鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成的调控研究X.purR琥珀突变体(am)的分离和氨基酸取代的初步研究
作者：张河生 王敖全
单位：中国科学院微生物所，北京 100080
关键词：鼠伤寒沙门氏菌；嘌呤生物合成；amber突变体
遗传学报000213
摘要：以超阻遏突变体3-18为出发株，采用以乳糖为唯一碳源的NCE平板的方法分离到439株调节突变体。通过转导引入tRNA抑制基因从中检测到11株purR(am)候选株。共转导分析证明，这些突变株的琥珀突变均发生在purR上。用supD、supE和supF分别对上述各amber突变体作了氨基酸取代实验，初步结果表明：同一氨基酸对purR不同位点(am)的氨基酸取代，对PurR调节功能有不同程度的影响；不同氨基酸(3种)对purR同一位点(am)的氨基酸取代，对其调节功能的影响也存在差异。
中图分类号：Q933 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：0379-172(2000)02-170-175
Studies of Gene Regulation of de novo Biosynthetic Pathway of Purine in Salmonella typhimurium
X.Isolation of purR(am) Mutants and Preliminary Studies of Amino Acid Substitution
ZHANG He-Sheng, WANG Ao-Quan
(Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080, China)
, 百拇医药
Abstract: Starting from a super-repressed mutant of purR, 3?8, 439 independent candidates of purR- mutants were isolated by using NCE selecting plate with lactose as sole carbon source. Among these mutants. 11 amber mutants were detected by introducing a tRNA suppressor gene. Cotransduction analysis proved that the amber mutation sites of 11 amber mutants all located on purR. Amino acid substitution experiments were performed with three tRNA suppressors, supD, supE and supF, for each purR(am). The results showed that the same amino acid substitution occurred in different site of PurR protein could result in varied effects on purR function; different amino acid substitution occurred at the same position of PurR protein also could produced varied effects on purR function.
, http://www.100md.com
Key words:Salmonella typhimurium; biosynthesis of purine; amber mutants
嘌呤核苷酸生物合成途径在细胞生命活动中起极为重要的作用，阐明这条途径基因表达调控规律有重大理论意义，同时也可为生产核苷、核苷酸类物质的遗传育种提供理论指导。80年代发现嘌呤从头合成途径分散在染色体上的所有结构基因的表达受同一反式调节基因purR的负调控[1，2]。对这些结构基因的核苷酸序列分析表明，它们的5′端调控区均存在16bp保守序列(后称PUR box)。核酸和蛋白质结合实验(Gel Retardation)证明从头合成途径基因的协同调控机制正是通过PurR阻遏蛋白和PUR box的相互作用实现的[3～6]。近年来发现purR不仅在嘌呤生物合成途径调控中起关键作用，而且还参与与核苷酸代谢有关的一些基因的表达调控，如嘧啶从头合成途径中的pyrC和pyrD参与Cysosine转运和吸收的codBA，编码PRPP合成酶的prs参与甘氨酸合成代谢和一碳单位合成的基因glyA和gcv操纵子等[7，8]。对在细胞生命活动中起全局调控作用的purR作深入研究，有重要的意义。本文首次报道利用超阻遏突变体(purRs)分离purR(am)突变体以及利用tRNA抑制基因对PurR阻遏蛋白进行氨基酸取代(Amino Acid Substitution)实验的初步结果。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细菌菌株或噬菌体 本文使用的细菌菌株或噬菌体列于表1。
表1 细菌菌株和噬菌体
Table 1Bacterial strains and phages 菌株和噬菌体
Stains and phages
性状和遗传型
Properties and genotypes
来源
Source
Salmonella typhimurium
, 百拇医药
LT2
Wildtype
J Roth
TT12306
purD::MudJ(lacZ,Kanr)
J Roth
3-18
purRs,purD::MudJ(lacZ,Kanr)
[11]
TGM463
purR::Tn10(tet)tet 90% linked to purR+
, 百拇医药
J Roth
TT2070
supD,zeb618::Tn10(tet) tet 50% linked to supD
J Roth
TT2342
supE,zbf99::Tn10(tet) tet50% linked to supE
J Roth
TT2337
supF,zbf99::Tn10(tet) tet50% linked to supF
J Roth
, 百拇医药
320
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
225
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
169
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
