且随接种后时间的增加，肿瘤逐渐增多增大，至72d，所有感染小鼠均有肿瘤发生。
感染小鼠血清IgG明显增高，S-PS在ip或ig给药均可降低sIgG含量，ip Se-PS亦可显著降低IgG含量，结果与脾指数符合。感染小鼠IgG增加是由于多克隆B细胞被激活而导致。
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此外，还首次发现感染出现GSH-Px活力下降，脂质过氧化产物升高，这与HIV感染的病人的症状是一致的，在动物模型中还未见报道。小鼠感染LP-BM5 MuLV病毒28 d后，脾组织GSH含量降低(表3)。在猕猴感染猴免疫缺陷病毒1 wk内，也发现很快发生巯基缺乏，血清半胱氨酸和谷氨酸盐浓度也发生改变，且类似人类HIV感染，这表明动物病毒感染和HIV感染都可以发生巯基缺乏。GSH是细胞内主要的抗氧化剂，具有保护蛋白质巯基的还原状态，体外证实可抑制TNF-α以及活性氧类激活处于潜伏期的HIV进行转录和复制。
Tab 1 Effect of treatment on splenomegaly and serum IgG of C57 BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV (ig，
±s,n=8) Group
Dose
, http://www.100md.com
/mg.kg-1.d-1
Body weight
/g
Spleen weight
/mg
Spleen Index
/mg.g-1
IgG(OD)
Nc
19.6±1.0
62.1±11.8
, http://www.100md.com
3.17±0.57
1.266±0.233
PS
100
18.4±1.1
72.2±13.9
3.92±0.72
1.351±0.225
S-PS
50
18.6±0.6
80.1±9.6##
, 百拇医药
4.30±0.48##
1.323±0.109
Se-PS
100
19.0±1.1
88.6±30.1#
4.70±1.74#
AZT
10
19.1±1.3
79.9±18.6#
, 百拇医药
4.31±2.62#
1.298±0.098
IC
18.6±1.9
220.4±10.7##
11.83±0.89##
1.630±0.135##
PS+Infected
100
17.9±1.4
181.5±33.0**
, http://www.100md.com
10.07±10.7*
1.669±0.219
S-PS+infected
50
17.5±1.2
187.2±24.3**
10.61±1.24*
1.427±0.131**
Se-PS+Infected
100
, 百拇医药 18.6±1.9
194.2±35.8
10.11±1.74*
AZT+Infected
10
20.0±0.9
173.4±80.1**
8.61±4.12**
1.497±0.101*
NC: normal control, IC: infected control; #P<0.05，##P<0.01，vs normal control; *P<0.05，**P<0.01，vs infected controlTab 2 Effect of treatment on splenomegaly and serum IgG of C57BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV (ip，±s,n=8) Group
, 百拇医药
Dose
/mg.kg-1.d-1
Body weight
/g
Spleen weight
/mg
Spleen Index
/mg.g-1
IgG(OD)
NC
20.4±1.0
, 百拇医药
75.5±12.0
3.72±0.63
1.049±0.134
PS
100
20.7±2.6
101.4±16.1##
4.91±0.51##
S-PS
50
20.0±1.1
113.9±18.9##
, 百拇医药
5.66±0.67##
1.091±0.14
Se-PS
100
19.5±0.9
118.8±19.1##
6.70±0.8##
1.043±0.096
IC
20.8±0.9
264.5±24.5##
, 百拇医药
12.82±1.2##
1.275±0.138##
PS+Infected
100
20.7±0.7
246.3±26.2
11.95±1.42
S-PS+Infected
50
21.3±0.7
203.3±49.4**
, 百拇医药
9.54±2.37**
1.104±0.165*
Se-PS+Infected
100
20.8±1.2
228.6±38.7*
11.09±1.62*
1.121±0.103
