氯喹、地塞米松对烟雾吸入伤大鼠肺细胞膜损伤的影响*
作者：杨天德 杨宗城 罗奇志 黎 鳌
单位：杨天德 第三军医大学新桥医院麻醉科；杨宗城 罗奇志 黎 鳌 烧伤研究所，重庆 400037
关键词：烟雾吸入伤；细胞膜；磷脂；流动性； ATP酶；氯喹；地塞米松
中国药理学通报990409
摘要 目的 观察氯喹、地塞米松对烟雾吸入伤大鼠肺细胞膜损伤的影响。方法 健康Wistar大鼠100只随机分成正常对照组，吸入伤1h、3h、6h 、12h和24h组，氯喹治疗6h和12h组以及地塞米松治疗6h和12h组。实验毕活杀动物，取肺组织制备细胞膜。提取膜磷脂，并用高效液相色谱仪测定磷脂组份，用荧光偏振法测定膜流动性，用生化比色法测定细胞膜Na+，K+-ATP酶、Ca2+- ATP酶和Mg2+-ATP酶活性。结果 烟雾吸入伤后，细胞膜磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)明显降低，同时伴有膜荧光偏振度(ρ)和膜平均微粘度(η)明显增加及3种ATP酶活性降低(P<0.05～P<0.01)。与吸入伤6 h组相比，氯喹治疗6 h组动物PC、PE含量明显增加，同时降低ρ和η，并增加Na+ ，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性(P<0.05～P<0.01)，而地塞米松治疗6 h 动物仅增加PE含量、降低ρ和η，但对膜上ATP酶活性无影响。结论 烟雾吸入可引起肺细胞膜受损，膜流动性及膜ATP酶活性降低，而氯喹和地塞米松可部分改善细胞膜功能。
, 百拇医药
中国图书分类号 R 563.02； R 644； R 644.053
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0316-04
Effects of chloroquine and dexamethasone on the pulmonary cellular
membrane damages of rats with smoke inhalation injury
YANG Tian-De
(Anesthesia Dept of Xinqiao Hospital of Third Military Medi cal University, Chongqing 400037)
, 百拇医药
YANG Zong-Cheng， LUO Qi-Zhi， LI Ao
Burns Research Institute of Third Military Medical University, Chongqing 400038
ABSTRACT AIM To investigate the effects of chl oroquine and dexamethasone on the pulmonary cellular membraneous damages of rats with smoke inhalation injury. METHODS 100 healthy wistar rats we re randomised into control group， five injuried groups at 1h,3h,6h,12h and 24h following smoke inhalation, and chloroquine-treated groups at 6 h,12h and dexamethasone-treated groups at 6h,12h following smoke inhalation. After experiment the rats were killed and the lungs were incised for preparing of cellular membrane,membraneous lipids were extracted and the compositions phospholipid were detected with high performance liquid chromatography. The fluidity of cellul ar membrane was measured by fluorescence polarization, and the activities of Na +,K+-ATPase and Mg2+-ATPase and Ca2+-ATPase were assayed by biochemical method. RESULTS After smoke inhalation the contents of PC,PE,PI in pul-monary cellular membrane were significatly declined and simutan eously accompanying by the increases in fluorescence polarization(ρ)and membran eous microviscosity(η) and the decreases in the activities of three kinds of AT Pases (P<0.05～<0.01),while compared with injuried group at 6h following smoke inhalation chloroquine markedly increased the contents of PC and PE decrea sed ρ and η, and enhenced the activities of Na+,K+-ATPase and Ca2+-ATPase in group at 6h following smoke inhalation, but dexamethasone only inc reased the content of PE, decreased ρ and η, and had no effect on the activit ies of ATPases. CONCLUSION Smoke inhalati on causes the disruption of pulmonary cellular membrane and the decreases in the fluidity of cellular membrane and the activities of ATPases, both chloroquine and dexamethasone partially improve the function of cellular membrane.
