6，7-二甲氧基香豆素抗急性肾功能衰竭的作用机制研究*
作者：韩兴梅 洪 敏 朱 荃
单位：韩兴梅 湖南医科大学遗传药理研究所, 长沙 410078；洪 敏 朱 荃(南京中医药大学药理毒理学实验室,南京 210029)
关键词：6,7-二甲氧基香豆素；肾灌注压；NO；PGI2；NE
中国药理学通报990414
摘要 目的 探讨6,7-二甲氧基香豆素抗急性肾功能衰竭(ARF)的作用，并初步分析其作用机制。方法 观察6,7-二甲氧基香豆素对内毒素诱导小鼠ARF模型的影响，分析其对ARF的作用；观察消炎痛或L-NAME协同NE 升高离体灌流肾肾灌注压以分析6,7-二甲氧基香豆素对PGI2和NO的影响。结果 6,7-二甲氧基香豆素对内毒素引起的小鼠急性肾衰有明显的拮抗作用，能降低血清肌酐浓度、血清尿素氮浓度、肾匀浆SOD活性及肾匀浆L PO含量的升高，减轻肾小球毛细血管及肾间质充血。 6,7-二甲氧基香豆素有延缓正常灌流肾肾灌注压缓慢上升的作用。呈剂量依赖性拮抗NE引起的肾灌注压的升高。通过PGI2及N O的释放等减小肾血管阻力。结论 6,7-二甲氧基香豆素有抗内毒素诱导的ARF的作用，主要通过防止氧自由基的生成及(或)清除已生成的氧自由基，促使血管内皮细胞释放NO和PG I2，减少肾血管阻力等综合作用实现。
, 百拇医药
中国图书分类号 的692.505； R 983
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0332-04
Effect and mechanism of 6,7-dimethoxycoumarin on acute renal failure
HAN Xing-Mei, HONG Min, ZHU Quan
(Laboratory of Pharmacology & Toxicology,Nanjing University of Traditio nal Chinese Medicine, Nanjing 210029)
ABSTRACT AIM To investigate the effect and m echanism of 6,7-dimethoxycoumar in on the acute renal failure (ARF). METHODS In the model of en dotoxin-induced ARF in mice, the variation of the concentration of Cr and BUN in serum and SOD, LPO and GSH in renal homogenate was detected, and the role of 6,7-dimethoxycou marin on the PGI2 and NO was studied through the isolated perfused kidney. RESULTS 6,7-dimethoxycoumarin not only decreased the abnormal hig her concentration of Crand BUN but also improved activity of SOD, reduced the q uantity of LPO without influence on the activity of GSH and ameliorated the cong estion of the kidney in endotoxin-induced ARF mice, which indicated its anti-A RF effect through scavenging reactive oxygen species and correcting their injury . 6,7-dimethoxycoumarin delayed the increase of the normal pressure and inhibited the NE-induced increased pressure in concentration-dependent manner. 6,7-d imethoxycoumarin could also enhance the production of PGI2 and NO. CONCL USION 6,7-dimethoxycoumarin contributed to the cure of acute renal failure and was one of the active substances in Kangjue Injection.
, http://www.100md.com
KEY WORDS 6,7-dimethoxycoumarin; ARF；isolated perfused rat kidney; PGI2; NO; NE
本室曾观察到抗厥注射液能明显增加休克动物的肾血流量而有抗急性肾衰(acute rena l failure, ARF)的作用[1]，研究表明川牛膝与抗厥注射液增加肾血流量作用密切相关，6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethoxycoumarin, DMOC)是川牛膝的成分之一, 又具有扩血管活性[2，3]。本文观察6,7-二甲氧基香豆素的抗ARF作用，并探讨其对肾血管床的作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SD大鼠，250～350 g，ICR小鼠，18～22 g，♂♀各半，南京中医药大学动物中心提供，合格证：苏动(质)95038。
