槲皮素对异丙肾上腺素所致大鼠所致大鼠心肌肥厚的影响*
作者：秦泰春 顾振纶 刘世增
单位：
关键词：槲皮素；异丙肾上腺素；心肌；肥厚；细胞培养；氧自由基；钙
中国药理学通报990413 摘要 目的 研究槲皮素(Que )对异丙肾上腺素(Iso)所致大鼠心肌肥厚的抑制作用及作用机制。方法Iso0。02mg.kg-1，每日两次，连续sc6wk，形成大鼠心肌肥厚模型，分别测定心脏各重量参数、心肌过氧化脂质(LPO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量，培养乳鼠心肌细胞，应用Fura-2/AM钙荧光指示齐技术测定心肌细胞内游离钙浓度。结果 Iso连续wk后，心肌和左心室重量明显增加，心肌LPO含量显著增加，SOD活性下降，心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量明显增加，给Que75mg.kg-1,150mg.kg-1和维拉帕米10mg.kg-1后均能明显减轻心肌肥厚，降低LPO含量，增加SOD活性，降低心肌Ca2+和主动脉Ca2+的含量，应用Fura-2/AM钙荧光指示剂技术发现Iso和H2O2能引起培养乳鼠心肌细胞内游离钙浓度明显升高。槲皮素对心肌细胞静息钙无明显影响，能抑制Iso和H2O2致培养乳鼠心肌细胞内游离钙浓度的升高。结论 Que能抑制Iso所引起的心肌肥厚, 该作用与清除氧自由基和降低心肌细胞内游离钙浓度有关。
, http://www.100md.com
中国国书分类号：R542.2;R972.9
文献标识码:A 文章编号 1001-1978(1999)04-0329-04
Effects of quercetin on cardiac hypertrophy
induced by isoprenaline in rats
QIN Tai-Chun, GU Zhen-Lun, LIU Shi-Zeng
(Dept of Pharmacology,Suzhou Medical College,Suzhou Insitute of Chinese Mate ria Medica,Suzhou 215007)
ABSTRACT AIM To study effects of quercetin(Q ue) on prevention of cardiac hypertrophy in rats induced by isoprenaline(Iso) an d its mechanism. METHODS Cardiac hypertrophic models of rats were induced by a continued administration of isoprenaline(Iso) 0.02 mg.kg-1 sc twice a day for six weeks, the ratio of heart wet weight and left h eart wet weight to body weight were significantly increased.The myocardial lipid peroxidation(LPO) contents increased, superoxide dismutase (SOD) activities dec reased, the calcium contents of myocardium and aorta artery were also increased . Intracelular free calcium concertration [Ca2+]i was measured with Ca 2+-sensitive fluorescent indicator Fura-2/AM in cultured neonatal rat he art cell. RESULTS By a continued administration of Iso for sex week s, the ra-tio of heart wet weight and left heart wet weight to body wweight significantly increased,the myocardial LPO content of myocardium and aorta artery also incresed.After treated with quercetin(Que)75,150mg.kg-1 and verpamil 10mg.kg-1 for five weeks,the cardiac hypertrophhy significantly improved.The myocardial LPO contents decreased,SOD activities increased,the calcium contents of myocardium and aorta artery were also decreased.Intracellular free calcium concentration[Ca2+]iwas measured with Ca2+-sensitive fluorescent indicator Fura-2/AM in cultured neonatal rat heart cells.There were no ef-fects of Que on the action in normol cells while Que 1～100μmol. L-1might relate to scavenging oxygen free radicals and decreasing the [Ca2+]i of the myocardial cells.
