六味地黄多糖体外抗肿瘤作用的初步研究*
作者：齐春会 张永祥 李凤仙 乔善义 姚新生 山田阳城
单位：齐春会 张永祥 李凤仙 乔善义 (军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)；姚新生 沈阳药科大学药理学教研室，沈阳 110015；山田阳城 日本北里研究院附属东洋医学综合研究所，东京 108-8692
关键词：六味地黄多糖；抗肿瘤；分化；HL60； L1210
中国药理学通报990411
摘要 目的 六味地黄多糖CA4-3B和P-3是具有免疫调节作用的活性多糖，在此基础上进一步观察其体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用。方法 用[3H]-TdR参入法，琼脂克隆形成法及细胞形态学和NBT还原染色等方法观察其对小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210、人早幼粒白血病细胞系HL60增殖反应、克隆存活率的影响以及对HL60细胞的分化诱导作用。结果 CA4-3B和P-3对L1210和HL60 细胞的体外增殖反应和克隆形成率具有不同程度的抑制作用，对HL60细胞的分化形态及NBT 阳性细胞率无明显影响，但可以使HL60细胞体积明显缩小。结论 六味地黄多糖CA4-3B和P-3对肿瘤细胞生长有抑制作用，可能是具有免疫调节和直接抑瘤双重作用的活性多糖；另外提示CA4-3B和P-3对HL60细胞分化有一定的诱导作用。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R 284.1； R 965； R 979.1
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0322-04
Preliminary study on anti-tumor action of polysaccharides
isolated from Liuwei Dihuang Decoction in vitro
QI Chun-Hui， ZHANG Yong-Xiang， LI Feng-Xian， QIAO Shan-Yi
(Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)
, 百拇医药
YAO Xin-Sheng，Dept of Pharmacology, Shenyang Pharmaceutical University, 110015；
Haruki Yamada
Oriental Medicine Research Center of the Kitasato institute, Tokyo 108-86 92，Japan
ABSTRACT AIM To explore the inhibitory effect s o f CA4-3B and P-3, the polysaccharides from Liuwei Dihuang Decoction, on growth of tumor cells in vitro on the basis of their immuno-modulation. M ETHODS The effects of CA4-3B and P-3 on cell proliferation, clone survi val and induction of differentiation of L1210 and HL60 cells were evaluated with [3H]-TdR incorporation, clone forming assay in agar, and cell morpho logy and NBT reduction staining respectively. RESULTS CA4-3B and P -3 inhibited the cell proliferation and clone survival of L1210 and HL60 in vitro. The morphology and NBT positive rate of HL60 cells were not affected except that the cell volums were reduced. CONCLUSION The growth of tumor cells was inhibited by treatment with CA4-3B and P-3, which may be double-active polysaccharides with both immuno-modulating action and anti-tu mor effect. The effect on induction of HL60 cell differentiation was also suggested.