NC: normal control, IC: infected control; ##P<0.01, vs NC；P<0.05，P<0.01, vs ICTab 3 Effect of treatment on SOD activity and GSH content of spleen
, 百拇医药
homogenate of C57BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV (ig，±s,n=8) Group
Dose/mg.kg-1.d-1
SOD/μmol.g-1 spleen
GSH/μg.kg-1 spleen
NC
3.85±0.41
4.96±5.2
, 百拇医药
PS
100
4.08±1.51
S-PS
50
3.05±1.25
Se-PS
4.55±1.29
IC
100
3.63±1.45
4.10±2.3#
, http://www.100md.com
PS+Infected
100
4.06±1.95
S-PS+Infected
50
4.43±0.66
Se-PS+Infected
100
4.45±1.60
NC: normal control, IC: infected control; #P<0.05, vs NC2.2 对C57 BL/6小鼠感染LP-BM5 MuLV致MAIDS的治疗作用 结果可以看出，随给药方式的不同，药物的治疗效果亦有所不同，这可能与药物的代谢途径、作用方式有关。S-PS则以ip方式有较好的抑制MuLV导致的脾肿大作用。PS与Se-PS的抑制作用在ig给药方式中比S-PS效果稍好。PS在ip给药方式中基本无作用，Se-PS在ig和ip两种方式中有一定的抑制作用。几种化合物抑制作用大小顺序为：ip给药，S-PS>Se-PS>PS; ig给药，Se-Ps>PS>S-PS。
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药物在体内对正常小鼠的血清IgG含量影响不大，说明4种物质在此条件下对体液免疫可能没有直接的促进作用(表1，2)。但是ip组与ig组比正常对照组小鼠脾脏器官增大，ip组尤为显著，其作用大小顺序为ip组：Se-PS>S-Ps>Ps；ig组：Se-PS>S-Ps, AZT>PS，表明4种物质对脾脏淋巴细胞增殖有促进作用，可增强小鼠细胞免疫功能。
多糖系列以ip方式施予可抑制感染小鼠GSH-Px活力下降，并保持正常的水平，以S-PS最好(P<0.05)，并且还降低脾组织脂质过氧化产物的生成。但S-PS仅对提高酶活力有作用。因此，在动物体内实验中，Se-PS具有比PS，S-PS更好的抗氧化作用，结果见图1，2。
Fig 1 Effect of treatment of whole blood GSH-Px activity
, 百拇医药
of C57 BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV(ip)
Fig 2 Effect of treatment on MDA content of spleen
homogenate of mice infected with LP-BM5 MuLV(ip)
3 讨论
自发现艾滋病至今已十多年，研制抗HIV药物已有数百种之多，但迄今正式经FDA批准，并为全球认为可临床应用的仅有3种，即叠氮胸苷(AZT)，双脱氧次黄苷(ddI)，双脱氧胞苷(ddC)，均存在严重的毒副作用，难以推广使用。
国外大量文献报道在HIV感染病人中，红细胞GSH-Px活力，血清Se、Zn含量显著下降，血浆GSH、巯基、Vit C含量也显著降低，而脂质过氧化产物显著上升，在发病的不同阶段(CDCⅡ，Ⅳ)，程度加深。在HIV感染病人机体中存在氧化不平衡，抗氧化剂的大量消耗[11，12]。硒与艾滋病的关系早在1987年开始逐渐引起人们的重视，在德国进行了几次短期的临床实验表明硒对艾滋病的治疗有一定疗效，但采用的亚硒酸钠形式的硒毒性较大，并且实验研究未见报道。一些使用抗氧化剂临床实验如植物中提取的抗氧化剂——Vit C、β胡萝卜素、硒等正在进行之中，有待进一步评价抗氧化剂在治疗人AIDS病中的作用。但这些实验往往局限于其中一种，而体内抗氧化剂的失调是多方面的。
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中国中医研究院[13]在坦桑尼亚采用多种中药煎剂治疗患者已初见苗头，而中药中的成分是非常复杂的，近年来从中药和天然药中提取生物碱、黄酮类、多糖及糖脂类、蛋白质类、抗生素类、胡萝卜素、维生素类等活性成分，其中大部分具有良好的抗氧化作用，体外实验表明某些成分可抑制病毒的激活、感染免疫细胞的程序性死亡或直接抑制HIV复制。我们以前的研究亦表明箬叶多糖类具有良好的抗氧化作用[14]。本文的结果表明病毒感染与机体的氧化损伤有一定的关系。