, http://www.100md.com
1. 1.2 试剂 1640细胞培养液，购自Li fe Technologies,Inc.Grand Island,NY 14072 USA;内毒素，35H4086，Sigma Chemical Com.；L-NAME，37H0382，Sigma Chemical Com.；6，7-二甲氧基香豆素，由南京中医药大学彭国平副教授提供。其余均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 内毒素致急性肾衰[4] 小鼠60只，随机分为6组：对照组；模型组；D MOC(14 mg.kg-1)；DMOC(28 mg.kg-1)；DMOC(56 mg.kg-1)；地塞米松(4.8 mg.kg-1), 分别腹腔注射溶媒(丙二醇)或DMOC后，立即尾静脉注射内毒素0.06 g.kg-1(对照组注射等量的生理盐水)。4 h后，小鼠摘眼球取血，测定血清尿素氮和肌酐浓度。一只肾制成100 ml.L-1匀浆，测定LPO含量及SOD和G SH酶活性，另一只肾用100 ml.L-1的甲醛液固定，做肾组织切片，观察组织病甲氧基香豆素有延缓正常灌流肾肾灌注压缓慢上升的作用。呈剂量依赖性拮抗NE引起的肾灌注压的升高。通过PGI2及N O的释放等减小肾血管阻力。结论 6,7-二甲氧基香豆素有抗内毒素诱导的ARF的作用，主要通过防止氧自由基的生成及(或)清除已生成的氧自由基，促使血管内皮细胞释放NO和PG I2，减少肾血管阻力等综合作用实现。
, 百拇医药
Tab 1 Effect of DMOC on Cr, BUN,SOD,LPO and GSH of endot oxin-induced ARF mice(
±s,n=10) Group/mg.kg-1
Cr/10 mg.L-1
BUN/10 mg.L-1
SOD/nU.L-1
LPO/mmol.L-1
GSH/mg.L-1
, 百拇医药
Control
13.19±2.890
196.4±30.66
60.47±20.76
12.75±1.087
48.82±5.430
Vehicle
69.32±12.13**
473.6±44.26**
147.9±12.08**
, http://www.100md.com 21.15±4.701**
19.83±10.30**
DMOC
14
70.79±13.19**
472.9±36.54**
148.7±14.26**
21.01±3.045**
18.10±10.45**
28
, 百拇医药
38.94±7.260**##
364.8±61.41**##
103.9±14.87**##
16.96±4.25
26.10±12.32**
56
27.08±6.43**##
282.9±42.68**##
67.18±28.80##
, 百拇医药
12.00±1.565##
24.56±6.110**
Dexmethasone
16.75±5.220##
217.3±46.58##
82.76±24. 43##
10.62±3.712##
14.37±6.110**
#P<0.05,##P<0.01， vs vehicle group; *P<0.0 5, **P<0.01， vs control group1.2.2 大鼠离体灌流肾制备 [5]大鼠，30g.L-1的戊巴比妥钠(30mg.kg-1)腹腔注射麻醉，仰置手术板上，暴露左肾，下腔静脉注入肝素钠100μg.kg -1。2min后从腹主静脉插入约4 cm 的插管，进入肾静脉；腹主动脉插入磨平的7 号针，进入肾动脉，调节深浅合适后，结扎，开启蠕动泵灌流。迅速分离出灌流肾，悬于37℃灌流杯中，单灌5min 后，开始循环灌流。调节灌流量使灌流压稳定于10～12kPa，平衡20min 后，取流量在4～6ml.min-1的灌流肾开始实验。
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1.2.3 正常灌流肾肾灌注压的变化 平衡后的灌流肾加1.2g.L-1的溶媒(DMSO)或0.1mmol.L-1的DMOC，观察加药后3、5、10、15、20、30、40、50、及60 min时肾灌注压的变化△kPa。
1.2.4 NE引起的肾灌注压升高 平衡后的灌流肾先加3 μmol.L-1的NE，记录灌注压上升的最高值H1后，换新鲜灌流液灌洗15 min，灌注压仍能回到正常的灌流肾，分别加入1、3、10、30、100及300μmol.L-1的DMOC或等量溶媒(DMSO)，同时加入3μmol.L-1的NE，记录灌注压上升的最高值H2后换新鲜液灌洗，灌注压仍能回到正常的加入3μmol.L-1的NE，记录其最高值H3，取H1 /H3在0.9～1.1之间的值，以H2/H3即抑制率进行统计处理。
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1.2.5 消炎痛协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高 平衡后的灌流肾分为4组：对照组；溶媒+消炎痛(1×10-4mol.L-1)；DMOC (1×10-4mol.L-1)；DMOC(1×10-4mol.L-1)+消炎痛(1 ×10-4mol.L-1)。消炎痛在给DMOC或溶媒2min 前加入，2 min后累积加入 NE，记录肾灌注压的升高值△kPa。