, 百拇医药
KEY WORDS Liuwei Dihuang Decoction; polysaccharides; cell differentiation anti-tumor; differentiation; HL60; L1210
六味地黄汤(LW)是中药滋补肾阴的经典代表名方，在中医临床医疗中广为应用。现代药理学研究表明，该方具有抗肿瘤、调节机体免疫功能等多种生物学活性[1～3]。我们在研究其免疫药理活性物质基础的过程中，以免疫活性评价为导向，从LW中分离获得了7个酸性多糖，其中多糖CA4-3B和P-3是两个均一多糖。初步活性评价结果表明，CA4-3B和P-3体外应用可促进正常小鼠脾细胞增殖反应[4]，提示二者对正常小鼠的淋巴细胞具有直接促进增殖的作用。为观察CA4-3B及P-3对恶变的淋巴细胞的作用性质，本研究选择了小鼠淋巴细胞白血病L1210细胞系、人早幼粒白血病HL60细胞系，观察了两个多糖对其增殖反应及克隆存活率的影响，进而观察了其对HL60细胞的分化诱导作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞系 小鼠淋巴细胞白血病L 1210细胞和人早幼粒白血病HL60细胞均为本室保种传代细胞系。
1.2 药物与试剂 六味地黄多糖CA 4-3B和P-3为均一多糖，相对分子质量分别为28000和7300，糖组成CA4-3B主要由半乳糖醛酸(Gal A)和葡萄糖醛酸(Glc A)组成，P-3主要由Gal A组成，均由本所植化室分离制备。实验时用生理盐水溶解，滤膜除菌备用。
RPMI 1640培养液：Gibco产品，配制时加入青霉素1×105 U.L-1、链霉素100mg.L-1、Hepes 10 mmol.L-1和L-谷氨酰胺2mmol.L-1，使用时加入体积分数为10%～15%的小牛血清。[3H]-TdR：中科院北京原子能研究所，比活性740 MBq.mol-1。顺铂(DDP)：齐鲁制药厂产品，生理盐水溶解，滤膜过滤除菌，分装-20℃冻存。维生素A酸(RA)由北京中国科学院药物所提供，12-视黄酸13-乙酸佛波二酯(phorbol 12-retinoate 13-acetate)Sigma产品，均用DMSO溶解，分装-20℃冻存。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)：上海前进试剂厂产品，临用前用少量DMSO溶解后加培养液至1 g.L-1浓度。
, http://www.100md.com
1.3 实验方法 L1210和HL60细胞在含体积分数为15%小牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养，取对数生长期、形态良好的细胞用于实验。
1.3.1 肿瘤细胞增殖反应 [3H ]-TdR参入法[5]，实验孔分别加入肿瘤细胞(终浓度每毫升含5×104个细胞)及不同浓度的药物(对照孔以培养液代替)于96孔培养板，37℃ 0.05 CO2饱和湿度条件下培养48h或96h，培养结束前8 h每孔加入1 8.5 GBq [3H]-TdR，收集细胞，于液闪计数仪测定cpm值，结果以每样品3复孔平均cpm值表示。
1.3.2 克隆形成实验 琼脂克隆平皿法，参考文献[6]进行。每皿接种1.5×102细胞，培养8d后，低倍镜下检测每平皿内>50个细胞组成的克隆数。
, http://www.100md.com
1.3.3 细胞形态学和NBT还原反应 取指数生长期细胞加入不同浓度的药物或RA，于上述条件下培养6 d。培养结束后，按文献[7]方法进行。镜检200个细胞中早、中、晚幼粒，干状核及分叶核细胞数，或者NBT还原染色后镜检有兰黑色沉淀的阳性细胞数，计百分率。
2 实验结果
2.1 CA4-3B和P-3对L1210、HL60细胞增殖反应的抑制作用 CA4-3B和P-3与肿瘤细胞作用48 h对细胞增殖的抑制作用见表1和表2。由表1可见，阳性对照药DDP(0.1mg.L-1)对L1210细胞增殖具有明显的抑制作用，抑制率为65.6%，CA4-3B在0.5～50 mg.L-1剂量范围内无明显影响(数据未提供)，P-3在2.5～50 mg.L-1时具有明显的抑制作用，抑制率在40%左右。而对于HL60细胞，CA4-3B和P-3与细胞作用48 h均没有明显的抑制作用(数据未提供)，当作用时间延长到96 h时(表2)CA4-3B(50 mg.L-1)则表现出轻度的抑制作用，抑制率为16.6%，但P-3的作用仍不明显(数据未提供)。
, 百拇医药