因此，作为免疫增强剂和抗氧化剂的微量元素硒，多糖类或者与其它抗氧化剂维生素E、维生素C、β胡萝卜素等与逆转录酶抑制剂AZT或ddC等联合使用，可能会对HIV感染的防治有一定的潜在的应用前景。
作者简介：陈春英，女，29岁，博士，副研究员；
蒋 岩，女，38岁，博士，副研究员
, 百拇医药
参考文献
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10 Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophy, 1959；82:70
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12 Markropoulos V, Buning T, Osthoff KS. Selenium-mediated inhibition of transcription factor NF-kB and HIV-1 LTR promoter activity. Arch Toxicol, 1996;70:277～80
13 吕维柏主编.中医治疗研究艾滋病实践论文汇编，北京：人民卫生出版社， 1992:17～25，153
14 陈春英，丁玉强，Elmahadi EA et al. 箬叶多糖对小鼠实验性四氯化碳致肝损伤的作用. 中国药理学与毒理学杂志， 1996；10(3)：237～8
1998-06-02收稿，1998-10-17修回, http://www.100md.com
单位：陈春英 现在中国科学院高能物理研究所核技术应用研究部博士后流动站，北京 100080；蒋 岩 中国预防医学科学院卫生部艾滋病参比试验室，北京 100052；周井炎 徐辉碧(华中理工大学化学系，武汉 430074)
关键词：箬叶多糖；硫酸酯多糖；硒酸酯多糖；艾滋病；抗氧化剂
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摘要 目的 研究箬叶多糖及其衍生物硫酸酯多糖和硒酸酯多糖对小鼠艾滋病的治疗作用。方法 采用LP-BM5鼠白血病病毒(MuLV)感染C57 BL/6J小鼠的方法建立艾滋病模型。结果 硫酸酯多糖50mg.kg-1.d-1(ip)具有较好地抑制小鼠脾肿大、血清IgG增高的作用，硒酸酯多糖在两种给药方式中有一定的保护作用。此外，还首次发现感染小鼠出现GSH-Px活力下降，脂质过氧化产物升高，这与HIV感染的病人的症状是一致的，硒多糖对提高机体的抗氧化功能有较好的作用。多糖经硫酸酯化、硒酸酯化等化学修饰后，活性有不同程度的提高。结论 作为抗氧化剂和免疫增强剂的微量元素硒和多糖类可能对HIV感染的病人有一定的治疗作用。
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ABSTRACT AIM To report antiretrovial activities of polysaccharide(PS) isolated from Chinese traditional medicine Ruoye (Indocalamus tesselatus) grown in Enshi, Hubei and its derivative selenopolysaccharide (Se-PS) and sulfated polysaccharide (S-PS). Effect of these compounds on the development of murine AIDS (MAIDS) caused by the LP-BM5 murine leukemia virus (MuLV) was studied. METHOD C57BL/6J female mice were inoculated intraperitoneally (ip) with LP-BM5 murine virus and treated with drugs (ip or ig) every day. RESULTS S-PS 50 mg.kg-1 per day (ip) inhibited splenomegaly and serum IgG elevation, in agreement with AZT(10mg.kg-1.d-1,ig) 4 weeks later. In addition, Se-PS and S-PS could increase blood GSH-Px activity significantly, and only Se-PS decreased lipid peroxidative product of spleen effectively.CONCLUSION Antioxidant molecules may be of therapeutic value in the treatment of HIV-infected patients.