1.2.6 L-NAME协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高 平衡后的灌流肾分为4组：对照组；溶媒+L-NAME(1×10-4mol.L-1 )；DMOC(1×10-4mol.L-1)；DMOC(1×10-4mol.L-1)+L-NAME(1×10-1mol.L-1)。L-NAME在给DMOC或溶媒(DMSO) 2min 前加入，2min后累积加入NE，记录肾灌注压的升高值△kPa。
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1.2.7 统计学处理 先采用方差分析，两两比较，用q 检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 6,7-二甲氧基香豆素对内毒素致急性肾衰的影响 6,7-二甲氧基香豆素呈剂量依赖性降低内毒素引起的血清肌酐浓度、血清尿素氮浓度、肾匀浆SOD活性和肾匀浆LPO含量的升高，但对肾匀浆GSH活性的变化没有影响，减轻肾小球毛细血管及肾间质充血。由于造模时间只有4 h,模型与给药组动物均未观察到对肾小管的影响,见表1。
2.2 6，7-二甲氧基香豆素对大鼠离体灌流肾正常肾灌注压的影响 离体大鼠肾的灌注压随着时间的延长而缓慢上升，但在平衡后40 min内上升并不明显，在这期间，可以进行一系列实验，这与文献的报道一致[6]。6，7-二甲氧基香豆素有延缓灌注压上升的作用,60 min仍维持在正常水平,见图1。
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Fig 1 Effect of DMOC on the normal perfusion pressure in
isolated rat kidney (n=10,±s)
#P<0.05,##P,0.01 vs vehicle group;*P<0.05,**P<0.01 vs control group;■-■:control◆-◆:vehicle;▲-▲:DMOC
2.3 6，7-二甲氧基香豆素对NE诱导的离体灌流肾肾灌注压升高的影响 6,7-二甲氧基香豆素明显对抗NE 的升压作用，且呈量效关系，IC50＝1.486×10-5 mol.L-1。作用强度大约为Regitine的1/30 ，见表2。
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Tab 2 Effect of DMOC on the increased perfusion pressure
stimulated by NE in isolated rat kidney(±s,n=5) Group/μmol.L-1
Inhibitory Rate
Control
0
Vehicle
0.025±0.176
DMOC
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1
0.056±0.070
3
0.340±0.094**#
10
0.364±0.143**##
30
0.671±0.117**##
100
0.807±0.196**##
300
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0.923±0.090**##
Regitine
10
0.906±0.080**##
#P<0.05,##P<0.01 vs vehicle group; *P<0.05, **P<0.01 vs control group2.4 6,7-二甲氧基香豆素对消炎痛协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高的影响 消炎痛使6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线左移, 见图2。
2.5 6,7-二甲氧基香豆素对L-NAME协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高的影响 L-NAME使6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线左移, 见图3。
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Fig 2 Influence of indomethacin on the effect of DMOC on the
increased perfusion pressure induced by NE (±s，n=10)
C:NE:■-■:control;◆-◆:DMOC;▲-▲:DMOC+in-domethacin;○-○:solvent+indomethain
Fig 3 Influence of L-NAME on the effect of DMOC on the
increased perfusion pressure induced by NE (±s，n=10)
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C:NE:■-■:control;◆-◆:DMOC;▲-▲:DMOC+L-NAME;○-○:solvent+L-NAME
3 讨论
啮齿动物静脉注射内毒素后3 h内膜脂质过氧化作用明显加强，Na+、K+-ATP酶活性减小，使得机体能量供应不足，肾功能损伤，氯化钠重吸收受阻，激活肾素-血管紧张素系统，释放血管活性物质，引起血管收缩，肾小球滤过率(GRF)下降，进一步的氧供应不足，导致ARF 。由于GRF的下降, 3～6h内血清肌酐、尿素氮浓度明显升高，严重的肾功能衰竭在12h以后，伴以少尿[4]。本文小鼠尾静脉注射内毒素4h后出现血清肌酐、尿素氮浓度的升高，同时由于内毒素使膜脂质过氧化作用增强，肾匀浆LPO含量增加，并激活肾匀浆SOD使其活性升高，GSH活性降低,还观察到肾小球、肾间质的充血。但由于造模时间只有4h，未见肾小管损伤。6,7-二甲氧基香豆素降低ARF小鼠血清肌酐、尿素氮浓度，降低肾匀浆SOD 活性和LPO含量，并减轻肾小球和肾间质充血，提示其通过抑制氧自由基生成等因素达到改善小鼠ARF的病理过程。