, 百拇医药
299
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
184
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
328
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
, 百拇医药
327
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
411
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
415
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
, 百拇医药
1851
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
1811
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
3201
320 supD
This study
2251
, 百拇医药
225 supD
This study
1691
169 supD
This study
2991
229 supD
This study
1841
184 supD
This study
3281
, 百拇医药
328 supD
This study
3271
327 supD
This study
4111
411 supD
This study
4151
415 supD
This study
18511
, 百拇医药
1851 supD
This study
18111
1811 supD
This study
3202
320 supD
This study
2252
225 supD
This study
1692
, http://www.100md.com
169 supD
This study
2992
229 supD
This study
1842
184 supD
This study
3282
328 supD
This study
3272
, http://www.100md.com
327 supD
This study
4112
411 supD
This study
4152
415 supD
This study
18512
1851 supE
This study
18112
, 百拇医药
1811 supE
This study
3203
320 supF
This study
2253
225 supF
This study
1843
184 supF
This study
1693
, 百拇医药
169 supF
This study
2993
299 supF
This study
3283
328 supF
This study
3273
327 supF
This study
4113
, 百拇医药
411supF
This study
4153
415 supF
This study
18513
1851 supF
This study
18113
1811 supF
This study
Phages
, 百拇医药
P2-2
HT105/1 int-201
J Roth
H5
P22c2
J Roth
1.2 培养基 Vogel和Bonner的E培养基(含0.2%葡萄糖)用作基本培养基，不含柠檬酸的E为NCE培养基[9]。丰富培养基为LB，EMB指示培养基成分见文献[10]，其他成分见正文。丰富培养基中卡那霉素和四环素使用浓度分别为50μg/ml和20μg/ml，基本培养基中减半。阻遏条件下腺嘌呤核苷(Ado)浓度为120μg/ml，消阻遏条件下为10μg/ml。试剂来源：卡那霉素为Sigma产品，四环素为华北制药厂产品。
, 百拇医药
1.3p22转导杂交 按文献[10]进行。
1.4β-半乳糖苷酶活性 按J.H.Miller方法操作[9]。
2 结果与讨论
2.1 purR调节突变体的分离 菌株3-18是调节基因purR的超阻遏突变体(purRs)。该菌株在以乳糖为唯一碳源，补加限量腺苷(10μg/ml)和VB1(1.7μg/ml)的NCE平板上不能生长。实验证明这是由于与lacZ融合的purD基因的表达受Ado阻遏的结果[11]。因此一旦在NCE平板上长出菌落，便有可能为逃脱了Ado阻遏的purR调节突变体。根据这一构思我们建立了从超阻遏突变体分离purR调节突变体的方法。实验分别挑取3-18单菌落接种加卡那霉素的LB液体培养基，培养过夜。次日用生理盐水洗涤细胞2次，经适当稀释后分别涂布含乳糖、限量腺苷(Ado 10μg/ml)和VB1(1.7μg/ml)的NCE平板，置37℃培养36h。挑长出的菌落于含过量Ado(120μg/ml)和VB1(1.7μg/μml)的EMB(下称阻遏的EMB平板)加卡那霉素平板上作单菌落分离。每一培养物只取一个纯化的红色菌落作为purR-候选株。采用以上方法获得了439株这样的突变体。
, 百拇医药
2.2 purR琥珀(amber)突变体的检测 分别以上述调节突变体为受体，以在supD近旁插入一拷贝mini-Tnn10d-et(tet与supD 50%连锁)的TT2070菌株的P22裂解物为供体作转导，在加四环素的EMB阻遏平板上选择Tetr转导子。如果受体为purR(am)，则在引入tRNA抑制基因(supD)后，因UAG位点插入丝氨酸(Ser)而可能使PurR阻遏蛋白部分或全部恢复调节功能，在选择平板上形成粉红色或白色菌落，且粉红色或白色菌落出现的频率应该符合tet和supD的连锁频率。实验结果(表2)表明在439株调节突变体中有11株可能为purR(am)突变体。
表2 purR琥珀(amber )突变体的检测
Table 2 Detection of PurRamber mutants 转导杂交组合
Tetr转导子总数1)
, 百拇医药
白(粉)色Tetr转导子数1)
Tet 与supD共转导频导频率
Co-transduction frequency(%)
φp222070×328
309
174
56.3
φp222070×320
319
161
, http://www.100md.com 50.5
φp222070×299
203
106
52.2
φp222070×327
253
137
54.2
φp222070×415
201
124
, http://www.100md.com
61.7
φp222070×225
292
168
57.5
φp222070×411
218
124
56.9
φp222070×169
316
150
, http://www.100md.com