, http://www.100md.com
KEY WORDS smoke inhalation injury; cellular membrane; ATPase; phospholi pid; fluidity; chloroquine; dexamethasone
研究发现，磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)非特异性抑制剂——氯喹(Ch loroquine, CQ)可明显降低烟雾吸入伤大鼠肺微血管通透性、减少肺水含量，对烟雾吸入伤大鼠早期肺水肿的形成具有一定的防治作用。为此，我们进一步观察了氯喹对细胞膜磷脂组份、膜流动性和膜上ATP酶活性的影响，并与地塞米松相比较，探讨这两种药物对细胞膜损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康Wistar大鼠100 只(体重180～220 g，♀♂不拘)，随机分成正常对照组，吸入伤1h、3h、6h、12h和24h组，地塞米松治疗6 h和12 h组以及氯喹治疗6 h和1 2 h组，每组10只大鼠。
, 百拇医药
1.2 动物模型 按本所王敦等建立的方法致伤大鼠[2]。地塞米松治疗组在伤后立即腹腔注射地塞米松(Dx) 5mg.kg-1(地塞米松纯品由美国Upjohn公司提供，用前配成5 g.L-1)，分别观察6 h和12 h；氯喹治疗组在伤后立即腹腔注射氯喹(CQ) ，剂量为10mg.kg-1(氯喹为Sigma产品，用前配成10g.L-1)，分别观察6h和12h；其余各组按1ml.kg-1伤后注射9g.L-1氯化钠溶液。于各时相点活杀动物，取肺组织作指标测定。
1.3 指标测定
1.3.1 肺细胞膜制备 将取出的新鲜肺组织在冰冷的Tris-HCl缓冲液(50 mmol.L-1,含10 mmol.L-1 MgCl2 ，pH 7.4)中洗涤血污，剔出气管及其周围结缔组织，吸干表面水份，按1∶100(W∶V)的比例加入上述缓冲液，在冰浴中用内切式组织匀浆器(12000r.min-1,30 s×2次)，继之用玻璃匀浆器(5 000 r.min-1 ，15s×2次)匀浆；将匀浆于4℃，400×g10 min离心，取上清进行超速离心( 40000×g，15 min，4℃)制备膜制剂[3]，沉淀用上述缓冲液重悬，Lowry法测定蛋白[4]，分装后置液氮中备用。
, 百拇医药
1.3.2 膜磷脂提取和磷脂组分测定 取细胞膜制剂，用氯仿∶甲醇(2∶1)抽提磷脂[5]，磷脂组份按王凤君等建立的方法[6]，用高效液相色谱仪(HPLC)进行测定(HPLC系统为德国Gilson)，色谱数据工作站为中国科学院大连生物化学研究所建立；谱柱：ц Porasil Silica，10 μm，4×30mm；流动相；乙腈∶甲醇∶85%磷酸(90∶3 ∶1)。测定时用含20%氯仿的流动相溶解抽取液，取20 μl上样，室温检测，波长为203 nm 。磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰乙醇胺(PE)标准品为Sigma产品(色谱纯)，平行制作标准曲线，用上述工作站进行数据处理，以每克蛋白所含磷脂组份的毫克量表示(mg.g-1 Pr)。
1.3.3 膜流动性测定 取一定量膜制剂(50 μg)加入0.1 mol.L-1 PBS(含 0.02 mol.L-1 NaCl)1.5 ml，DPH(1.6-乙苯基-1，3，5-己三烯，Sigma产品)工作液 1.5 ml(DPH工作液由四氢呋喃按2×10-3mol.L-1溶解，PB S稀释为2×10-6mol.L-1)，37℃水浴30min，离心，弃上清，经上述PBS重悬后，用日立F-3010型荧光分光光度计测定起偏器和检偏器在不同方向上的荧光强度(测定参数：激发波长λex为362 nm，发射波长λem为432nm，狭缝为10nm)，按公式计算：荧光偏振度(ρ)=(IVV-GIVH)/(IVV+GI VH) G=IHV/IHH
, http://www.100md.com
Tab 1 The changes of phospholipid composition(
±s,n=10, mg.g-1 Pr)
PI
PS
PE
PC
Control
8.22±1.27
6.48±0.96
9.35±1.07
, http://www.100md.com 86.46±14.03
Injuried 1h
7.74±1.35
6.65±1.08
8.60±1.85
82.11±13.07
Injuried 3h
6.88±1.26*
6.32±1.42
7.04±1.17**
66.87±9.03**
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Injuried 6h
6.35±0.90**
5.62±0.64
6.75±0.64**
60.21±5.89**
Injuried 12h
6.54±1.11**
6.04±0.52
6.62±0.49**
60.00±5.35**
, 百拇医药
Injuried 24h
6.40±0.78**
5.95±0.81
6.29±0.47**
57.78±5.20**
Dx 6h
6.84±0.96*
6.25±0.83
8.27±1.16☆
69.32±8.33**
, 百拇医药
Dx 12h
6.26±0.74**
6.07±0.65
6.82±0.60**
63.54±5.90**
CQ 6h
6.57±0.99**
6.18±0.77
8.57±1.06☆☆
73.38±6.23**☆
, 百拇医药
CQ 12h
6.18±0.68**
5.87±0.51
7.73±0.76*
66.51±8.30**
*P<0.05, **P<0.01 compared with control group;☆P<0.05, ☆☆P<0.01 compared with injuried 6 h group.