, 百拇医药
为了观察药物对肾血管阻力的影响，采用了大鼠离体肾灌流模型，将灌流量恒定，则灌注压的变化反应了肾血管阻力的变化。灌注压升高，肾血管阻力增大[7]。由于灌流液不含细胞，不能完全代替体液对肾的营养作用，保持离体大鼠灌流肾的灌流量不变，则灌注压随着时间的延长而缓慢上升，平衡50min后比平衡时升高3～7kPa，肾功能丧失，而 6,7-二甲氧基香豆素延缓大鼠离体灌流肾肾灌注压的上升，平衡60min后灌注压仅升高0. 2～1kPa，表明其有减小肾血管阻力，维持肾功能的作用。
NE引起血管平滑肌的收缩，大鼠离体肾灌流上表现为肾灌注压的上升。6,7-二甲氧基香豆素明显对抗NE的升压作用，进一步表明其有减小血管阻力，增加血管床开放的作用，这与本室观察到的川牛膝在抗厥注射液抗ARF中发挥的增加肾血流量的作用是一致的[1]。
PGI2是一内源性舒血管物质，消炎痛能阻断PGI2的合成。血管松弛剂与血管内皮细胞表面的相应受体结合，通过磷脂酰肌醇信号通道使细胞内钙离子浓度增加，钙离子/钙调蛋白与结构型NO合成酶(nNOS)结合，导致结构型NOS空间构象改变形成活性形式,催化L -精氨酸生成NO，后者弥散进入血管平滑肌细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶，使平滑肌细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平升高,从而引起血管松弛[8]。N-Nitro-L-Arginine M ethyl Ester (L-NAME) 为NOS阻断剂[9]。本文中正常的灌流肾在灌流液中加入消炎痛或L-NAME，然后观察加入或不加入阻断剂时6,7-二甲氧基香豆素对NE引起肾灌注压升高的影响，以此判断出其是否通过促进NO或PGI2生成而减小肾血管阻力。实验结果表明，加入阻断剂后，6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线左移，提示其通过促进NO和P GI2合成而松弛血管平滑肌从而减小肾血管阻力。
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近年来的研究表明肾小管上皮细胞受刺激后生成一种诱生型NO合成酶(iNOS)，促进NO的合成，对肾脏有损伤作用。本文加入L-NAME后，6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线与不加L-NAME相比明显左移，所以6,7-二甲氧基香豆素主要是通过影响nNOS的活性，促进 NO的释放，从而引起血管松弛，对iNOS的影响甚微。
6,7-二甲氧基香豆素是川牛膝的一提取成分，而川牛膝又与抗厥注射液的抗ARF作用密切相关，以上研究表明6,7-二甲氧基香豆素可能是抗厥注射液中减小肾血管阻力的主要活性成分之一，在预防和治疗ARF中有重要的意义。6,7-二甲氧基香豆素在肾素-血管紧张素系统、多巴胺受体、血管紧张素受体、内皮素释放及细胞程序性死亡等方面与ARF有关的作用有待于进一步探讨。
*江苏省自然科学基金资助课题，BK 95134313
作者简介: 韩兴梅, 女, 24岁, 博士生；
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朱 荃,男,58岁,教授,博士生导师
参考文献
1 朱 荃，孙小玉，马 骋. 抗厥通脉注射液对肠系膜上动脉夹闭型及重症失血型休克家兔的作用. 中国药科大学学报，1996；27(1)：36～9
2 Huang JC, Wang XR. Effects of scoparone on hemodynamics in anesthetized rabbits. Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao, 1993;14(S uppl):S18～21
3 Huang HC, Lee CR. Vasodilator effect of scoparone (6,7-dimethoxycouma rin)from a Chinese herb. Eur J Pharmacol, 1992;218(1):123～8
, http://www.100md.com
4 Shimahara Y. Pathophysiology of acute renal failure following living esc herichia coli injection in rats: high-energy metabolism and renal functions. Circ Shock, 1987;21:197
5 Bowan RH, Maack T. Glucose transport by the isolated perfused rat kidney. Am J Physiol, 1972;222(6):1499～504
6 Maack T. Physiological evaluation of the isolated perfused rat kidney. Am J Physiol, 1980;238:F71～8