47.5
φp222070×184
214
94
44
φp222070×1811
306
86
42
φp222070×1851
430
160
, 百拇医药
37
为证明上述获得的11株突变体的amber突变发生在purR上，排除purR-表型产生于 lacZ突变或purDOc突变的可能性，以purR+近旁插入一拷贝mini-Tn10d-tet(tet与purR+90%连锁)的TGM463菌株的P22裂解物为供体，11株候选株分别为受体作转导杂交，在阻遏的EMB加四环素平板上选择Tetr转导子，因鼠伤寒沙门氏菌purR定位于31.5min， purD定位于40min，如果amber突变发生于purR上，则Tetr转导子应出现一定比例的白色或粉红色菌落，否则将出现100%的红色菌落。实验结果表明，11株候选株的Tetr转导子均出现白色或粉红色菌落，tet和amber突变的共转导频率在20%～80%之间。说明amber突变发生在purR上，tet与amber共转导频率的差异反映这11株突变体的amber突变可能发生在purR不同区域或位点上。这11株purR(am)的遗传型为purRs，purD：：MudJ(lacZ，Kanr)purR(am)。表3为它们在阻遏和消阻遏条件下的β-半乳糖苷酶活性。由表3可见，11株purR(am)突变体均呈组成型表达。 表3 purR(am)突变体的组成型表达
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Table 3 Constitutive expression of purR amber mutants 菌株 Strains
遗传型 Genotype
β-半乳糖苷酶活性1)
Ado 10μg/ml
β-galactosidsase activity Ado 120μg/ml
阻遏倍数2)
Repression fold
3-18
PurRs,purD::MudJ
, 百拇医药
3.99
28.73
7.19
320
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
67.86
64.52
0.95
225
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
58.38
, 百拇医药
55.54
1.15
169
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
62.12
72.27
0.93
299
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
63.38
59.24
, http://www.100md.com
0.94
328
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
94.06
88.51
0.93
184
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
73.63
68.61
0.86
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411
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
68.86
59.25
0.98
415
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
90.60
89.23
1.00
1811
, 百拇医药
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
69.5
65.3
1.00
1851
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
31.9
36.8
1.10
327
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
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50.83
62.96
1)β-半乳糖苷酶活性(=nmol/min/OD650ml),每一活性值为3次平行处理的算术平均值;2)消阻遏条件(10μg/ml Ado)下的β-半乳糖苷酶活性值除经阻遏条件(120μg/ Ado)下的活性值
1)β-galactosidase activity=nmol/min /OD650ml,Every value of β-galactosidase activity is a arithmetic mean of 3 parallel treatments;2)Repression fold is the ratio of β-galactosidase activity under the derepression condition to the activity in the condition of repression
, 百拇医药
2.3purR(am)突变体的氨基酸取代及其对功能影响实验采用了3种tRNA抑制基因，supD插入丝氨酸(Ser)、supE插入谷氨酸(Glu)、supF插入(Tyr)。为将上述tRNA抑制基因引入purR(am)突变菌株，本实验利用supD、supE和supF近旁插入有一拷贝mini-Tn10d-tet(tet与tRNA抑制基因的连锁频率分别为50%、50%、50%)的菌株TT2070、TT2342、TT2337的P22裂解物作为供体分别对11株purR(am)作转导，在阻遏的EMB加四环素的平板上选择Tetr转导子。
当以supD为供体时，所有菌株的Tetr转导子中均出现约50%的白色或粉红色菌落(与前述结果一致)。当以supE为供体时只有1851、320、1811、411各菌株的Tetr转导子中出现约50%的白色菌落，184、415出现粉红色菌落，其余均为红色菌落。当以supF为供体作转导时出现白色或粉红色转导菌落的突变体有320、411、1811各株，出现粉红色转导菌落的突变体有1851、328和184各菌株。其余均为红色菌落。为确定上述红色转导子菌落中确有引入的supE或supF，对每个突变体分别挑取10个独立的转导子菌落制备P22裂解 物作供体，与已知有supE或supF校正功能的purR(am)菌株320、1851作转导杂交。转导子菌落若出现约50%的白色菌落表明供体中有sup基因。采用这种方法对于每个待检 purR(am)突变体均获得了含有supE或supF的红色转导子。
, 百拇医药
对上述所获得的白色或粉红色转导子，和经证明含有supE或supF基因的红色转导子，进行了阻遏和消阻遏条件下的β-半乳糖苷酶活性测定(图1)