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KEY WORDS Indocalamus tesselatus polysaccharide; polysaccharide sulfate; polysaccharide selenate; AIDS; antioxidant
艾滋病，又称获得性免疫缺陷症，是一种由艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的严重传染病，被称为“超级肿瘤”。国内外开展了大量的抗艾滋病药物的开发和研究，至今无预防的疫苗和治愈的药物。目前，许多经硫酸酯化的多糖如香菇多糖、地衣多糖、右旋糖酐、裂褶菌多糖、木聚糖等的硫酸酯具有明显的抑制HIV活性[1]。硫酸右旋糖酐(DS)和多硫酸聚戊糖在美国已进行了Ⅰ期临床试验。对DS临床研究表明有增加P24抗原，血小板计数减少等副作用。人工合成的木聚糖硫酸酯(Hoe/Bay 946)在西德已试用于临床，给30名带病毒者连续治疗3 mon，12.5～50mg.kg-1给药，发现此药能很好地被患者耐受，获得满意的结果，但具有抗凝血活性的副作用[2]。日本Ajinomoto公司开发的curdlan硫酸酯(CRDS)是以1-3-β-D-葡萄糖为主链，分子质量8.1×104 u，硫含量14.1%的硫酸酯多糖，已进入Ⅰ期临床试验中，能很好地为病人所耐受。HIV病人静脉注射(iv)CRDS 7 d，剂量为每天每70 kg体重予40，100，140 mg，在高剂量CD4及CD8淋巴细胞显著增加，有些病例在1次剂量后计数增加5×108.L-1，在24 h后回到原来水平。其半衰期约为2 h[3]。因此，硫酸酯多糖对HIV-1具有较高的选择抑制作用，副作用小，是一类治疗艾滋病有发展前途的新药。但也存在着许多有待解决的问题，而在国内有关研究尚未见报道。
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小鼠白血病病毒(murine leukemia virus, MuLV)LP-BM5株，与HIV同属逆转录病毒，以它感染C57BL/6小鼠，可使小鼠脾肿大，出现高蛋白血症，T、B细胞功能紊乱，肿瘤发生，淋巴结肿大等类似人艾滋病的症状，是模拟艾滋病的一种小动物模型。该模型重复性好，危险程度低，许多抗HIV的药物，如临床已使用的AZT、ddI、ddC等以此模型进行筛选评价，并且运用此模型研究AIDS的发病机制[4,5]。具有抗HIV作用的多糖类对此模型的作用还未见报道。
氧化应激与多种疾病的发生有着密切关系，如炎症、退行性神经疾病、动脉硬化、心肌损伤及衰老等与过多的自由基产生有关。活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)在HIV感染潜伏期的活化及疾病发展过程的作用已为许多研究者所重视，为抗氧化剂可能控制疾病发展过程及疾病的治疗带来新的思考。
体外抗艾滋病病毒(HIV)实验已表明硫酸酯化箬叶多糖具有更高的抑制HIV引起的CD4细胞病变性的作用[6]。在此基础上，本文采用LP-BM5 MuLV小鼠艾滋病为模型，首先以脾指数，ELISA法测定血清IgG含量作为临床及免疫指标，进一步研究箬叶多糖及其硫酸酯、硒酸酯在体内对小鼠艾滋病(MAIDS)的治疗作用；其次以谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、脂质过氧化物产物(TBARS)为重要参数，研究小鼠在感染及治疗后抗氧化水平的变化。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 C57BL/6J小鼠，♀，18～20g，北京医科大学实验动物科学部提供。
1.1.2 病毒株 采用小鼠LP-BM5白血病病毒，以G6细胞体外传代培养，培养上清作感染病毒，保存于-70℃。
1.1.3 药物 中药箬叶为禾本科植物箬竹的叶，箬叶多糖(PS)制备及硫酸酯(S-PS)的合成见文献[6]，含硫9.6%；其硒酸酯衍生物(Se-PS)，含硒1mg.g-1。
1.2 方法
1.2.1 病毒ID50滴定 取C57 BL/6敏感小鼠40只，♀♂各半，随机分组。病毒培养上清用RPMI-1640培养液稀释为1∶1，1∶10，1∶100，1∶1 000，1∶10 000，1∶100 000，1∶1 000 000，同时设对照组，病毒组每只接种0.5 ml不同浓度的病毒，对照组接种培养液0.5 ml。1 mon后观察淋巴结、脾脏，测定抗原IgG，并观察肿瘤发生，死亡情况。以脾指数增大2～3倍时的病毒稀释度为ID50(1×10-4)，并作为小鼠艾滋病模型的实验浓度。