7 Tongchuan Li, Kerin Croce, Raymond JW et al. Vasoconstricto rand vasodilator effect of serotinin in the isolated rabbit kidney. J Pharmacol Exp Ther, 1992;263(3):928～32
8 Kobzik L, Richard D, Kruse PE et al. Nitric oxide in skeletal muscle. Nature,1994;372:546～8
9 Rees DD, Palmer RMJ. Characterization of three inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo. Br J Pharmac ol, 1990;101:746～52
1998-07-14收稿，1999-01-07修回, 百拇医药
单位：韩兴梅 湖南医科大学遗传药理研究所, 长沙 410078；洪 敏 朱 荃(南京中医药大学药理毒理学实验室,南京 210029)
关键词：6,7-二甲氧基香豆素；肾灌注压；NO；PGI2；NE
中国药理学通报990414
摘要 目的 探讨6,7-二甲氧基香豆素抗急性肾功能衰竭(ARF)的作用，并初步分析其作用机制。方法 观察6,7-二甲氧基香豆素对内毒素诱导小鼠ARF模型的影响，分析其对ARF的作用；观察消炎痛或L-NAME协同NE 升高离体灌流肾肾灌注压以分析6,7-二甲氧基香豆素对PGI2和NO的影响。结果 6,7-二甲氧基香豆素对内毒素引起的小鼠急性肾衰有明显的拮抗作用，能降低血清肌酐浓度、血清尿素氮浓度、肾匀浆SOD活性及肾匀浆L PO含量的升高，减轻肾小球毛细血管及肾间质充血。 6,7-二甲氧基香豆素有延缓正常灌流肾肾灌注压缓慢上升的作用。呈剂量依赖性拮抗NE引起的肾灌注压的升高。通过PGI2及N O的释放等减小肾血管阻力。结论 6,7-二甲氧基香豆素有抗内毒素诱导的ARF的作用，主要通过防止氧自由基的生成及(或)清除已生成的氧自由基，促使血管内皮细胞释放NO和PG I2，减少肾血管阻力等综合作用实现。
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中国图书分类号 的692.505； R 983
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0332-04
Effect and mechanism of 6,7-dimethoxycoumarin on acute renal failure
HAN Xing-Mei, HONG Min, ZHU Quan
(Laboratory of Pharmacology & Toxicology,Nanjing University of Traditio nal Chinese Medicine, Nanjing 210029)
ABSTRACT AIM To investigate the effect and m echanism of 6,7-dimethoxycoumar in on the acute renal failure (ARF). METHODS In the model of en dotoxin-induced ARF in mice, the variation of the concentration of Cr and BUN in serum and SOD, LPO and GSH in renal homogenate was detected, and the role of 6,7-dimethoxycou marin on the PGI2 and NO was studied through the isolated perfused kidney. RESULTS 6,7-dimethoxycoumarin not only decreased the abnormal hig her concentration of Crand BUN but also improved activity of SOD, reduced the q uantity of LPO without influence on the activity of GSH and ameliorated the cong estion of the kidney in endotoxin-induced ARF mice, which indicated its anti-A RF effect through scavenging reactive oxygen species and correcting their injury . 6,7-dimethoxycoumarin delayed the increase of the normal pressure and inhibited the NE-induced increased pressure in concentration-dependent manner. 6,7-d imethoxycoumarin could also enhance the production of PGI2 and NO. CONCL USION 6,7-dimethoxycoumarin contributed to the cure of acute renal failure and was one of the active substances in Kangjue Injection.