图1 purR(am)突变体的氨基酸取代及其对功能的影响AR.阻遏条件(120μg/ml Ado)下的β-半乳糖苷酶活性值;AD 消阻遏条件(10μg/ml Ado)下的β-半乳糖苷酶活性值;每一活性值为3次平行处理的算术平均值.A、B、C。分别为supD、supE、supF校正11种purR(am)UAG位点的结果
Fig.1 Amino acids substitution of purR(am)mutants and their effects on PurR function AR.β-galactosidase activity in the condition of repression(120μg/ml Ado);AD .β-galactosidase activity under derepression conditio (10μg/ml Ado) ;Every value is a arithmetic mean of 3 parallel treatments;A,B,Cpresented the correction results of 11 purR am (UAG )sites by supD、supE、supF respectively
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由图1中可以看出：(1)所有11株purR(am)突变体的UAG位点被Ser取代，均能使PurR调节功能得到部分或全部恢复。(2)部分突变体的UAG位点被Glu或Tyr取代也可使PurR调节功能得以恢复。如突变体320、1811、411等。(3) 当同一purR(am)突变体的UAG位点被不同的氨基酸取代时，对PurR调节功能的影响差别较大。如1851的UAG位点分别被Ser、Glu、Tyr 3种氨基酸取代时，PurR调节功能恢复程度依次降低。表现为阻遏条件下β-半乳糖苷酶活性值依次增大(7.24<28.31<39.9)。而某些突变体，如327、299、169、225等，引入Glu和Tyr均不能恢复PurR调节功能。
参考文献
[1]Meng L M, Kistrup M, Nygaard P. Regulation of purR repressor synthesis and involvement of purR in the regulation of purB, purL, purMN, and guaBA expression in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 1990, 187:373～379.
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[4]刘 奔， 戴秀玉， 王敖全. 鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成的调控研究Ⅳ：purG Oc突变位点及其功能分析.中国科学(C辑)，1997， 40(3)：238～245.
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单位：中国科学院微生物所，北京 100080
关键词：鼠伤寒沙门氏菌；嘌呤生物合成；amber突变体
遗传学报000213
摘要：以超阻遏突变体3-18为出发株，采用以乳糖为唯一碳源的NCE平板的方法分离到439株调节突变体。通过转导引入tRNA抑制基因从中检测到11株purR(am)候选株。共转导分析证明，这些突变株的琥珀突变均发生在purR上。用supD、supE和supF分别对上述各amber突变体作了氨基酸取代实验，初步结果表明：同一氨基酸对purR不同位点(am)的氨基酸取代，对PurR调节功能有不同程度的影响；不同氨基酸(3种)对purR同一位点(am)的氨基酸取代，对其调节功能的影响也存在差异。
中图分类号：Q933 文献标识码：A
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文章编号：0379-172(2000)02-170-175
Studies of Gene Regulation of de novo Biosynthetic Pathway of Purine in Salmonella typhimurium
X.Isolation of purR(am) Mutants and Preliminary Studies of Amino Acid Substitution
ZHANG He-Sheng, WANG Ao-Quan
(Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080, China)
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Abstract: Starting from a super-repressed mutant of purR, 3?8, 439 independent candidates of purR- mutants were isolated by using NCE selecting plate with lactose as sole carbon source. Among these mutants. 11 amber mutants were detected by introducing a tRNA suppressor gene. Cotransduction analysis proved that the amber mutation sites of 11 amber mutants all located on purR. Amino acid substitution experiments were performed with three tRNA suppressors, supD, supE and supF, for each purR(am). The results showed that the same amino acid substitution occurred in different site of PurR protein could result in varied effects on purR function; different amino acid substitution occurred at the same position of PurR protein also could produced varied effects on purR function.