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1.2.2 小鼠艾滋病模型的建立及药物治疗 取C57 BL/6小鼠160只，♀，随机分组，每组8只，共20个组。设正常对照组，病毒对照组，药物对照组，药物治疗组。病毒对照组与药物治疗组小鼠在d 1腹腔接种病毒0.5ml，其余接种等量培养液。采用两种给药方式灌胃(ig)及腹腔注射(ip)，每天1次，每只0.5ml，连续28d，正常对照组与病毒对照组给生理盐水。28d后，观察毛发光泽，淋巴结是否肿大，称体重，眼眶取血，无菌取脾，称重。
1.2.3 检测指标 血清IgG水平采用ELISA即双抗体间接夹心酶联免疫法[5]，取微量反应板，以pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释羊抗鼠IgG 200倍，包被每孔100μl，4℃过夜。以含体积分数为10%小牛血清的磷酸缓冲液(pH 7.2)封闭30 min，洗净后，扣干，每孔加入100 μl 1∶200稀释的血清样本，置于37℃ 120 min。洗净后，扣干，加入已标定效价1∶3 000稀释的HRP-羊抗鼠IgG 100 μl，置于37℃ 60 min。洗净后，扣干，加入100 μl显色剂邻苯二胺-H2O2置于37℃反应 20min。取出，加入50 μl l mol.L-1 H2SO4终止反应，于Bio-Rad 450型酶标仪测定490 nm的吸光度(OD)，以OD值表示血清IgG水平。
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1.2.4 抗氧化指标 5，5′-二硝基苯(DTNB)法测全血GSH-Px[7]；硫代巴比妥酸法测匀浆脂质过氧化产物(TBARS)[8]；邻苯三酚法测匀浆SOD活力[9]；Ellman法测脾匀浆谷胱甘肽(GSH)含量[10]。
2 结果
2.1 C57 BL/6小鼠感染LP-BM5 MuLV致MAIDS模型的建立 感染LP-BM5 MuLV的小鼠28d，体重较正常反应小鼠无明显变化，但感染小鼠脾脏肿大明显，重量增加，脾指数明显上升，ip与ig组与病毒对照组情况基本一致，ip组脾指数稍大些。如果接种时间更长，如45d、60d或72d，脾肿大越严重，45d起，出现淋巴结肿大，颈部、腹腔及胸腔内亦有明显的实体瘤生长，且随接种后时间的增加，肿瘤逐渐增多增大，至72d，所有感染小鼠均有肿瘤发生。
感染小鼠血清IgG明显增高，S-PS在ip或ig给药均可降低sIgG含量，ip Se-PS亦可显著降低IgG含量，结果与脾指数符合。感染小鼠IgG增加是由于多克隆B细胞被激活而导致。
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此外，还首次发现感染出现GSH-Px活力下降，脂质过氧化产物升高，这与HIV感染的病人的症状是一致的，在动物模型中还未见报道。小鼠感染LP-BM5 MuLV病毒28 d后，脾组织GSH含量降低(表3)。在猕猴感染猴免疫缺陷病毒1 wk内，也发现很快发生巯基缺乏，血清半胱氨酸和谷氨酸盐浓度也发生改变，且类似人类HIV感染，这表明动物病毒感染和HIV感染都可以发生巯基缺乏。GSH是细胞内主要的抗氧化剂，具有保护蛋白质巯基的还原状态，体外证实可抑制TNF-α以及活性氧类激活处于潜伏期的HIV进行转录和复制。
Tab 1 Effect of treatment on splenomegaly and serum IgG of C57 BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV (ig，
±s,n=8) GroupDose
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/mg.kg-1.d-1
Body weight
/g
Spleen weight
/mg
Spleen Index
/mg.g-1
IgG(OD)
Nc
19.6±1.0
62.1±11.8
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3.17±0.57
1.266±0.233
PS
100
18.4±1.1
72.2±13.9
3.92±0.72