, 百拇医药
KEY WORDS quercetin;isoprenaline;myocardium hypertrophy;cell culture;oxygen free radical;calcium
心肌肥厚是心脏长期负荷过重时发生的一种心肌重构(remodeling)、重量异常增加，常导致心衰、严重的心律失常和重要的动脉分支破裂，因此防止心肌肥厚和血管硬化有重要的意义。现已发现钙拮抗剂和血管紧张素转化酶抑制剂[1，2]可以有效地防治心肌肥厚。槲皮素(quercetin, Que)为广泛存在于自然界中的黄酮类化合物，具有清除氧自由基，降血压，保护心肌缺血再灌注损伤，钙拮抗和蛋白激酶C抑制[3～5]等多种作用，但Que对心肌肥厚的作用未见报道，本工作通过研究Que对Iso所致大鼠心肌肥厚的影响及机制，进一步探讨槲皮素在心血管病中的治疗前景。
1 材料与方法
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1.1 材料
1.1.1 药品与试剂 Que：中国预防医学科学院劳动卫生研究所产品，批号：911015；水溶性Que：苏州中药研究所提供；异丙肾上腺素(isoprenaline, Iso)：上海禾丰制药有限公司产品，批号：951101；维拉帕米(verap amil,Ver)：连云港制药厂提供；Fura-2/AM：中国医学科学院药物研究所研制，临用前用DMSO配成1mmol.L-1, -20℃保存。
1.1.2 动物 Spraque-Dawley大鼠，♀♂兼用，体重200～240g，由苏州医学院实验动物中心提供。
1.1.3 仪器 原子吸收分光光度计：日立-18080型，荧光分光光度计：日立-860型，日立公司产品；紫外分光光度计：752-C型，上海第三分析仪器厂产品；Napco-5410型CO2培养箱，美国产。
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1.2 方法
1.2.1 心肌肥厚模型的建立和分组 取大鼠30只随机分为5组：Iso组； Que 75mg.kg-1+Iso组; Que 150mg.kg-1+Iso组；阳性对照组Ver 10mg.kg-1+Iso组。以上各组均sc Iso 0.02mg.kg -1，每日2次，连续sc 6wk,对照组sc相应容量生理盐水,开始注射1 wk后分别ig给Que 75mg.kg-1，150 mg*kg-1和Ver 10mg.kg-1，每日1次，连续 5 wk，Iso组和对照组给相应容量溶剂。
1.2.2 心脏重量参数的测定 先测大鼠体重(Body weight, bwt)，后将大鼠断头处死，开胸取心脏，吸干后，分别称全心重(He art wet weight, hwwt), 左心室重(Left heart wet weight, lhwwt)，测得全心重/体重(hwwt/bwt)和左心室重/体重(lhwwt/bwt)值，将左心室置液氮中备用。
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1.2.3 心肌组织SOD和LPO的测定 取出大鼠心脏，用冰冷的生理盐水冲洗,于左心室区取适当心肌组织，制成体积分数为10%的匀浆液，4℃26000r.min-1离心 30min, 取上清液，按邻苯三酚自氧化法测SOD活性[6], 按硫代巴比妥酸分光光度法测LPO的含量[7], 蛋白质测定按Lowery法[8]。
1.2.4 心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量的测定 心肌Ca2+含量测定按Daly [9]的方法用原子吸收分光光度计测定，单位换算成μmol.g-1 dry wt 计算心肌Ca2+含量。主动脉Ca2+含量的测定参照文献方法[10]：取大鼠主动脉条，去离子水冲洗干净，精确称重后，于100℃烘6 h，置1mol.L-1 HNO3中，37℃恒温振荡12h, 玻璃匀浆器匀浆后，加HNO3 2ml，连续37℃振荡24 h，离心1200 0×g，10min，取上清液，在原子吸收分光光度计上，于4227nm处测Ca2+ 的含量，以μmol.g-1 dry wt计算主动脉Ca2+含量。
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1.2.5 乳鼠心肌细胞的培养 参照文献[11]，取出生2～3 d的Wistar大鼠乳鼠，将左室剪成1 mm3大小，用胰蛋白酶分次消化法培养心肌细胞，将细胞密度调整到0.6×109.L-1左右，分到24孔板上, 37℃培养3h后，细胞开始贴壁生长,2d后用于实验。
1.2.6 Fura-2/AM负载和荧光测定 负载时，培养孔内加入4μmol.L-1负载液于37℃温孵40 min, 用Hanks液冲洗后，重新将细胞悬浮于Hanks液中，用于荧光测定。应用日立-860型荧光分光光度计首先测定负载前后激发光谱，Fura-2/AM负载后，最大激发光波长由原来385 nm处漂至340 nm处，说明负载成功，固定激发光波长340 nm,发射光波长500 nm, 观察不同处理过程中，Ca2+ 变化荧光值。由下式计算Ca2+的浓度[Ca2+]i=Kd(F-Fmi n)/(Fmax-F)。Kd为Fura-2/AM与Ca2+反应的解离常数，为2 24nmol.L-1;F为不同处理状态下的荧光值；Fmax为加入Triton X -100(终浓度为1g.L-1)后测得最大荧光值；Fmin为加入EDTA(终浓度为20mmol.L-1)测得最小荧光值。