其中IVV为起、检偏器均垂直时的荧光强度，IHH为二者水平时的荧光强度，IVH为起偏器垂直、检偏器水平时的荧光强度，而IHV为起偏器、检偏器垂直时的荧光强度。
, 百拇医药
根据ρ值，可计算膜平均微粘度(η)=2ρ/(0.46-ρ)。
1.3.4 ATP酶活性测定 参照药盒说明书(南京建成生物工程研究所产品)用定磷法测定Na+，K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和M g2+-ATP酶活性(活性单位为mmol Pi.g-1 Pr.h-1)。
1.4 统计处理 各组计量资料用±s表示，并行完全随机的单因素方差分析，用t检验比较各均数相差的显著性。
Tab 2 The change of pulmonary cellular
, 百拇医药 membrane fludity(±s, n=10)
ρ
η
Control
0.220±0.013
1.882±0.295
Injuried 1h
0.246±0.011**
2.308±0.225**
Injuried 3h
, http://www.100md.com
0.252±0.012**
2.441±0.253**
Injuried 6h
0.259±0.015**
2.627±0.410**
Injuried 12h
0.241±0.009**
2.198±0.176*
Injuried 24h
, 百拇医药 0.244±0.014**
2.269±0.296**
Dx 6h
0.239±0.006**☆☆
2.162±0.123☆☆
Dx 12h
0.244±0.006**
2.262±0.110**
CQ 6h
0.238±0.009**☆☆
, 百拇医药
2.130±0.129☆☆
CQ 12h
0.238±0.007**
2.152±0.131
*P<0.05, **P<0.01， compared with control group; ☆☆P<0.01， compared with injuried 6 h group.
2 结果
烟雾吸入伤后3 h，PI、PE和PC明显降低，并持续到伤后24h(P<0.05或P<0.01 )；地塞米松治疗6 h动物PE含量和氯喹治疗6h动物PE、PI含量明显高于吸入伤 6 h动物(P<0.05或P<0.01)(见表1)；烟雾吸入伤后1 h起，ρ和η明显增加，并持续到伤后 24h(P<0.01)，与吸入伤6 h相比，氯喹和地塞米松治疗6 h动物肺细胞膜ρ和η明显降低(P<0.01)(见表2)；烟雾吸入伤后1 h起，肺细胞膜3种ATP酶活性均明显降低，并持续到伤后24 h(P<0.01)；地塞米松治疗对ATP酶活性无明显影响(P>0.0 5)，但氯喹治疗6 h组动物肺细胞膜Na+,K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明显高于吸入伤6 h组动物，Na+,K+-ATP酶活性也明显高于地塞米松治疗6 h组动物(P<0. 05或P<0.01)(见表3)。
, 百拇医药
Tab 3 The changes of membraneous ATPases(n=10,±s, mmolPi.g-1 Pro.h-1)