1.351±0.225
S-PS
50
18.6±0.6
80.1±9.6##
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4.30±0.48##
1.323±0.109
Se-PS
100
19.0±1.1
88.6±30.1#
4.70±1.74#
AZT
10
19.1±1.3
79.9±18.6#
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4.31±2.62#
1.298±0.098
IC
18.6±1.9
220.4±10.7##
11.83±0.89##
1.630±0.135##
PS+Infected
100
17.9±1.4
181.5±33.0**
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10.07±10.7*
1.669±0.219
S-PS+infected
50
17.5±1.2
187.2±24.3**
10.61±1.24*
1.427±0.131**
Se-PS+Infected
100
, 百拇医药 18.6±1.9
194.2±35.8
10.11±1.74*
AZT+Infected
10
20.0±0.9
173.4±80.1**
8.61±4.12**
1.497±0.101*
NC: normal control, IC: infected control; #P<0.05，##P<0.01，vs normal control; *P<0.05，**P<0.01，vs infected controlTab 2 Effect of treatment on splenomegaly and serum IgG of C57BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV (ip，
±s,n=8) Group, 百拇医药
Dose
/mg.kg-1.d-1
Body weight
/g
Spleen weight
/mg
Spleen Index
/mg.g-1
IgG(OD)
NC
20.4±1.0
, 百拇医药
75.5±12.0
3.72±0.63
1.049±0.134
PS
100
20.7±2.6
101.4±16.1##
4.91±0.51##
S-PS
50
20.0±1.1
113.9±18.9##
, 百拇医药
5.66±0.67##
1.091±0.14
Se-PS
100
19.5±0.9
118.8±19.1##
6.70±0.8##
1.043±0.096
IC
20.8±0.9
264.5±24.5##
, 百拇医药
12.82±1.2##
1.275±0.138##
PS+Infected
100
20.7±0.7
246.3±26.2
11.95±1.42
S-PS+Infected
50
21.3±0.7
203.3±49.4**
, 百拇医药
9.54±2.37**
1.104±0.165*
Se-PS+Infected
100
20.8±1.2
228.6±38.7*
11.09±1.62*
1.121±0.103
NC: normal control, IC: infected control; ##P<0.01, vs NC；P<0.05，P<0.01, vs ICTab 3 Effect of treatment on SOD activity and GSH content of spleen
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homogenate of C57BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV (ig，
±s,n=8) GroupDose/mg.kg-1.d-1
SOD/μmol.g-1 spleen
GSH/μg.kg-1 spleen
NC
3.85±0.41
4.96±5.2
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PS
100
4.08±1.51
S-PS
50
3.05±1.25
Se-PS
4.55±1.29
IC
100
3.63±1.45
4.10±2.3#
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PS+Infected