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1.2.7 统计学方法 结果均以
±s表示，显著性差异用t检验。
2 结果
2.1 对连续注射Iso所致大鼠心肌肥厚的影响 表1结果表明连续注射Iso后，大鼠各心脏重量参数hwwt，lhwwt，hww t/bwt，lhwwt/bwt均增加，与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。给Que后，能抑制各心脏重量参数的增加，与模型组相比差异显著或非常显著(P<0.05，P<0.01)。
2.2 对肥厚大鼠心肌组织SOD和LPO及心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量的影响 表2结果表明连续注射Iso后，大鼠心肌组织SOD活性降低，LPO含量升高，心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量升高，与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。给Que后，能明显升高肥厚心肌组织SOD活性，降低LPO含量，降低心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量，与模型组相比差异显著或非常显著(P<0.05，P<0.01)。
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Tab 1 Effects of Que on weight of hypertrophic heart ind uced by Iso in rats(±s，n=6) Group
Dose
/mg.kg-1
bwt
/g
hwwt
/mg
lhwwt
/mg
, 百拇医药
hwwt/bwt
/mg.g-1
lhwwt/bwt
/mg.g-1
Control
224±15
684±14
481±71
3.07±0.2
2.14±0.19
, 百拇医药
Iso
242±19
988±115**
704±86**
4.08±0.26**
2.91±0.2**
Iso+Que
75
219±13
818±49**△△
567±44*△△
, 百拇医药
3.75±0.12**△
2.59 ±0.12**△△
Iso+Que
150
224±15
794±66**△△
562±38*△。
3.52±0.27*△△
2.47±0.25*△△
*P<0.05, **P<0.01，vs control，△P<0.05, △△P<0.01，vs IsoTab 2 Effects of Ques on myocardium SOD,LPO,Ca2+ and aorta Ca2+ contents of hypertrophic heart induced by Iso in ratsv(±s，n=6) Group
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Dose/mg.kg-1
SOD/U.g-1Pro
LPO/nmol.g-1Pro
Myocardium Ca2+/μmol.g-1
Aorta arterial Ca2+/μmol.g-1
Control
23.4±3.0
7.0±0.9
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1.9±0.4
10.1±4.2
Iso
16.4±2.6**
14.5±1.1**
3.3±0.5**
22.2±4.9**
Iso+Que
75
20.9±1.9△△
11.1±2.3**△△
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2.7±0.3**△
16.2±4.1*△
Iso+Que
150
21.9±2.4*△△
9.7±1.6*△△
2.3±0.5△△
14.1±3.5△△
Iso+Ver
10
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20.2±2.5△
10.6±1.6**△△
2.2±0.3△△
16.4±3.8*△
*P<0.05,**P<0.01,vs control,△P<0.05,△△P<0.01,vs Iso
2.3 对培养乳鼠心肌细胞Ca2+内流的影响 应用本法测得静息状态下心肌细胞胞浆游离[Ca2+]i为(79±9)nmol.L -1，加入水溶性Que1～100μmol.L-1对细胞静息[Ca2+]i无明显影响。给Iso 1μmol.L-1和终浓度为29.41mmol.L-1 H2O2后细胞[Ca2+]i分别升至(174±17)nmol.L-1和(212±21)nmol.L-1。Que 1～100μmol.L-1能剂量依赖性的抑制Iso引起[Ca2+]i的升高，抑制率分别为8%，16%，31%；明显抑制29.41 mmol.L-1 H2O2引起[Ca2+]i的升高, 抑制率分别为11%，28%，41%。Ver 10μmol.L-1对Iso 引起细胞[Ca2+]i的升高,抑制率为29%,对H2O2引起[Ca2+]i的升高抑制率为20%,结果见表3。
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Tab 3 Effects of Que on cytosolic free Ca2+ concentration