Tab 1 The effect of P-3 on L1210 proliferation(
±s,n=3) Group
Dose/mg.L-1
[3H]-TdR
/min-1
Inhibited R ate
/%
Control
-
4194±613
, http://www.100md.com
/
DDP
0.1
1444±111
65.6
P-3
0.5
3178±811
24.2
2.5
2555±413**
39.0
, 百拇医药
10.0
2540±317**
39.4
50.0
2466±273**
41.2
**P<0.01, vs control,t testTab 2 The effect of CA4-3B on HL60 proliferation(±s,n=3) Groups
Dose
, http://www.100md.com /mg.L-1
[3H]-TdR
/min-1
Inhibited rate
/%
Control
/
99220±3052
/
DDP
0.2
8801±426**
, 百拇医药
91.1
CA4-3B
0.5
95661±15337
3.6
2.5
99926±10072
-0.7
10.0
91890±10671
7.4
50.0
82800±837**
, 百拇医药
16.6
**P<0.001, vs control2.2 CA4-3B和P-3对L1210、HL60细胞克隆存活的抑制作用 CA4-3B和P-3在10～100mg.L-1剂量范围内与细胞连续作用8d，对L1210及HL 60的克隆形成均有一定的抑制作用，其中对L1210的作用更为明显(表3)。
Tab 3 The effect of CA4-3B and P-3 on clone survival of L1210 and HL60 cells(±s,n=3) Group
Dose/mg.L-1
L1210
, 百拇医药
HL60
Clones/Plate
Inhibited rate/%
Clones/Plate
Inhibited rate/%
Control
/
106±3
/
97±7
/
DDP
, 百拇医药
0.1
0**
100
36±4**
62.9
CA4-3B
10
56±2**
47.2
82±5*
15.5
50
, 百拇医药
59±3**
44.3
76±5**
21.6
100
77±3**
27.4
82±6*
15.5
P-3
10
68±1**
, 百拇医药
35.8
85±6*
12.4
50
67±5**
37.0
86±7
11.3
100
79±4**
25.5
78±2**
, 百拇医药
19.6
*P<0.05, **P<0.01， vs control
2.3 CA4-3B和P-3对HL60 NBT阳性细胞率和细胞形态的影响 RA(阳性对照药)、CA4-3B和P-3与HL60细胞连续作用6 d，RA组(0.3mg.L-1)NBT阳性细胞率达97.5%，而且99.0%以上的细胞由早幼粒向中、晚幼粒细胞分化；CA4-3B和P-3组(50和100mg.L-1)则仅见个别细胞有NBT染色，阳性率<1 .0%(数据未提供)，细胞分化形态也未见明显变化，99.0%以上的细胞仍为早幼粒细胞，但细胞体积较对照组明显缩小(图1)。
Fig 1 The effect on HL60 cell morphology
, 百拇医药
of CA4-3B and P-3(×1000)
A：HL60细胞；B：RA 0.3mg.L-1；C：CA4-3B 50mg.L-1；D：P-3 50mg.L-1
3 讨论
大量实验药理学研究表明，许多中药来源的多糖具有一定的抗肿瘤活性，其作用机制被认为主要与增强机体的免疫细胞功能有关，而不是直接抑制瘤细胞的生长，如香菇多糖、猪苓多糖等[8,9]。虽然也有一些研究报道某些多糖如刺五加多糖、茯苓多糖等[10,11]体外应用对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，但由于制剂纯度不明确，对于阐明多糖直接抑制肿瘤细胞生长的作用尚缺乏可靠的证据。本研究所采用的酸性多糖CA4-3B和P-3组成、结构明确，纯度均在99.0%以上，实验结果表明二者体外对L1210和HL60细胞具有抑制增殖和克隆形成的作用，这为多糖直接抑制肿瘤细胞增殖的作用提供了实验依据，提示多糖的抗肿瘤活性可通过增强机体的免疫抗肿瘤机制和直接抑制肿瘤细胞的增殖两条途径而发挥。