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Key words:Salmonella typhimurium; biosynthesis of purine; amber mutants
嘌呤核苷酸生物合成途径在细胞生命活动中起极为重要的作用，阐明这条途径基因表达调控规律有重大理论意义，同时也可为生产核苷、核苷酸类物质的遗传育种提供理论指导。80年代发现嘌呤从头合成途径分散在染色体上的所有结构基因的表达受同一反式调节基因purR的负调控[1，2]。对这些结构基因的核苷酸序列分析表明，它们的5′端调控区均存在16bp保守序列(后称PUR box)。核酸和蛋白质结合实验(Gel Retardation)证明从头合成途径基因的协同调控机制正是通过PurR阻遏蛋白和PUR box的相互作用实现的[3～6]。近年来发现purR不仅在嘌呤生物合成途径调控中起关键作用，而且还参与与核苷酸代谢有关的一些基因的表达调控，如嘧啶从头合成途径中的pyrC和pyrD参与Cysosine转运和吸收的codBA，编码PRPP合成酶的prs参与甘氨酸合成代谢和一碳单位合成的基因glyA和gcv操纵子等[7，8]。对在细胞生命活动中起全局调控作用的purR作深入研究，有重要的意义。本文首次报道利用超阻遏突变体(purRs)分离purR(am)突变体以及利用tRNA抑制基因对PurR阻遏蛋白进行氨基酸取代(Amino Acid Substitution)实验的初步结果。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细菌菌株或噬菌体 本文使用的细菌菌株或噬菌体列于表1。
表1 细菌菌株和噬菌体
Table 1Bacterial strains and phages 菌株和噬菌体
Stains and phages
性状和遗传型
Properties and genotypes
来源
Source
Salmonella typhimurium
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LT2
Wildtype
J Roth
TT12306
purD::MudJ(lacZ,Kanr)
J Roth
3-18
purRs,purD::MudJ(lacZ,Kanr)
[11]
TGM463
purR::Tn10(tet)tet 90% linked to purR+
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J Roth
TT2070
supD,zeb618::Tn10(tet) tet 50% linked to supD
J Roth
TT2342
supE,zbf99::Tn10(tet) tet50% linked to supE
J Roth
TT2337
supF,zbf99::Tn10(tet) tet50% linked to supF
J Roth
, 百拇医药
320
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
225
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
169
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
, 百拇医药
299
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
184
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
328
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
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, 百拇医药
327
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
411
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
415
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
, 百拇医药
1851
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
1811
purRs,pruR(am) purD::MudJ(lacZ,Kanr)
This study
3201
320 supD
This study
2251
, 百拇医药
225 supD
This study
1691
169 supD
This study
2991
229 supD
This study
1841
184 supD
This study
3281
, 百拇医药
328 supD
This study
3271
327 supD
This study
4111
411 supD
This study
4151
415 supD
This study
18511
, 百拇医药
1851 supD
This study
18111
1811 supD
This study
3202
320 supD
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2252
225 supD
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1692
, http://www.100md.com
169 supD
This study
2992
229 supD
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1842
184 supD
This study
3282
328 supD
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3272
, http://www.100md.com
327 supD
This study
4112
411 supD
This study
4152
415 supD
This study
18512
1851 supE
This study
18112
, 百拇医药
1811 supE
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3203