Na+,K+-ATPase
Mg2+-ATPase
Ca2+-ATPase
Control
8.96±1.42
2.59±0.46
, 百拇医药
2.10±0.32
Injuried 1h
6.21±0.96**
1.92±0.29**
1.45±0.16**
Injuried 3h
4.97±0.67**
1.47±0.24**
1.21±0.21**
Injuried 6h
, 百拇医药
4.75±0.82**
1.28±0.23**
1.12±0.15**
Injuried 12h
4.52±0.70**
1.20±0.23**
1.05±0.16**
Injuried 24h
4.34±0.67**
, http://www.100md.com 1.26±0.29**
1.11±0.23**
Dx 6h
4.96±0.85**#
1.34±0.35**
1.23±0.27**
Dx 12h
4.52±0.88**
1.24±0.30**
1.09±0.25**
, 百拇医药
CQ 6h
5.99±1.13*△
1.47±0.34**
1.42±0.35**△
CQ 12h
4.55±0.62**
1.28±0.28**
1.11±0.19**
**P<0.01，compared with control group;△P<0.05，compared with injuried 6h group; #P<0.05， compared with CQ 6h group.
, 百拇医药
3 讨论
烟雾吸入伤后肺细胞膜磷脂组份(主要是PC、PE、PI)含量明显降低，同时伴有膜流动性及膜上ATP酶活性降低，说明烟雾吸入伤后肺细胞膜受损、破坏，改变了膜结构的质与量，进而引起膜功能的改变。造成烟雾吸入伤后肺细胞膜变化的原因比较复杂，可能与有毒物质的作用、氧自由基的攻击、PLA2激活等因素有关[9，10]。
PLA2非特异性抑制剂——氯喹可以明显增加烟雾吸入伤后6 h组肺细胞膜PC、PE含量，降低膜平均微粘度、改善膜流动性，增加肺细胞膜Na+，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，说明氯喹对烟雾吸入伤大鼠肺细胞膜具有防治作用，也说明PLA2激活在烟雾吸入伤的发生中具有一定的作用。
地塞米松具有广泛的药理效应，一方面它具有抗毒、抗炎效应，起稳定细胞膜的作用；另一方面它可以诱导多种细胞产生巨皮素(macrocortin)、脂皮素(lipocortin)和Calpa ctin等PLA2抑制物[11]；同时地塞米松还可以抑制低分子PLA2的mRNA表达和高分子PLA2(85 ku)的蛋白质表达[12，13]，减少PLA2的合成、降低PLA2的活性，从而减轻PLA2对细胞膜的破坏作用。本实验结果提示地塞米松可增加细胞膜PC 含量，改善细胞膜流动性。
, 百拇医药
综上所述，烟雾吸入伤后肺细胞膜磷脂组份含量降低，膜流动性下降。膜上ATP酶活性降低。地塞米松和氯喹均能不同程度地增加膜磷脂含量，改善膜功能。
*全军九五指令性课题，No 95L043
作者简介：杨天德，男，36岁，博士，副教授；
杨宗城，男，70岁，博士生导师，教授；
黎 鳌，男，82岁，博士生导师，教授，中国工程院院士
参考文献
1 杨天德，杨宗城，罗奇志，黎 鳌.氯喹对烟雾吸入伤大鼠肺微血管通透性的影响.中国药理学通报，1998；14(2)：115～7
2 王 敦，冯中明，刘旭盛，杨宗城.大鼠烟雾吸入伤模型制作.第三军医大学学报，1989；11：378～80
, 百拇医药
3 吕宝璋，王小兵，单京瑞.豚鼠肺组织β和M受体的检定及其在实验性过敏性哮喘时的变化.中华医学杂志，1985，65：385～8
4 Lowry OH,Rosebrugh NJ,Farr A et al. Protein measurment with folin phenol reagent. J Bio Chem,1951;193:265～75
5 Bligh EG,Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purifi cation. Can J Biochem Physiol,1959;37:911～7
6 王凤君，赵 云，谢尔凡，尤忠义.高效液相联系色谱法测定生物样品中磷脂含量.第三军医大学学报，1996；18：67～8
7 Gillies P,Robinson C, Chepple R. Effects of hypercholesterolemia on t he microsomal membrane fluidity of inifimal-medial versus medial cayers: implic ation for the pathogenesis of vasospasm. Exp Mol Pathol, 1987;47:90～7
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8 林克椿，聂表松.细胞膜流动性.生理科学进展，1985；16(1)：83～9
9 冯中明，黎 鳌，杨宗城et al.自由基在大鼠烟雾吸入伤发病机制中的作用.中华整形烧伤外科杂志，1989；5：130～3
10 谢尔凡，周来杰，汪仕良et al. 烟雾吸入伤肺内磷脂酶A2活性变化及意义. 第三军医大学学报，1996；18(6)：528～30
11 Davidson FF,Dennis EA, Powell M, Glenney JR jr. Inhibition of phospholipase A2 by “lipocortins” and calpactins. J Bio Chem, 1987;262:1698～9
12 Nakano T,Arita H. Enhanced expression of group Ⅱ phospholipase A2 gene in the tissue of endotoxin shock rats and its suppression by glucocorticoid. FEBS Lett, 1990;273:23～5
13 Goppelt Struebe M, Rehfeldt W. Glucocorticoids inhibit TNFα-induced cytoso lic phospholipase A2 activity. Biochem Biophys Acta,1992;1127:163～5
1999-04-29收稿，1999-06-30修回, 百拇医药
单位：杨天德 第三军医大学新桥医院麻醉科；杨宗城 罗奇志 黎 鳌 烧伤研究所，重庆 400037