此外，已有研究表明[4]，CA4-3B和P-3对正常及快速老化模型小鼠脾细胞增殖反应具有直接增强作用；结合本研究结果，提示CA4-3B和P-3可能是具有免疫调节和直接抑瘤双重作用的活性多糖，是六味地黄汤发挥免疫调节及抗肿瘤作用的活性成分之一。值得提出的是P-3在2.5～50.0mg.L-1剂量范围内，对L1210细胞增殖反应的抑制率均在40%左右，无一般药物所具有的量效关系，原因不太清楚，有必要对其作用机制进行深入研究。 检测肿瘤细胞增殖的同位素参入法及克隆形成法具有不同的特点。前者主要通过细胞增殖过程中DNA的合成量反映细胞的增殖能力，与克隆法相比周期短；克隆形成率则反映细胞分裂增殖能力，周期长；后者是评价抗肿瘤药物较为理想灵敏的指标。本研究应用[3H]-TdR参入法所得实验结果表明，CA4-3B和P-3与细胞作用2d时，只有P-3对L1210细胞增殖有较强的抑制作用；当培养时间延长到4d，CA4-3B对HL60细胞则表现出一定的抑制作用。克隆形成率测定结果发现，CA4-3B和P-3与细胞作用8 d，对L1210及HL60细胞分裂增殖能力均具有明显的抑制作用。另外，CA4-3B和P-3对克隆存活的抑制作用无一定的量效关系，当其剂量增大时其克隆抑制率反而有下降的趋势。这种作用特点及上述时间依赖性对肿瘤细胞增殖的抑制作用提示多糖的抗肿瘤活性可能具有独特的作用机制，并非一般细胞毒性作用。
, 百拇医药
鉴于这种作用方式与细胞毒性药物不同，我们观察了CA4-3B和P-3对肿瘤细胞的诱导分化作用，结果发现二者对肿瘤细胞无明显的诱导分化作用，但使细胞体积明显缩小。一般认为，肿瘤细胞因其代谢旺盛、蛋白与核酸合成增加，可出现细胞体积增大并能进行分裂，成熟的淋巴细胞则较幼稚细胞体积缩小。CA4-3B和P-3使恶变的淋巴细胞体积明显缩小，提示其对肿瘤细胞的增殖与分化过程具有一定的影响，其机制还有待从其它方面进一步探讨。
*国家自然科学基金重点项目资助课题，No 39730480
作者简介：齐春会，女，31岁，助理研究员；
张永祥，男，41岁，研究员，主要从事补益类中药复方及单味药来源多糖及寡糖对神经内分泌免疫调节网络作用的研究
参考文献
, http://www.100md.com 1 李 萍，石晓宏，王凤连. 六味地黄丸和地黄的免疫药理研究. 中国免疫学杂志，1987；3(5):296～8
2 贾泰元. 六味地黄丸的免疫调节作用. 中成药, 1994;16(9):34～5
3 姜廷良. 六味地黄防治肿瘤的实验及临床研究.见：周金黄，刘干中主编. 中药药理与临床研究进展. 第1册，北京：中国科学技术出版社，1992：21 2～28
4 齐春会，张永祥，乔善义et al. 六味地黄多糖体外对正常及衰老小鼠脾细胞免疫功能的影响. 中国药理学通报，1999;15(1)：157～60
5 丁 雁，邢善田，周金黄. 淫羊藿多糖促进小鼠T和B细胞[3H]-TdR参入和诱生干扰素作用的研究. 中国免疫学杂志, 1985;1(6) :42
, http://www.100md.com
6 李凤仙，冯杏婉，程军平,魏 文.氮芥抗药性人早幼粒白血病HL60细胞亚系的建立及其生物特性. 癌症, 1994;13(3):206～10
7 范 恿, 杜德林,李秀勃. 茯苓素对人早幼粒白血病细胞(HL60)的诱导分化作用. 军事医学科学院院刊, 1988;12(2):132
8 Yamasaki K, Sone S, Yamashita T, Ogura T.Synergistic induction of lym phokine(IL-2)-activated killer activity by IL-2 and the polysaccharides lenti nan and therapy of spontaneous pulmonary metastases. Cancer Immunol Immunother , 1989;29:87～92
9 张昌菊. 猪苓多糖抗肿瘤作用的机制研究. 宜昌医学高专学报, 1995;23(3):150～2
10 佟 丽，黄添友，梁 谋et al.刺五加多糖抗肿瘤作用与作用机制的实验研究. 中国药理学通报，1994；10(2):105～9
11 吴 波，梁 谋，佟 丽et al.茯苓多糖抗肿瘤作用与作用机制的实验研究. 中国药理学通报, 1994;10(4):300～4
1999-01-15收稿，1999-04-21修回, 百拇医药
单位：齐春会 张永祥 李凤仙 乔善义 (军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)；姚新生 沈阳药科大学药理学教研室，沈阳 110015；山田阳城 日本北里研究院附属东洋医学综合研究所，东京 108-8692