320 supF
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2253
225 supF
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1843
184 supF
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1693
, 百拇医药
169 supF
This study
2993
299 supF
This study
3283
328 supF
This study
3273
327 supF
This study
4113
, 百拇医药
411supF
This study
4153
415 supF
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18513
1851 supF
This study
18113
1811 supF
This study
Phages
, 百拇医药
P2-2
HT105/1 int-201
J Roth
H5
P22c2
J Roth
1.2 培养基 Vogel和Bonner的E培养基(含0.2%葡萄糖)用作基本培养基，不含柠檬酸的E为NCE培养基[9]。丰富培养基为LB，EMB指示培养基成分见文献[10]，其他成分见正文。丰富培养基中卡那霉素和四环素使用浓度分别为50μg/ml和20μg/ml，基本培养基中减半。阻遏条件下腺嘌呤核苷(Ado)浓度为120μg/ml，消阻遏条件下为10μg/ml。试剂来源：卡那霉素为Sigma产品，四环素为华北制药厂产品。
, 百拇医药
1.3p22转导杂交 按文献[10]进行。
1.4β-半乳糖苷酶活性 按J.H.Miller方法操作[9]。
2 结果与讨论
2.1 purR调节突变体的分离 菌株3-18是调节基因purR的超阻遏突变体(purRs)。该菌株在以乳糖为唯一碳源，补加限量腺苷(10μg/ml)和VB1(1.7μg/ml)的NCE平板上不能生长。实验证明这是由于与lacZ融合的purD基因的表达受Ado阻遏的结果[11]。因此一旦在NCE平板上长出菌落，便有可能为逃脱了Ado阻遏的purR调节突变体。根据这一构思我们建立了从超阻遏突变体分离purR调节突变体的方法。实验分别挑取3-18单菌落接种加卡那霉素的LB液体培养基，培养过夜。次日用生理盐水洗涤细胞2次，经适当稀释后分别涂布含乳糖、限量腺苷(Ado 10μg/ml)和VB1(1.7μg/ml)的NCE平板，置37℃培养36h。挑长出的菌落于含过量Ado(120μg/ml)和VB1(1.7μg/μml)的EMB(下称阻遏的EMB平板)加卡那霉素平板上作单菌落分离。每一培养物只取一个纯化的红色菌落作为purR-候选株。采用以上方法获得了439株这样的突变体。
, 百拇医药
2.2 purR琥珀(amber)突变体的检测 分别以上述调节突变体为受体，以在supD近旁插入一拷贝mini-Tnn10d-et(tet与supD 50%连锁)的TT2070菌株的P22裂解物为供体作转导，在加四环素的EMB阻遏平板上选择Tetr转导子。如果受体为purR(am)，则在引入tRNA抑制基因(supD)后，因UAG位点插入丝氨酸(Ser)而可能使PurR阻遏蛋白部分或全部恢复调节功能，在选择平板上形成粉红色或白色菌落，且粉红色或白色菌落出现的频率应该符合tet和supD的连锁频率。实验结果(表2)表明在439株调节突变体中有11株可能为purR(am)突变体。
表2 purR琥珀(amber )突变体的检测
Table 2 Detection of PurRamber mutants 转导杂交组合
Tetr转导子总数1)
, 百拇医药
白(粉)色Tetr转导子数1)
Tet 与supD共转导频导频率
Co-transduction frequency(%)
φp222070×328
309
174
56.3
φp222070×320
319
161
, http://www.100md.com 50.5
φp222070×299
203
106
52.2
φp222070×327
253
137
54.2
φp222070×415
201
124
, http://www.100md.com
61.7
φp222070×225
292
168
57.5
φp222070×411
218
124
56.9
φp222070×169
316
150
, http://www.100md.com
47.5
φp222070×184
214
94
44
φp222070×1811
306
86
42
φp222070×1851
430
160
, 百拇医药
37
为证明上述获得的11株突变体的amber突变发生在purR上，排除purR-表型产生于 lacZ突变或purDOc突变的可能性，以purR+近旁插入一拷贝mini-Tn10d-tet(tet与purR+90%连锁)的TGM463菌株的P22裂解物为供体，11株候选株分别为受体作转导杂交，在阻遏的EMB加四环素平板上选择Tetr转导子，因鼠伤寒沙门氏菌purR定位于31.5min， purD定位于40min，如果amber突变发生于purR上，则Tetr转导子应出现一定比例的白色或粉红色菌落，否则将出现100%的红色菌落。实验结果表明，11株候选株的Tetr转导子均出现白色或粉红色菌落，tet和amber突变的共转导频率在20%～80%之间。说明amber突变发生在purR上，tet与amber共转导频率的差异反映这11株突变体的amber突变可能发生在purR不同区域或位点上。这11株purR(am)的遗传型为purRs，purD：：MudJ(lacZ，Kanr)purR(am)。表3为它们在阻遏和消阻遏条件下的β-半乳糖苷酶活性。由表3可见，11株purR(am)突变体均呈组成型表达。 表3 purR(am)突变体的组成型表达
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Table 3 Constitutive expression of purR amber mutants 菌株 Strains
遗传型 Genotype
β-半乳糖苷酶活性1)
Ado 10μg/ml
β-galactosidsase activity Ado 120μg/ml
阻遏倍数2)
Repression fold
3-18
PurRs,purD::MudJ
, 百拇医药
3.99
28.73