关键词：烟雾吸入伤；细胞膜；磷脂；流动性； ATP酶；氯喹；地塞米松
中国药理学通报990409
摘要 目的 观察氯喹、地塞米松对烟雾吸入伤大鼠肺细胞膜损伤的影响。方法 健康Wistar大鼠100只随机分成正常对照组，吸入伤1h、3h、6h 、12h和24h组，氯喹治疗6h和12h组以及地塞米松治疗6h和12h组。实验毕活杀动物，取肺组织制备细胞膜。提取膜磷脂，并用高效液相色谱仪测定磷脂组份，用荧光偏振法测定膜流动性，用生化比色法测定细胞膜Na+，K+-ATP酶、Ca2+- ATP酶和Mg2+-ATP酶活性。结果 烟雾吸入伤后，细胞膜磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)明显降低，同时伴有膜荧光偏振度(ρ)和膜平均微粘度(η)明显增加及3种ATP酶活性降低(P<0.05～P<0.01)。与吸入伤6 h组相比，氯喹治疗6 h组动物PC、PE含量明显增加，同时降低ρ和η，并增加Na+ ，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性(P<0.05～P<0.01)，而地塞米松治疗6 h 动物仅增加PE含量、降低ρ和η，但对膜上ATP酶活性无影响。结论 烟雾吸入可引起肺细胞膜受损，膜流动性及膜ATP酶活性降低，而氯喹和地塞米松可部分改善细胞膜功能。
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中国图书分类号 R 563.02； R 644； R 644.053
文献标识码 A 文章编号 1001-1978(1999)04-0316-04
Effects of chloroquine and dexamethasone on the pulmonary cellular
membrane damages of rats with smoke inhalation injury
YANG Tian-De
(Anesthesia Dept of Xinqiao Hospital of Third Military Medi cal University, Chongqing 400037)
, 百拇医药
YANG Zong-Cheng， LUO Qi-Zhi， LI Ao
Burns Research Institute of Third Military Medical University, Chongqing 400038
ABSTRACT AIM To investigate the effects of chl oroquine and dexamethasone on the pulmonary cellular membraneous damages of rats with smoke inhalation injury. METHODS 100 healthy wistar rats we re randomised into control group， five injuried groups at 1h,3h,6h,12h and 24h following smoke inhalation, and chloroquine-treated groups at 6 h,12h and dexamethasone-treated groups at 6h,12h following smoke inhalation. After experiment the rats were killed and the lungs were incised for preparing of cellular membrane,membraneous lipids were extracted and the compositions phospholipid were detected with high performance liquid chromatography. The fluidity of cellul ar membrane was measured by fluorescence polarization, and the activities of Na +,K+-ATPase and Mg2+-ATPase and Ca2+-ATPase were assayed by biochemical method. RESULTS After smoke inhalation the contents of PC,PE,PI in pul-monary cellular membrane were significatly declined and simutan eously accompanying by the increases in fluorescence polarization(ρ)and membran eous microviscosity(η) and the decreases in the activities of three kinds of AT Pases (P<0.05～<0.01),while compared with injuried group at 6h following smoke inhalation chloroquine markedly increased the contents of PC and PE decrea sed ρ and η, and enhenced the activities of Na+,K+-ATPase and Ca2+-ATPase in group at 6h following smoke inhalation, but dexamethasone only inc reased the content of PE, decreased ρ and η, and had no effect on the activit ies of ATPases. CONCLUSION Smoke inhalati on causes the disruption of pulmonary cellular membrane and the decreases in the fluidity of cellular membrane and the activities of ATPases, both chloroquine and dexamethasone partially improve the function of cellular membrane.