100
4.06±1.95
S-PS+Infected
50
4.43±0.66
Se-PS+Infected
100
4.45±1.60
NC: normal control, IC: infected control; #P<0.05, vs NC2.2 对C57 BL/6小鼠感染LP-BM5 MuLV致MAIDS的治疗作用 结果可以看出，随给药方式的不同，药物的治疗效果亦有所不同，这可能与药物的代谢途径、作用方式有关。S-PS则以ip方式有较好的抑制MuLV导致的脾肿大作用。PS与Se-PS的抑制作用在ig给药方式中比S-PS效果稍好。PS在ip给药方式中基本无作用，Se-PS在ig和ip两种方式中有一定的抑制作用。几种化合物抑制作用大小顺序为：ip给药，S-PS>Se-PS>PS; ig给药，Se-Ps>PS>S-PS。
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药物在体内对正常小鼠的血清IgG含量影响不大，说明4种物质在此条件下对体液免疫可能没有直接的促进作用(表1，2)。但是ip组与ig组比正常对照组小鼠脾脏器官增大，ip组尤为显著，其作用大小顺序为ip组：Se-PS>S-Ps>Ps；ig组：Se-PS>S-Ps, AZT>PS，表明4种物质对脾脏淋巴细胞增殖有促进作用，可增强小鼠细胞免疫功能。
多糖系列以ip方式施予可抑制感染小鼠GSH-Px活力下降，并保持正常的水平，以S-PS最好(P<0.05)，并且还降低脾组织脂质过氧化产物的生成。但S-PS仅对提高酶活力有作用。因此，在动物体内实验中，Se-PS具有比PS，S-PS更好的抗氧化作用，结果见图1，2。
Fig 1 Effect of treatment of whole blood GSH-Px activity
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of C57 BL/6J mice infected with LP-BM5 MuLV(ip)
Fig 2 Effect of treatment on MDA content of spleen
homogenate of mice infected with LP-BM5 MuLV(ip)
3 讨论
自发现艾滋病至今已十多年，研制抗HIV药物已有数百种之多，但迄今正式经FDA批准，并为全球认为可临床应用的仅有3种，即叠氮胸苷(AZT)，双脱氧次黄苷(ddI)，双脱氧胞苷(ddC)，均存在严重的毒副作用，难以推广使用。
国外大量文献报道在HIV感染病人中，红细胞GSH-Px活力，血清Se、Zn含量显著下降，血浆GSH、巯基、Vit C含量也显著降低，而脂质过氧化产物显著上升，在发病的不同阶段(CDCⅡ，Ⅳ)，程度加深。在HIV感染病人机体中存在氧化不平衡，抗氧化剂的大量消耗[11，12]。硒与艾滋病的关系早在1987年开始逐渐引起人们的重视，在德国进行了几次短期的临床实验表明硒对艾滋病的治疗有一定疗效，但采用的亚硒酸钠形式的硒毒性较大，并且实验研究未见报道。一些使用抗氧化剂临床实验如植物中提取的抗氧化剂——Vit C、β胡萝卜素、硒等正在进行之中，有待进一步评价抗氧化剂在治疗人AIDS病中的作用。但这些实验往往局限于其中一种，而体内抗氧化剂的失调是多方面的。
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中国中医研究院[13]在坦桑尼亚采用多种中药煎剂治疗患者已初见苗头，而中药中的成分是非常复杂的，近年来从中药和天然药中提取生物碱、黄酮类、多糖及糖脂类、蛋白质类、抗生素类、胡萝卜素、维生素类等活性成分，其中大部分具有良好的抗氧化作用，体外实验表明某些成分可抑制病毒的激活、感染免疫细胞的程序性死亡或直接抑制HIV复制。我们以前的研究亦表明箬叶多糖类具有良好的抗氧化作用[14]。本文的结果表明病毒感染与机体的氧化损伤有一定的关系。
因此，作为免疫增强剂和抗氧化剂的微量元素硒，多糖类或者与其它抗氧化剂维生素E、维生素C、β胡萝卜素等与逆转录酶抑制剂AZT或ddC等联合使用，可能会对HIV感染的防治有一定的潜在的应用前景。
作者简介：陈春英，女，29岁，博士，副研究员；
蒋 岩，女，38岁，博士，副研究员
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1998-06-02收稿，1998-10-17修回, http://www.100md.com