in cultured neonatal rat heart cells(±s，n=6) Group
Dose
/μmol.L-1
[Ca2+]i/nmol.L-1
Resting
, 百拇医药
Iso
H2O2
Control
79±9
174±17**
212±21**
Que
1
, 百拇医药
78±7
160±10
188±1##
100
77±6
128±20△△
128±11##
Ver
10
, 百拇医药
74±8
120±22△△
169±10##
**P<0.01，vs control; △P<0.05, △△P<0.01，vs Iso; #P<0.05, ##P<0.01，vs H 2O2
3 讨论
本工作从整体和细胞的水平研究了Que对Iso致大鼠心肌肥厚的作用及机制, 结果表明Que能够有效地减轻Iso所致大鼠心肌肥厚。小剂量Iso连续注射致心肌肥厚这一作用与其激活肾上腺素受体，增加心肌细胞合成代谢和钙负载[1]有关。本实验中，用小剂量Iso连续sc 6 wk后引起大鼠心肌肥厚，同时伴随心肌及主动脉钙含量明显增加，应用Fura-2/AM 技术发现Iso能引起培养乳鼠心肌细胞内钙明显升高。Iso能兴奋心肌细胞和平滑肌细胞上β受体；激活依赖cAMP蛋白激酶；钙通道磷酸化导致钙通道开放。Ca2+被公认是细胞生长过成中第二信使，Ca2+通道活化后通过特异的离子流激活胞核基因及增加胞浆蛋白质合成，Ca2+超载在心肌肥厚发展中起着非常重要的作用[11]，另一方面Ca2+超载与氧自由基的生成有着密切的关系，Iso诱发的大鼠心肌肥厚中心肌LPO含量显著增加，SOD活性下降，提示氧自由基可能参予Iso诱发的心肌肥厚，氧自由基又可进一步加重钙超载。应用Fura-2/AM技术发现H2O2能引起培养乳鼠心肌细胞内钙明显升高，氧自由基能使电压依赖性钙通道开放; Na+-Ca2+交换增强；线粒体膜脂质过氧化及细胞膜通透性增加引起钙超载。Que为钙拮抗剂，能够降低肥厚心肌及主动脉钙含量，对心肌细胞静息钙无明显影响，抑制Iso和H2O2引起培养乳鼠心肌细胞[Ca2+]i的升高, 同时Que为广泛存在于天然植物中的黄酮类化合物，具有很强的抗活性氧作用，Que能够降低肥厚心肌LPO含量，增加SOD活性，从而很好发挥抗心肌肥厚作用。
, 百拇医药
参考文献
1 饶曼人，刘 敏，陶 亮. 间硝苯地平和硝苯地平对异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚的影响. 中国药理学与毒理学杂志，1996；1 0：181～4
2 Lee RM, Berecek KH, Tsopor J et al. Triggle CR prevention of hype rtension and vascular changes by captopril treatment. Hypertension , 1997;17(2):141～50
3 Gu ZL,Xie ML,Qian ZN. Effects of quercetin on chemiluminescence of human platelets induced by arachidonic acid. Acta Pharmacol Sin, 1993;14:265～7
, 百拇医药
4 Xiao D, Gu ZL,Qian ZN. Effects of quercetin on platelet and reperfusi on-induced arrhythmias in rats. Acta Pharmacol Sin, 1993;14:505～7
5 Duarte J, Perez-Vizcaino F, Zarzue A et al. Inhibitory effects of quercetin and staurosporine on phasic contractions in rat vascular smooth muscl e. Europen Journal Pharmacology, 1994;262(1～2):149～56
6 谢卫华，姚菊芳，袁勤生. 邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的改进. 医药工业, 1988;19：217～9
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9 Daly MJ,Eiz JS, Nayler WG et al. Contractive and calciumparadox in the rat heart. Circ Res, 1987;61:560～9
10 姜 华，吴冬梅，饶曼人. 间硝苯地平对肾型高血压大鼠左心室顺应性及主动脉钙含量的影响. 中国药理学与毒理学杂志，1993；71(1)： 20～2
11 Harary I, Farley B. In vitro studies of single isolated beeting heart cells. Science, 1960;131:1 674～5
12 Marban E, Koretsune Y. Cell calcium, oncogenes, and hypertrophy. Hyperten sion, 1990；15(6pt 1):652～8, 百拇医药
单位：
关键词：槲皮素；异丙肾上腺素；心肌；肥厚；细胞培养；氧自由基；钙