关键词：六味地黄多糖；抗肿瘤；分化；HL60； L1210
中国药理学通报990411
摘要 目的 六味地黄多糖CA4-3B和P-3是具有免疫调节作用的活性多糖，在此基础上进一步观察其体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用。方法 用[3H]-TdR参入法，琼脂克隆形成法及细胞形态学和NBT还原染色等方法观察其对小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210、人早幼粒白血病细胞系HL60增殖反应、克隆存活率的影响以及对HL60细胞的分化诱导作用。结果 CA4-3B和P-3对L1210和HL60 细胞的体外增殖反应和克隆形成率具有不同程度的抑制作用，对HL60细胞的分化形态及NBT 阳性细胞率无明显影响，但可以使HL60细胞体积明显缩小。结论 六味地黄多糖CA4-3B和P-3对肿瘤细胞生长有抑制作用，可能是具有免疫调节和直接抑瘤双重作用的活性多糖；另外提示CA4-3B和P-3对HL60细胞分化有一定的诱导作用。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R 284.1； R 965； R 979.1
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0322-04
Preliminary study on anti-tumor action of polysaccharides
isolated from Liuwei Dihuang Decoction in vitro
QI Chun-Hui， ZHANG Yong-Xiang， LI Feng-Xian， QIAO Shan-Yi
(Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)
, 百拇医药
YAO Xin-Sheng，Dept of Pharmacology, Shenyang Pharmaceutical University, 110015；
Haruki Yamada
Oriental Medicine Research Center of the Kitasato institute, Tokyo 108-86 92，Japan
ABSTRACT AIM To explore the inhibitory effect s o f CA4-3B and P-3, the polysaccharides from Liuwei Dihuang Decoction, on growth of tumor cells in vitro on the basis of their immuno-modulation. M ETHODS The effects of CA4-3B and P-3 on cell proliferation, clone survi val and induction of differentiation of L1210 and HL60 cells were evaluated with [3H]-TdR incorporation, clone forming assay in agar, and cell morpho logy and NBT reduction staining respectively. RESULTS CA4-3B and P -3 inhibited the cell proliferation and clone survival of L1210 and HL60 in vitro. The morphology and NBT positive rate of HL60 cells were not affected except that the cell volums were reduced. CONCLUSION The growth of tumor cells was inhibited by treatment with CA4-3B and P-3, which may be double-active polysaccharides with both immuno-modulating action and anti-tu mor effect. The effect on induction of HL60 cell differentiation was also suggested.