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KEY WORDS 6,7-dimethoxycoumarin; ARF；isolated perfused rat kidney; PGI2; NO; NE
本室曾观察到抗厥注射液能明显增加休克动物的肾血流量而有抗急性肾衰(acute rena l failure, ARF)的作用[1]，研究表明川牛膝与抗厥注射液增加肾血流量作用密切相关，6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethoxycoumarin, DMOC)是川牛膝的成分之一, 又具有扩血管活性[2，3]。本文观察6,7-二甲氧基香豆素的抗ARF作用，并探讨其对肾血管床的作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SD大鼠，250～350 g，ICR小鼠，18～22 g，♂♀各半，南京中医药大学动物中心提供，合格证：苏动(质)95038。
, http://www.100md.com
1. 1.2 试剂 1640细胞培养液，购自Li fe Technologies,Inc.Grand Island,NY 14072 USA;内毒素，35H4086，Sigma Chemical Com.；L-NAME，37H0382，Sigma Chemical Com.；6，7-二甲氧基香豆素，由南京中医药大学彭国平副教授提供。其余均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 内毒素致急性肾衰[4] 小鼠60只，随机分为6组：对照组；模型组；D MOC(14 mg.kg-1)；DMOC(28 mg.kg-1)；DMOC(56 mg.kg-1)；地塞米松(4.8 mg.kg-1), 分别腹腔注射溶媒(丙二醇)或DMOC后，立即尾静脉注射内毒素0.06 g.kg-1(对照组注射等量的生理盐水)。4 h后，小鼠摘眼球取血，测定血清尿素氮和肌酐浓度。一只肾制成100 ml.L-1匀浆，测定LPO含量及SOD和G SH酶活性，另一只肾用100 ml.L-1的甲醛液固定，做肾组织切片，观察组织病甲氧基香豆素有延缓正常灌流肾肾灌注压缓慢上升的作用。呈剂量依赖性拮抗NE引起的肾灌注压的升高。通过PGI2及N O的释放等减小肾血管阻力。结论 6,7-二甲氧基香豆素有抗内毒素诱导的ARF的作用，主要通过防止氧自由基的生成及(或)清除已生成的氧自由基，促使血管内皮细胞释放NO和PG I2，减少肾血管阻力等综合作用实现。
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Tab 1 Effect of DMOC on Cr, BUN,SOD,LPO and GSH of endot oxin-induced ARF mice(
±s,n=10) Group/mg.kg-1Cr/10 mg.L-1
BUN/10 mg.L-1
SOD/nU.L-1
LPO/mmol.L-1
GSH/mg.L-1
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Control
13.19±2.890
196.4±30.66
60.47±20.76
12.75±1.087
48.82±5.430
Vehicle
69.32±12.13**
473.6±44.26**
147.9±12.08**
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19.83±10.30**
DMOC
14
70.79±13.19**
472.9±36.54**
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18.10±10.45**
28
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38.94±7.260**##
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282.9±42.68**##
67.18±28.80##
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12.00±1.565##
24.56±6.110**
Dexmethasone
16.75±5.220##
217.3±46.58##
82.76±24. 43##
10.62±3.712##
14.37±6.110**
#P<0.05,##P<0.01， vs vehicle group; *P<0.0 5, **P<0.01， vs control group1.2.2 大鼠离体灌流肾制备 [5]大鼠，30g.L-1的戊巴比妥钠(30mg.kg-1)腹腔注射麻醉，仰置手术板上，暴露左肾，下腔静脉注入肝素钠100μg.kg -1。2min后从腹主静脉插入约4 cm 的插管，进入肾静脉；腹主动脉插入磨平的7 号针，进入肾动脉，调节深浅合适后，结扎，开启蠕动泵灌流。迅速分离出灌流肾，悬于37℃灌流杯中，单灌5min 后，开始循环灌流。调节灌流量使灌流压稳定于10～12kPa，平衡20min 后，取流量在4～6ml.min-1的灌流肾开始实验。
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1.2.3 正常灌流肾肾灌注压的变化 平衡后的灌流肾加1.2g.L-1的溶媒(DMSO)或0.1mmol.L-1的DMOC，观察加药后3、5、10、15、20、30、40、50、及60 min时肾灌注压的变化△kPa。
1.2.4 NE引起的肾灌注压升高 平衡后的灌流肾先加3 μmol.L-1的NE，记录灌注压上升的最高值H1后，换新鲜灌流液灌洗15 min，灌注压仍能回到正常的灌流肾，分别加入1、3、10、30、100及300μmol.L-1的DMOC或等量溶媒(DMSO)，同时加入3μmol.L-1的NE，记录灌注压上升的最高值H2后换新鲜液灌洗，灌注压仍能回到正常的加入3μmol.L-1的NE，记录其最高值H3，取H1 /H3在0.9～1.1之间的值，以H2/H3即抑制率进行统计处理。