中国药理学通报990413 摘要 目的 研究槲皮素(Que )对异丙肾上腺素(Iso)所致大鼠心肌肥厚的抑制作用及作用机制。方法Iso0。02mg.kg-1，每日两次，连续sc6wk，形成大鼠心肌肥厚模型，分别测定心脏各重量参数、心肌过氧化脂质(LPO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量，培养乳鼠心肌细胞，应用Fura-2/AM钙荧光指示齐技术测定心肌细胞内游离钙浓度。结果 Iso连续wk后，心肌和左心室重量明显增加，心肌LPO含量显著增加，SOD活性下降，心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量明显增加，给Que75mg.kg-1,150mg.kg-1和维拉帕米10mg.kg-1后均能明显减轻心肌肥厚，降低LPO含量，增加SOD活性，降低心肌Ca2+和主动脉Ca2+的含量，应用Fura-2/AM钙荧光指示剂技术发现Iso和H2O2能引起培养乳鼠心肌细胞内游离钙浓度明显升高。槲皮素对心肌细胞静息钙无明显影响，能抑制Iso和H2O2致培养乳鼠心肌细胞内游离钙浓度的升高。结论 Que能抑制Iso所引起的心肌肥厚, 该作用与清除氧自由基和降低心肌细胞内游离钙浓度有关。
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中国国书分类号：R542.2;R972.9
文献标识码:A 文章编号 1001-1978(1999)04-0329-04
Effects of quercetin on cardiac hypertrophy
induced by isoprenaline in rats
QIN Tai-Chun, GU Zhen-Lun, LIU Shi-Zeng
(Dept of Pharmacology,Suzhou Medical College,Suzhou Insitute of Chinese Mate ria Medica,Suzhou 215007)
ABSTRACT AIM To study effects of quercetin(Q ue) on prevention of cardiac hypertrophy in rats induced by isoprenaline(Iso) an d its mechanism. METHODS Cardiac hypertrophic models of rats were induced by a continued administration of isoprenaline(Iso) 0.02 mg.kg-1 sc twice a day for six weeks, the ratio of heart wet weight and left h eart wet weight to body weight were significantly increased.The myocardial lipid peroxidation(LPO) contents increased, superoxide dismutase (SOD) activities dec reased, the calcium contents of myocardium and aorta artery were also increased . Intracelular free calcium concertration [Ca2+]i was measured with Ca 2+-sensitive fluorescent indicator Fura-2/AM in cultured neonatal rat he art cell. RESULTS By a continued administration of Iso for sex week s, the ra-tio of heart wet weight and left heart wet weight to body wweight significantly increased,the myocardial LPO content of myocardium and aorta artery also incresed.After treated with quercetin(Que)75,150mg.kg-1 and verpamil 10mg.kg-1 for five weeks,the cardiac hypertrophhy significantly improved.The myocardial LPO contents decreased,SOD activities increased,the calcium contents of myocardium and aorta artery were also decreased.Intracellular free calcium concentration[Ca2+]iwas measured with Ca2+-sensitive fluorescent indicator Fura-2/AM in cultured neonatal rat heart cells.There were no ef-fects of Que on the action in normol cells while Que 1～100μmol. L-1might relate to scavenging oxygen free radicals and decreasing the [Ca2+]i of the myocardial cells.