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KEY WORDS smoke inhalation injury; cellular membrane; ATPase; phospholi pid; fluidity; chloroquine; dexamethasone
研究发现，磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)非特异性抑制剂——氯喹(Ch loroquine, CQ)可明显降低烟雾吸入伤大鼠肺微血管通透性、减少肺水含量，对烟雾吸入伤大鼠早期肺水肿的形成具有一定的防治作用。为此，我们进一步观察了氯喹对细胞膜磷脂组份、膜流动性和膜上ATP酶活性的影响，并与地塞米松相比较，探讨这两种药物对细胞膜损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康Wistar大鼠100 只(体重180～220 g，♀♂不拘)，随机分成正常对照组，吸入伤1h、3h、6h、12h和24h组，地塞米松治疗6 h和12 h组以及氯喹治疗6 h和1 2 h组，每组10只大鼠。
, 百拇医药
1.2 动物模型 按本所王敦等建立的方法致伤大鼠[2]。地塞米松治疗组在伤后立即腹腔注射地塞米松(Dx) 5mg.kg-1(地塞米松纯品由美国Upjohn公司提供，用前配成5 g.L-1)，分别观察6 h和12 h；氯喹治疗组在伤后立即腹腔注射氯喹(CQ) ，剂量为10mg.kg-1(氯喹为Sigma产品，用前配成10g.L-1)，分别观察6h和12h；其余各组按1ml.kg-1伤后注射9g.L-1氯化钠溶液。于各时相点活杀动物，取肺组织作指标测定。
1.3 指标测定
1.3.1 肺细胞膜制备 将取出的新鲜肺组织在冰冷的Tris-HCl缓冲液(50 mmol.L-1,含10 mmol.L-1 MgCl2 ，pH 7.4)中洗涤血污，剔出气管及其周围结缔组织，吸干表面水份，按1∶100(W∶V)的比例加入上述缓冲液，在冰浴中用内切式组织匀浆器(12000r.min-1,30 s×2次)，继之用玻璃匀浆器(5 000 r.min-1 ，15s×2次)匀浆；将匀浆于4℃，400×g10 min离心，取上清进行超速离心( 40000×g，15 min，4℃)制备膜制剂[3]，沉淀用上述缓冲液重悬，Lowry法测定蛋白[4]，分装后置液氮中备用。
, 百拇医药
1.3.2 膜磷脂提取和磷脂组分测定 取细胞膜制剂，用氯仿∶甲醇(2∶1)抽提磷脂[5]，磷脂组份按王凤君等建立的方法[6]，用高效液相色谱仪(HPLC)进行测定(HPLC系统为德国Gilson)，色谱数据工作站为中国科学院大连生物化学研究所建立；谱柱：ц Porasil Silica，10 μm，4×30mm；流动相；乙腈∶甲醇∶85%磷酸(90∶3 ∶1)。测定时用含20%氯仿的流动相溶解抽取液，取20 μl上样，室温检测，波长为203 nm 。磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰乙醇胺(PE)标准品为Sigma产品(色谱纯)，平行制作标准曲线，用上述工作站进行数据处理，以每克蛋白所含磷脂组份的毫克量表示(mg.g-1 Pr)。
1.3.3 膜流动性测定 取一定量膜制剂(50 μg)加入0.1 mol.L-1 PBS(含 0.02 mol.L-1 NaCl)1.5 ml，DPH(1.6-乙苯基-1，3，5-己三烯，Sigma产品)工作液 1.5 ml(DPH工作液由四氢呋喃按2×10-3mol.L-1溶解，PB S稀释为2×10-6mol.L-1)，37℃水浴30min，离心，弃上清，经上述PBS重悬后，用日立F-3010型荧光分光光度计测定起偏器和检偏器在不同方向上的荧光强度(测定参数：激发波长λex为362 nm，发射波长λem为432nm，狭缝为10nm)，按公式计算：荧光偏振度(ρ)=(IVV-GIVH)/(IVV+GI VH) G=IHV/IHH