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1.2.5 消炎痛协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高 平衡后的灌流肾分为4组：对照组；溶媒+消炎痛(1×10-4mol.L-1)；DMOC (1×10-4mol.L-1)；DMOC(1×10-4mol.L-1)+消炎痛(1 ×10-4mol.L-1)。消炎痛在给DMOC或溶媒2min 前加入，2 min后累积加入 NE，记录肾灌注压的升高值△kPa。
1.2.6 L-NAME协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高 平衡后的灌流肾分为4组：对照组；溶媒+L-NAME(1×10-4mol.L-1 )；DMOC(1×10-4mol.L-1)；DMOC(1×10-4mol.L-1)+L-NAME(1×10-1mol.L-1)。L-NAME在给DMOC或溶媒(DMSO) 2min 前加入，2min后累积加入NE，记录肾灌注压的升高值△kPa。
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1.2.7 统计学处理 先采用方差分析，两两比较，用q 检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 6,7-二甲氧基香豆素对内毒素致急性肾衰的影响 6,7-二甲氧基香豆素呈剂量依赖性降低内毒素引起的血清肌酐浓度、血清尿素氮浓度、肾匀浆SOD活性和肾匀浆LPO含量的升高，但对肾匀浆GSH活性的变化没有影响，减轻肾小球毛细血管及肾间质充血。由于造模时间只有4 h,模型与给药组动物均未观察到对肾小管的影响,见表1。
2.2 6，7-二甲氧基香豆素对大鼠离体灌流肾正常肾灌注压的影响 离体大鼠肾的灌注压随着时间的延长而缓慢上升，但在平衡后40 min内上升并不明显，在这期间，可以进行一系列实验，这与文献的报道一致[6]。6，7-二甲氧基香豆素有延缓灌注压上升的作用,60 min仍维持在正常水平,见图1。
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Fig 1 Effect of DMOC on the normal perfusion pressure in
isolated rat kidney (n=10,
±s)#P<0.05,##P,0.01 vs vehicle group;*P<0.05,**P<0.01 vs control group;■-■:control◆-◆:vehicle;▲-▲:DMOC
2.3 6，7-二甲氧基香豆素对NE诱导的离体灌流肾肾灌注压升高的影响 6,7-二甲氧基香豆素明显对抗NE 的升压作用，且呈量效关系，IC50＝1.486×10-5 mol.L-1。作用强度大约为Regitine的1/30 ，见表2。
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Tab 2 Effect of DMOC on the increased perfusion pressure
stimulated by NE in isolated rat kidney(
±s,n=5) Group/μmol.L-1Inhibitory Rate
Control
0
Vehicle
0.025±0.176
DMOC
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1
0.056±0.070
3
0.340±0.094**#
10
0.364±0.143**##
30
0.671±0.117**##
100
0.807±0.196**##
300
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0.923±0.090**##
Regitine
10
0.906±0.080**##
#P<0.05,##P<0.01 vs vehicle group; *P<0.05, **P<0.01 vs control group2.4 6,7-二甲氧基香豆素对消炎痛协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高的影响 消炎痛使6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线左移, 见图2。
2.5 6,7-二甲氧基香豆素对L-NAME协同NE引起大鼠离体灌流肾肾灌注压升高的影响 L-NAME使6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线左移, 见图3。
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Fig 2 Influence of indomethacin on the effect of DMOC on the
increased perfusion pressure induced by NE (
±s，n=10)C:NE:■-■:control;◆-◆:DMOC;▲-▲:DMOC+in-domethacin;○-○:solvent+indomethain
Fig 3 Influence of L-NAME on the effect of DMOC on the
increased perfusion pressure induced by NE (
±s，n=10), 百拇医药
C:NE:■-■:control;◆-◆:DMOC;▲-▲:DMOC+L-NAME;○-○:solvent+L-NAME
3 讨论
啮齿动物静脉注射内毒素后3 h内膜脂质过氧化作用明显加强，Na+、K+-ATP酶活性减小，使得机体能量供应不足，肾功能损伤，氯化钠重吸收受阻，激活肾素-血管紧张素系统，释放血管活性物质，引起血管收缩，肾小球滤过率(GRF)下降，进一步的氧供应不足，导致ARF 。由于GRF的下降, 3～6h内血清肌酐、尿素氮浓度明显升高，严重的肾功能衰竭在12h以后，伴以少尿[4]。本文小鼠尾静脉注射内毒素4h后出现血清肌酐、尿素氮浓度的升高，同时由于内毒素使膜脂质过氧化作用增强，肾匀浆LPO含量增加，并激活肾匀浆SOD使其活性升高，GSH活性降低,还观察到肾小球、肾间质的充血。但由于造模时间只有4h，未见肾小管损伤。6,7-二甲氧基香豆素降低ARF小鼠血清肌酐、尿素氮浓度，降低肾匀浆SOD 活性和LPO含量，并减轻肾小球和肾间质充血，提示其通过抑制氧自由基生成等因素达到改善小鼠ARF的病理过程。