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KEY WORDS quercetin;isoprenaline;myocardium hypertrophy;cell culture;oxygen free radical;calcium
心肌肥厚是心脏长期负荷过重时发生的一种心肌重构(remodeling)、重量异常增加，常导致心衰、严重的心律失常和重要的动脉分支破裂，因此防止心肌肥厚和血管硬化有重要的意义。现已发现钙拮抗剂和血管紧张素转化酶抑制剂[1，2]可以有效地防治心肌肥厚。槲皮素(quercetin, Que)为广泛存在于自然界中的黄酮类化合物，具有清除氧自由基，降血压，保护心肌缺血再灌注损伤，钙拮抗和蛋白激酶C抑制[3～5]等多种作用，但Que对心肌肥厚的作用未见报道，本工作通过研究Que对Iso所致大鼠心肌肥厚的影响及机制，进一步探讨槲皮素在心血管病中的治疗前景。
1 材料与方法
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1.1 材料
1.1.1 药品与试剂 Que：中国预防医学科学院劳动卫生研究所产品，批号：911015；水溶性Que：苏州中药研究所提供；异丙肾上腺素(isoprenaline, Iso)：上海禾丰制药有限公司产品，批号：951101；维拉帕米(verap amil,Ver)：连云港制药厂提供；Fura-2/AM：中国医学科学院药物研究所研制，临用前用DMSO配成1mmol.L-1, -20℃保存。
1.1.2 动物 Spraque-Dawley大鼠，♀♂兼用，体重200～240g，由苏州医学院实验动物中心提供。
1.1.3 仪器 原子吸收分光光度计：日立-18080型，荧光分光光度计：日立-860型，日立公司产品；紫外分光光度计：752-C型，上海第三分析仪器厂产品；Napco-5410型CO2培养箱，美国产。
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1.2 方法
1.2.1 心肌肥厚模型的建立和分组 取大鼠30只随机分为5组：Iso组； Que 75mg.kg-1+Iso组; Que 150mg.kg-1+Iso组；阳性对照组Ver 10mg.kg-1+Iso组。以上各组均sc Iso 0.02mg.kg -1，每日2次，连续sc 6wk,对照组sc相应容量生理盐水,开始注射1 wk后分别ig给Que 75mg.kg-1，150 mg*kg-1和Ver 10mg.kg-1，每日1次，连续 5 wk，Iso组和对照组给相应容量溶剂。
1.2.2 心脏重量参数的测定 先测大鼠体重(Body weight, bwt)，后将大鼠断头处死，开胸取心脏，吸干后，分别称全心重(He art wet weight, hwwt), 左心室重(Left heart wet weight, lhwwt)，测得全心重/体重(hwwt/bwt)和左心室重/体重(lhwwt/bwt)值，将左心室置液氮中备用。
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1.2.3 心肌组织SOD和LPO的测定 取出大鼠心脏，用冰冷的生理盐水冲洗,于左心室区取适当心肌组织，制成体积分数为10%的匀浆液，4℃26000r.min-1离心 30min, 取上清液，按邻苯三酚自氧化法测SOD活性[6], 按硫代巴比妥酸分光光度法测LPO的含量[7], 蛋白质测定按Lowery法[8]。
1.2.4 心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量的测定 心肌Ca2+含量测定按Daly [9]的方法用原子吸收分光光度计测定，单位换算成μmol.g-1 dry wt 计算心肌Ca2+含量。主动脉Ca2+含量的测定参照文献方法[10]：取大鼠主动脉条，去离子水冲洗干净，精确称重后，于100℃烘6 h，置1mol.L-1 HNO3中，37℃恒温振荡12h, 玻璃匀浆器匀浆后，加HNO3 2ml，连续37℃振荡24 h，离心1200 0×g，10min，取上清液，在原子吸收分光光度计上，于4227nm处测Ca2+ 的含量，以μmol.g-1 dry wt计算主动脉Ca2+含量。