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Tab 1 The changes of phospholipid composition(
±s,n=10, mg.g-1 Pr)PI
PS
PE
PC
Control
8.22±1.27
6.48±0.96
9.35±1.07
, http://www.100md.com 86.46±14.03
Injuried 1h
7.74±1.35
6.65±1.08
8.60±1.85
82.11±13.07
Injuried 3h
6.88±1.26*
6.32±1.42
7.04±1.17**
66.87±9.03**
, http://www.100md.com
Injuried 6h
6.35±0.90**
5.62±0.64
6.75±0.64**
60.21±5.89**
Injuried 12h
6.54±1.11**
6.04±0.52
6.62±0.49**
60.00±5.35**
, 百拇医药
Injuried 24h
6.40±0.78**
5.95±0.81
6.29±0.47**
57.78±5.20**
Dx 6h
6.84±0.96*
6.25±0.83
8.27±1.16☆
69.32±8.33**
, 百拇医药
Dx 12h
6.26±0.74**
6.07±0.65
6.82±0.60**
63.54±5.90**
CQ 6h
6.57±0.99**
6.18±0.77
8.57±1.06☆☆
73.38±6.23**☆
, 百拇医药
CQ 12h
6.18±0.68**
5.87±0.51
7.73±0.76*
66.51±8.30**
*P<0.05, **P<0.01 compared with control group;☆P<0.05, ☆☆P<0.01 compared with injuried 6 h group.
其中IVV为起、检偏器均垂直时的荧光强度，IHH为二者水平时的荧光强度，IVH为起偏器垂直、检偏器水平时的荧光强度，而IHV为起偏器、检偏器垂直时的荧光强度。
, 百拇医药
根据ρ值，可计算膜平均微粘度(η)=2ρ/(0.46-ρ)。
1.3.4 ATP酶活性测定 参照药盒说明书(南京建成生物工程研究所产品)用定磷法测定Na+，K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和M g2+-ATP酶活性(活性单位为mmol Pi.g-1 Pr.h-1)。
1.4 统计处理 各组计量资料用
±s表示，并行完全随机的单因素方差分析，用t检验比较各均数相差的显著性。Tab 2 The change of pulmonary cellular
, 百拇医药 membrane fludity(
±s, n=10)ρ
η
Control
0.220±0.013
1.882±0.295
Injuried 1h
0.246±0.011**
2.308±0.225**
Injuried 3h
, http://www.100md.com
0.252±0.012**
2.441±0.253**
Injuried 6h
0.259±0.015**
2.627±0.410**
Injuried 12h
0.241±0.009**
2.198±0.176*
Injuried 24h
, 百拇医药 0.244±0.014**
2.269±0.296**
Dx 6h
0.239±0.006**☆☆
2.162±0.123☆☆
Dx 12h
0.244±0.006**
2.262±0.110**
CQ 6h
0.238±0.009**☆☆
, 百拇医药
2.130±0.129☆☆
CQ 12h
0.238±0.007**
2.152±0.131
*P<0.05, **P<0.01， compared with control group; ☆☆P<0.01， compared with injuried 6 h group.