, 百拇医药
KEY WORDS Liuwei Dihuang Decoction; polysaccharides; cell differentiation anti-tumor; differentiation; HL60; L1210
六味地黄汤(LW)是中药滋补肾阴的经典代表名方，在中医临床医疗中广为应用。现代药理学研究表明，该方具有抗肿瘤、调节机体免疫功能等多种生物学活性[1～3]。我们在研究其免疫药理活性物质基础的过程中，以免疫活性评价为导向，从LW中分离获得了7个酸性多糖，其中多糖CA4-3B和P-3是两个均一多糖。初步活性评价结果表明，CA4-3B和P-3体外应用可促进正常小鼠脾细胞增殖反应[4]，提示二者对正常小鼠的淋巴细胞具有直接促进增殖的作用。为观察CA4-3B及P-3对恶变的淋巴细胞的作用性质，本研究选择了小鼠淋巴细胞白血病L1210细胞系、人早幼粒白血病HL60细胞系，观察了两个多糖对其增殖反应及克隆存活率的影响，进而观察了其对HL60细胞的分化诱导作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞系 小鼠淋巴细胞白血病L 1210细胞和人早幼粒白血病HL60细胞均为本室保种传代细胞系。
1.2 药物与试剂 六味地黄多糖CA 4-3B和P-3为均一多糖，相对分子质量分别为28000和7300，糖组成CA4-3B主要由半乳糖醛酸(Gal A)和葡萄糖醛酸(Glc A)组成，P-3主要由Gal A组成，均由本所植化室分离制备。实验时用生理盐水溶解，滤膜除菌备用。
RPMI 1640培养液：Gibco产品，配制时加入青霉素1×105 U.L-1、链霉素100mg.L-1、Hepes 10 mmol.L-1和L-谷氨酰胺2mmol.L-1，使用时加入体积分数为10%～15%的小牛血清。[3H]-TdR：中科院北京原子能研究所，比活性740 MBq.mol-1。顺铂(DDP)：齐鲁制药厂产品，生理盐水溶解，滤膜过滤除菌，分装-20℃冻存。维生素A酸(RA)由北京中国科学院药物所提供，12-视黄酸13-乙酸佛波二酯(phorbol 12-retinoate 13-acetate)Sigma产品，均用DMSO溶解，分装-20℃冻存。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)：上海前进试剂厂产品，临用前用少量DMSO溶解后加培养液至1 g.L-1浓度。
, http://www.100md.com
1.3 实验方法 L1210和HL60细胞在含体积分数为15%小牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养，取对数生长期、形态良好的细胞用于实验。
1.3.1 肿瘤细胞增殖反应 [3H ]-TdR参入法[5]，实验孔分别加入肿瘤细胞(终浓度每毫升含5×104个细胞)及不同浓度的药物(对照孔以培养液代替)于96孔培养板，37℃ 0.05 CO2饱和湿度条件下培养48h或96h，培养结束前8 h每孔加入1 8.5 GBq [3H]-TdR，收集细胞，于液闪计数仪测定cpm值，结果以每样品3复孔平均cpm值表示。
1.3.2 克隆形成实验 琼脂克隆平皿法，参考文献[6]进行。每皿接种1.5×102细胞，培养8d后，低倍镜下检测每平皿内>50个细胞组成的克隆数。
, http://www.100md.com
1.3.3 细胞形态学和NBT还原反应 取指数生长期细胞加入不同浓度的药物或RA，于上述条件下培养6 d。培养结束后，按文献[7]方法进行。镜检200个细胞中早、中、晚幼粒，干状核及分叶核细胞数，或者NBT还原染色后镜检有兰黑色沉淀的阳性细胞数，计百分率。
2 实验结果
2.1 CA4-3B和P-3对L1210、HL60细胞增殖反应的抑制作用 CA4-3B和P-3与肿瘤细胞作用48 h对细胞增殖的抑制作用见表1和表2。由表1可见，阳性对照药DDP(0.1mg.L-1)对L1210细胞增殖具有明显的抑制作用，抑制率为65.6%，CA4-3B在0.5～50 mg.L-1剂量范围内无明显影响(数据未提供)，P-3在2.5～50 mg.L-1时具有明显的抑制作用，抑制率在40%左右。而对于HL60细胞，CA4-3B和P-3与细胞作用48 h均没有明显的抑制作用(数据未提供)，当作用时间延长到96 h时(表2)CA4-3B(50 mg.L-1)则表现出轻度的抑制作用，抑制率为16.6%，但P-3的作用仍不明显(数据未提供)。