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1.2.5 乳鼠心肌细胞的培养 参照文献[11]，取出生2～3 d的Wistar大鼠乳鼠，将左室剪成1 mm3大小，用胰蛋白酶分次消化法培养心肌细胞，将细胞密度调整到0.6×109.L-1左右，分到24孔板上, 37℃培养3h后，细胞开始贴壁生长,2d后用于实验。
1.2.6 Fura-2/AM负载和荧光测定 负载时，培养孔内加入4μmol.L-1负载液于37℃温孵40 min, 用Hanks液冲洗后，重新将细胞悬浮于Hanks液中，用于荧光测定。应用日立-860型荧光分光光度计首先测定负载前后激发光谱，Fura-2/AM负载后，最大激发光波长由原来385 nm处漂至340 nm处，说明负载成功，固定激发光波长340 nm,发射光波长500 nm, 观察不同处理过程中，Ca2+ 变化荧光值。由下式计算Ca2+的浓度[Ca2+]i=Kd(F-Fmi n)/(Fmax-F)。Kd为Fura-2/AM与Ca2+反应的解离常数，为2 24nmol.L-1;F为不同处理状态下的荧光值；Fmax为加入Triton X -100(终浓度为1g.L-1)后测得最大荧光值；Fmin为加入EDTA(终浓度为20mmol.L-1)测得最小荧光值。
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1.2.7 统计学方法 结果均以
±s表示，显著性差异用t检验。2 结果
2.1 对连续注射Iso所致大鼠心肌肥厚的影响 表1结果表明连续注射Iso后，大鼠各心脏重量参数hwwt，lhwwt，hww t/bwt，lhwwt/bwt均增加，与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。给Que后，能抑制各心脏重量参数的增加，与模型组相比差异显著或非常显著(P<0.05，P<0.01)。
2.2 对肥厚大鼠心肌组织SOD和LPO及心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量的影响 表2结果表明连续注射Iso后，大鼠心肌组织SOD活性降低，LPO含量升高，心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量升高，与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。给Que后，能明显升高肥厚心肌组织SOD活性，降低LPO含量，降低心肌Ca2+和主动脉Ca2+含量，与模型组相比差异显著或非常显著(P<0.05，P<0.01)。
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Tab 1 Effects of Que on weight of hypertrophic heart ind uced by Iso in rats(
±s，n=6) GroupDose
/mg.kg-1
bwt
/g
hwwt
/mg
lhwwt
/mg
, 百拇医药
hwwt/bwt
/mg.g-1
lhwwt/bwt
/mg.g-1
Control
224±15
684±14
481±71
3.07±0.2
2.14±0.19
, 百拇医药
Iso
242±19
988±115**
704±86**
4.08±0.26**
2.91±0.2**
Iso+Que
75
219±13
818±49**△△
567±44*△△
, 百拇医药
3.75±0.12**△
2.59 ±0.12**△△
Iso+Que
150
224±15
794±66**△△
562±38*△。
3.52±0.27*△△
2.47±0.25*△△
*P<0.05, **P<0.01，vs control，△P<0.05, △△P<0.01，vs IsoTab 2 Effects of Ques on myocardium SOD,LPO,Ca2+ and aorta Ca2+ contents of hypertrophic heart induced by Iso in ratsv(
±s，n=6) Group, 百拇医药
Dose/mg.kg-1
SOD/U.g-1Pro
LPO/nmol.g-1Pro
Myocardium Ca2+/μmol.g-1
Aorta arterial Ca2+/μmol.g-1
Control
23.4±3.0
7.0±0.9