2 结果
烟雾吸入伤后3 h，PI、PE和PC明显降低，并持续到伤后24h(P<0.05或P<0.01 )；地塞米松治疗6 h动物PE含量和氯喹治疗6h动物PE、PI含量明显高于吸入伤 6 h动物(P<0.05或P<0.01)(见表1)；烟雾吸入伤后1 h起，ρ和η明显增加，并持续到伤后 24h(P<0.01)，与吸入伤6 h相比，氯喹和地塞米松治疗6 h动物肺细胞膜ρ和η明显降低(P<0.01)(见表2)；烟雾吸入伤后1 h起，肺细胞膜3种ATP酶活性均明显降低，并持续到伤后24 h(P<0.01)；地塞米松治疗对ATP酶活性无明显影响(P>0.0 5)，但氯喹治疗6 h组动物肺细胞膜Na+,K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明显高于吸入伤6 h组动物，Na+,K+-ATP酶活性也明显高于地塞米松治疗6 h组动物(P<0. 05或P<0.01)(见表3)。
, 百拇医药
Tab 3 The changes of membraneous ATPases(n=10,
±s, mmolPi.g-1 Pro.h-1)Na+,K+-ATPase
Mg2+-ATPase
Ca2+-ATPase
Control
8.96±1.42
2.59±0.46
, 百拇医药
2.10±0.32
Injuried 1h
6.21±0.96**
1.92±0.29**
1.45±0.16**
Injuried 3h
4.97±0.67**
1.47±0.24**
1.21±0.21**
Injuried 6h
, 百拇医药
4.75±0.82**
1.28±0.23**
1.12±0.15**
Injuried 12h
4.52±0.70**
1.20±0.23**
1.05±0.16**
Injuried 24h
4.34±0.67**
, http://www.100md.com 1.26±0.29**
1.11±0.23**
Dx 6h
4.96±0.85**#
1.34±0.35**
1.23±0.27**
Dx 12h
4.52±0.88**
1.24±0.30**
1.09±0.25**
, 百拇医药
CQ 6h
5.99±1.13*△
1.47±0.34**
1.42±0.35**△
CQ 12h
4.55±0.62**
1.28±0.28**
1.11±0.19**
**P<0.01，compared with control group;△P<0.05，compared with injuried 6h group; #P<0.05， compared with CQ 6h group.
, 百拇医药
3 讨论
烟雾吸入伤后肺细胞膜磷脂组份(主要是PC、PE、PI)含量明显降低，同时伴有膜流动性及膜上ATP酶活性降低，说明烟雾吸入伤后肺细胞膜受损、破坏，改变了膜结构的质与量，进而引起膜功能的改变。造成烟雾吸入伤后肺细胞膜变化的原因比较复杂，可能与有毒物质的作用、氧自由基的攻击、PLA2激活等因素有关[9，10]。
PLA2非特异性抑制剂——氯喹可以明显增加烟雾吸入伤后6 h组肺细胞膜PC、PE含量，降低膜平均微粘度、改善膜流动性，增加肺细胞膜Na+，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，说明氯喹对烟雾吸入伤大鼠肺细胞膜具有防治作用，也说明PLA2激活在烟雾吸入伤的发生中具有一定的作用。
地塞米松具有广泛的药理效应，一方面它具有抗毒、抗炎效应，起稳定细胞膜的作用；另一方面它可以诱导多种细胞产生巨皮素(macrocortin)、脂皮素(lipocortin)和Calpa ctin等PLA2抑制物[11]；同时地塞米松还可以抑制低分子PLA2的mRNA表达和高分子PLA2(85 ku)的蛋白质表达[12，13]，减少PLA2的合成、降低PLA2的活性，从而减轻PLA2对细胞膜的破坏作用。本实验结果提示地塞米松可增加细胞膜PC 含量，改善细胞膜流动性。
, 百拇医药
综上所述，烟雾吸入伤后肺细胞膜磷脂组份含量降低，膜流动性下降。膜上ATP酶活性降低。地塞米松和氯喹均能不同程度地增加膜磷脂含量，改善膜功能。
*全军九五指令性课题，No 95L043
作者简介：杨天德，男，36岁，博士，副教授；
杨宗城，男，70岁，博士生导师，教授；
黎 鳌，男，82岁，博士生导师，教授，中国工程院院士
参考文献
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10 谢尔凡，周来杰，汪仕良et al. 烟雾吸入伤肺内磷脂酶A2活性变化及意义. 第三军医大学学报，1996；18(6)：528～30
11 Davidson FF,Dennis EA, Powell M, Glenney JR jr. Inhibition of phospholipase A2 by “lipocortins” and calpactins. J Bio Chem, 1987;262:1698～9
12 Nakano T,Arita H. Enhanced expression of group Ⅱ phospholipase A2 gene in the tissue of endotoxin shock rats and its suppression by glucocorticoid. FEBS Lett, 1990;273:23～5
13 Goppelt Struebe M, Rehfeldt W. Glucocorticoids inhibit TNFα-induced cytoso lic phospholipase A2 activity. Biochem Biophys Acta,1992;1127:163～5
1999-04-29收稿，1999-06-30修回, 百拇医药