, 百拇医药
Tab 1 The effect of P-3 on L1210 proliferation(
±s,n=3) GroupDose/mg.L-1
[3H]-TdR
/min-1
Inhibited R ate
/%
Control
-
4194±613
, http://www.100md.com
/
DDP
0.1
1444±111
65.6
P-3
0.5
3178±811
24.2
2.5
2555±413**
39.0
, 百拇医药
10.0
2540±317**
39.4
50.0
2466±273**
41.2
**P<0.01, vs control,t testTab 2 The effect of CA4-3B on HL60 proliferation(
±s,n=3) GroupsDose
, http://www.100md.com /mg.L-1
[3H]-TdR
/min-1
Inhibited rate
/%
Control
/
99220±3052
/
DDP
0.2
8801±426**
, 百拇医药
91.1
CA4-3B
0.5
95661±15337
3.6
2.5
99926±10072
-0.7
10.0
91890±10671
7.4
50.0
82800±837**
, 百拇医药
16.6
**P<0.001, vs control2.2 CA4-3B和P-3对L1210、HL60细胞克隆存活的抑制作用 CA4-3B和P-3在10～100mg.L-1剂量范围内与细胞连续作用8d，对L1210及HL 60的克隆形成均有一定的抑制作用，其中对L1210的作用更为明显(表3)。
Tab 3 The effect of CA4-3B and P-3 on clone survival of L1210 and HL60 cells(
±s,n=3) GroupDose/mg.L-1
L1210
, 百拇医药
HL60
Clones/Plate
Inhibited rate/%
Clones/Plate
Inhibited rate/%
Control
/
106±3
/
97±7
/
DDP
, 百拇医药
0.1
0**
100
36±4**
62.9
CA4-3B
10
56±2**
47.2
82±5*
15.5
50
, 百拇医药
59±3**
44.3
76±5**
21.6
100
77±3**
27.4
82±6*
15.5
P-3
10
68±1**
, 百拇医药
35.8
85±6*
12.4
50
67±5**
37.0
86±7
11.3
100
79±4**
25.5
78±2**
, 百拇医药
19.6
*P<0.05, **P<0.01， vs control
2.3 CA4-3B和P-3对HL60 NBT阳性细胞率和细胞形态的影响 RA(阳性对照药)、CA4-3B和P-3与HL60细胞连续作用6 d，RA组(0.3mg.L-1)NBT阳性细胞率达97.5%，而且99.0%以上的细胞由早幼粒向中、晚幼粒细胞分化；CA4-3B和P-3组(50和100mg.L-1)则仅见个别细胞有NBT染色，阳性率<1 .0%(数据未提供)，细胞分化形态也未见明显变化，99.0%以上的细胞仍为早幼粒细胞，但细胞体积较对照组明显缩小(图1)。
Fig 1 The effect on HL60 cell morphology
, 百拇医药
of CA4-3B and P-3(×1000)
A：HL60细胞；B：RA 0.3mg.L-1；C：CA4-3B 50mg.L-1；D：P-3 50mg.L-1
3 讨论
大量实验药理学研究表明，许多中药来源的多糖具有一定的抗肿瘤活性，其作用机制被认为主要与增强机体的免疫细胞功能有关，而不是直接抑制瘤细胞的生长，如香菇多糖、猪苓多糖等[8,9]。虽然也有一些研究报道某些多糖如刺五加多糖、茯苓多糖等[10,11]体外应用对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，但由于制剂纯度不明确，对于阐明多糖直接抑制肿瘤细胞生长的作用尚缺乏可靠的证据。本研究所采用的酸性多糖CA4-3B和P-3组成、结构明确，纯度均在99.0%以上，实验结果表明二者体外对L1210和HL60细胞具有抑制增殖和克隆形成的作用，这为多糖直接抑制肿瘤细胞增殖的作用提供了实验依据，提示多糖的抗肿瘤活性可通过增强机体的免疫抗肿瘤机制和直接抑制肿瘤细胞的增殖两条途径而发挥。