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为了观察药物对肾血管阻力的影响，采用了大鼠离体肾灌流模型，将灌流量恒定，则灌注压的变化反应了肾血管阻力的变化。灌注压升高，肾血管阻力增大[7]。由于灌流液不含细胞，不能完全代替体液对肾的营养作用，保持离体大鼠灌流肾的灌流量不变，则灌注压随着时间的延长而缓慢上升，平衡50min后比平衡时升高3～7kPa，肾功能丧失，而 6,7-二甲氧基香豆素延缓大鼠离体灌流肾肾灌注压的上升，平衡60min后灌注压仅升高0. 2～1kPa，表明其有减小肾血管阻力，维持肾功能的作用。
NE引起血管平滑肌的收缩，大鼠离体肾灌流上表现为肾灌注压的上升。6,7-二甲氧基香豆素明显对抗NE的升压作用，进一步表明其有减小血管阻力，增加血管床开放的作用，这与本室观察到的川牛膝在抗厥注射液抗ARF中发挥的增加肾血流量的作用是一致的[1]。
PGI2是一内源性舒血管物质，消炎痛能阻断PGI2的合成。血管松弛剂与血管内皮细胞表面的相应受体结合，通过磷脂酰肌醇信号通道使细胞内钙离子浓度增加，钙离子/钙调蛋白与结构型NO合成酶(nNOS)结合，导致结构型NOS空间构象改变形成活性形式,催化L -精氨酸生成NO，后者弥散进入血管平滑肌细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶，使平滑肌细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平升高,从而引起血管松弛[8]。N-Nitro-L-Arginine M ethyl Ester (L-NAME) 为NOS阻断剂[9]。本文中正常的灌流肾在灌流液中加入消炎痛或L-NAME，然后观察加入或不加入阻断剂时6,7-二甲氧基香豆素对NE引起肾灌注压升高的影响，以此判断出其是否通过促进NO或PGI2生成而减小肾血管阻力。实验结果表明，加入阻断剂后，6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线左移，提示其通过促进NO和P GI2合成而松弛血管平滑肌从而减小肾血管阻力。
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近年来的研究表明肾小管上皮细胞受刺激后生成一种诱生型NO合成酶(iNOS)，促进NO的合成，对肾脏有损伤作用。本文加入L-NAME后，6,7-二甲氧基香豆素的NE量效曲线与不加L-NAME相比明显左移，所以6,7-二甲氧基香豆素主要是通过影响nNOS的活性，促进 NO的释放，从而引起血管松弛，对iNOS的影响甚微。
6,7-二甲氧基香豆素是川牛膝的一提取成分，而川牛膝又与抗厥注射液的抗ARF作用密切相关，以上研究表明6,7-二甲氧基香豆素可能是抗厥注射液中减小肾血管阻力的主要活性成分之一，在预防和治疗ARF中有重要的意义。6,7-二甲氧基香豆素在肾素-血管紧张素系统、多巴胺受体、血管紧张素受体、内皮素释放及细胞程序性死亡等方面与ARF有关的作用有待于进一步探讨。
*江苏省自然科学基金资助课题，BK 95134313
作者简介: 韩兴梅, 女, 24岁, 博士生；
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朱 荃,男,58岁,教授,博士生导师
参考文献
1 朱 荃，孙小玉，马 骋. 抗厥通脉注射液对肠系膜上动脉夹闭型及重症失血型休克家兔的作用. 中国药科大学学报，1996；27(1)：36～9
2 Huang JC, Wang XR. Effects of scoparone on hemodynamics in anesthetized rabbits. Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao, 1993;14(S uppl):S18～21
3 Huang HC, Lee CR. Vasodilator effect of scoparone (6,7-dimethoxycouma rin)from a Chinese herb. Eur J Pharmacol, 1992;218(1):123～8
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4 Shimahara Y. Pathophysiology of acute renal failure following living esc herichia coli injection in rats: high-energy metabolism and renal functions. Circ Shock, 1987;21:197
5 Bowan RH, Maack T. Glucose transport by the isolated perfused rat kidney. Am J Physiol, 1972;222(6):1499～504
6 Maack T. Physiological evaluation of the isolated perfused rat kidney. Am J Physiol, 1980;238:F71～8
7 Tongchuan Li, Kerin Croce, Raymond JW et al. Vasoconstricto rand vasodilator effect of serotinin in the isolated rabbit kidney. J Pharmacol Exp Ther, 1992;263(3):928～32
8 Kobzik L, Richard D, Kruse PE et al. Nitric oxide in skeletal muscle. Nature,1994;372:546～8
9 Rees DD, Palmer RMJ. Characterization of three inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo. Br J Pharmac ol, 1990;101:746～52
1998-07-14收稿，1999-01-07修回, 百拇医药