, 百拇医药
1.9±0.4
10.1±4.2
Iso
16.4±2.6**
14.5±1.1**
3.3±0.5**
22.2±4.9**
Iso+Que
75
20.9±1.9△△
11.1±2.3**△△
, http://www.100md.com
2.7±0.3**△
16.2±4.1*△
Iso+Que
150
21.9±2.4*△△
9.7±1.6*△△
2.3±0.5△△
14.1±3.5△△
Iso+Ver
10
, http://www.100md.com
20.2±2.5△
10.6±1.6**△△
2.2±0.3△△
16.4±3.8*△
*P<0.05,**P<0.01,vs control,△P<0.05,△△P<0.01,vs Iso
2.3 对培养乳鼠心肌细胞Ca2+内流的影响 应用本法测得静息状态下心肌细胞胞浆游离[Ca2+]i为(79±9)nmol.L -1，加入水溶性Que1～100μmol.L-1对细胞静息[Ca2+]i无明显影响。给Iso 1μmol.L-1和终浓度为29.41mmol.L-1 H2O2后细胞[Ca2+]i分别升至(174±17)nmol.L-1和(212±21)nmol.L-1。Que 1～100μmol.L-1能剂量依赖性的抑制Iso引起[Ca2+]i的升高，抑制率分别为8%，16%，31%；明显抑制29.41 mmol.L-1 H2O2引起[Ca2+]i的升高, 抑制率分别为11%，28%，41%。Ver 10μmol.L-1对Iso 引起细胞[Ca2+]i的升高,抑制率为29%,对H2O2引起[Ca2+]i的升高抑制率为20%,结果见表3。
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Tab 3 Effects of Que on cytosolic free Ca2+ concentration
in cultured neonatal rat heart cells(
±s，n=6) GroupDose
/μmol.L-1
[Ca2+]i/nmol.L-1
Resting
, 百拇医药
Iso
H2O2
Control
79±9
174±17**
212±21**
Que
1
, 百拇医药
78±7
160±10
188±1##
100
77±6
128±20△△
128±11##
Ver
10
, 百拇医药
74±8
120±22△△
169±10##
**P<0.01，vs control; △P<0.05, △△P<0.01，vs Iso; #P<0.05, ##P<0.01，vs H 2O2
3 讨论
本工作从整体和细胞的水平研究了Que对Iso致大鼠心肌肥厚的作用及机制, 结果表明Que能够有效地减轻Iso所致大鼠心肌肥厚。小剂量Iso连续注射致心肌肥厚这一作用与其激活肾上腺素受体，增加心肌细胞合成代谢和钙负载[1]有关。本实验中，用小剂量Iso连续sc 6 wk后引起大鼠心肌肥厚，同时伴随心肌及主动脉钙含量明显增加，应用Fura-2/AM 技术发现Iso能引起培养乳鼠心肌细胞内钙明显升高。Iso能兴奋心肌细胞和平滑肌细胞上β受体；激活依赖cAMP蛋白激酶；钙通道磷酸化导致钙通道开放。Ca2+被公认是细胞生长过成中第二信使，Ca2+通道活化后通过特异的离子流激活胞核基因及增加胞浆蛋白质合成，Ca2+超载在心肌肥厚发展中起着非常重要的作用[11]，另一方面Ca2+超载与氧自由基的生成有着密切的关系，Iso诱发的大鼠心肌肥厚中心肌LPO含量显著增加，SOD活性下降，提示氧自由基可能参予Iso诱发的心肌肥厚，氧自由基又可进一步加重钙超载。应用Fura-2/AM技术发现H2O2能引起培养乳鼠心肌细胞内钙明显升高，氧自由基能使电压依赖性钙通道开放; Na+-Ca2+交换增强；线粒体膜脂质过氧化及细胞膜通透性增加引起钙超载。Que为钙拮抗剂，能够降低肥厚心肌及主动脉钙含量，对心肌细胞静息钙无明显影响，抑制Iso和H2O2引起培养乳鼠心肌细胞[Ca2+]i的升高, 同时Que为广泛存在于天然植物中的黄酮类化合物，具有很强的抗活性氧作用，Que能够降低肥厚心肌LPO含量，增加SOD活性，从而很好发挥抗心肌肥厚作用。
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参考文献
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