此外，已有研究表明[4]，CA4-3B和P-3对正常及快速老化模型小鼠脾细胞增殖反应具有直接增强作用；结合本研究结果，提示CA4-3B和P-3可能是具有免疫调节和直接抑瘤双重作用的活性多糖，是六味地黄汤发挥免疫调节及抗肿瘤作用的活性成分之一。值得提出的是P-3在2.5～50.0mg.L-1剂量范围内，对L1210细胞增殖反应的抑制率均在40%左右，无一般药物所具有的量效关系，原因不太清楚，有必要对其作用机制进行深入研究。 检测肿瘤细胞增殖的同位素参入法及克隆形成法具有不同的特点。前者主要通过细胞增殖过程中DNA的合成量反映细胞的增殖能力，与克隆法相比周期短；克隆形成率则反映细胞分裂增殖能力，周期长；后者是评价抗肿瘤药物较为理想灵敏的指标。本研究应用[3H]-TdR参入法所得实验结果表明，CA4-3B和P-3与细胞作用2d时，只有P-3对L1210细胞增殖有较强的抑制作用；当培养时间延长到4d，CA4-3B对HL60细胞则表现出一定的抑制作用。克隆形成率测定结果发现，CA4-3B和P-3与细胞作用8 d，对L1210及HL60细胞分裂增殖能力均具有明显的抑制作用。另外，CA4-3B和P-3对克隆存活的抑制作用无一定的量效关系，当其剂量增大时其克隆抑制率反而有下降的趋势。这种作用特点及上述时间依赖性对肿瘤细胞增殖的抑制作用提示多糖的抗肿瘤活性可能具有独特的作用机制，并非一般细胞毒性作用。
, 百拇医药
鉴于这种作用方式与细胞毒性药物不同，我们观察了CA4-3B和P-3对肿瘤细胞的诱导分化作用，结果发现二者对肿瘤细胞无明显的诱导分化作用，但使细胞体积明显缩小。一般认为，肿瘤细胞因其代谢旺盛、蛋白与核酸合成增加，可出现细胞体积增大并能进行分裂，成熟的淋巴细胞则较幼稚细胞体积缩小。CA4-3B和P-3使恶变的淋巴细胞体积明显缩小，提示其对肿瘤细胞的增殖与分化过程具有一定的影响，其机制还有待从其它方面进一步探讨。
*国家自然科学基金重点项目资助课题，No 39730480
作者简介：齐春会，女，31岁，助理研究员；
张永祥，男，41岁，研究员，主要从事补益类中药复方及单味药来源多糖及寡糖对神经内分泌免疫调节网络作用的研究
参考文献
, http://www.100md.com 1 李 萍，石晓宏，王凤连. 六味地黄丸和地黄的免疫药理研究. 中国免疫学杂志，1987；3(5):296～8
2 贾泰元. 六味地黄丸的免疫调节作用. 中成药, 1994;16(9):34～5
3 姜廷良. 六味地黄防治肿瘤的实验及临床研究.见：周金黄，刘干中主编. 中药药理与临床研究进展. 第1册，北京：中国科学技术出版社，1992：21 2～28
4 齐春会，张永祥，乔善义et al. 六味地黄多糖体外对正常及衰老小鼠脾细胞免疫功能的影响. 中国药理学通报，1999;15(1)：157～60
5 丁 雁，邢善田，周金黄. 淫羊藿多糖促进小鼠T和B细胞[3H]-TdR参入和诱生干扰素作用的研究. 中国免疫学杂志, 1985;1(6) :42
, http://www.100md.com
6 李凤仙，冯杏婉，程军平,魏 文.氮芥抗药性人早幼粒白血病HL60细胞亚系的建立及其生物特性. 癌症, 1994;13(3):206～10
7 范 恿, 杜德林,李秀勃. 茯苓素对人早幼粒白血病细胞(HL60)的诱导分化作用. 军事医学科学院院刊, 1988;12(2):132
8 Yamasaki K, Sone S, Yamashita T, Ogura T.Synergistic induction of lym phokine(IL-2)-activated killer activity by IL-2 and the polysaccharides lenti nan and therapy of spontaneous pulmonary metastases. Cancer Immunol Immunother , 1989;29:87～92
9 张昌菊. 猪苓多糖抗肿瘤作用的机制研究. 宜昌医学高专学报, 1995;23(3):150～2
10 佟 丽，黄添友，梁 谋et al.刺五加多糖抗肿瘤作用与作用机制的实验研究. 中国药理学通报，1994；10(2):105～9
11 吴 波，梁 谋，佟 丽et al.茯苓多糖抗肿瘤作用与作用机制的实验研究. 中国药理学通报, 1994;10(4):300～4
1999-01-15收稿，1999-04-21修回, 百拇医药