7.19
320
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
67.86
64.52
0.95
225
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
58.38
, 百拇医药
55.54
1.15
169
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
62.12
72.27
0.93
299
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
63.38
59.24
, http://www.100md.com
0.94
328
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
94.06
88.51
0.93
184
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
73.63
68.61
0.86
, http://www.100md.com
411
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
68.86
59.25
0.98
415
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
90.60
89.23
1.00
1811
, 百拇医药
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
69.5
65.3
1.00
1851
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
31.9
36.8
1.10
327
PurRs,purD::MudJ pur R(am)
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50.83
62.96
1)β-半乳糖苷酶活性(=nmol/min/OD650ml),每一活性值为3次平行处理的算术平均值;2)消阻遏条件(10μg/ml Ado)下的β-半乳糖苷酶活性值除经阻遏条件(120μg/ Ado)下的活性值
1)β-galactosidase activity=nmol/min /OD650ml,Every value of β-galactosidase activity is a arithmetic mean of 3 parallel treatments;2)Repression fold is the ratio of β-galactosidase activity under the derepression condition to the activity in the condition of repression
, 百拇医药
2.3purR(am)突变体的氨基酸取代及其对功能影响实验采用了3种tRNA抑制基因，supD插入丝氨酸(Ser)、supE插入谷氨酸(Glu)、supF插入(Tyr)。为将上述tRNA抑制基因引入purR(am)突变菌株，本实验利用supD、supE和supF近旁插入有一拷贝mini-Tn10d-tet(tet与tRNA抑制基因的连锁频率分别为50%、50%、50%)的菌株TT2070、TT2342、TT2337的P22裂解物作为供体分别对11株purR(am)作转导，在阻遏的EMB加四环素的平板上选择Tetr转导子。
当以supD为供体时，所有菌株的Tetr转导子中均出现约50%的白色或粉红色菌落(与前述结果一致)。当以supE为供体时只有1851、320、1811、411各菌株的Tetr转导子中出现约50%的白色菌落，184、415出现粉红色菌落，其余均为红色菌落。当以supF为供体作转导时出现白色或粉红色转导菌落的突变体有320、411、1811各株，出现粉红色转导菌落的突变体有1851、328和184各菌株。其余均为红色菌落。为确定上述红色转导子菌落中确有引入的supE或supF，对每个突变体分别挑取10个独立的转导子菌落制备P22裂解 物作供体，与已知有supE或supF校正功能的purR(am)菌株320、1851作转导杂交。转导子菌落若出现约50%的白色菌落表明供体中有sup基因。采用这种方法对于每个待检 purR(am)突变体均获得了含有supE或supF的红色转导子。
, 百拇医药
对上述所获得的白色或粉红色转导子，和经证明含有supE或supF基因的红色转导子，进行了阻遏和消阻遏条件下的β-半乳糖苷酶活性测定(图1)
图1 purR(am)突变体的氨基酸取代及其对功能的影响AR.阻遏条件(120μg/ml Ado)下的β-半乳糖苷酶活性值;AD 消阻遏条件(10μg/ml Ado)下的β-半乳糖苷酶活性值;每一活性值为3次平行处理的算术平均值.A、B、C。分别为supD、supE、supF校正11种purR(am)UAG位点的结果
Fig.1 Amino acids substitution of purR(am)mutants and their effects on PurR function AR.β-galactosidase activity in the condition of repression(120μg/ml Ado);AD .β-galactosidase activity under derepression conditio (10μg/ml Ado) ;Every value is a arithmetic mean of 3 parallel treatments;A,B,Cpresented the correction results of 11 purR am (UAG )sites by supD、supE、supF respectively
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由图1中可以看出：(1)所有11株purR(am)突变体的UAG位点被Ser取代，均能使PurR调节功能得到部分或全部恢复。(2)部分突变体的UAG位点被Glu或Tyr取代也可使PurR调节功能得以恢复。如突变体320、1811、411等。(3) 当同一purR(am)突变体的UAG位点被不同的氨基酸取代时，对PurR调节功能的影响差别较大。如1851的UAG位点分别被Ser、Glu、Tyr 3种氨基酸取代时，PurR调节功能恢复程度依次降低。表现为阻遏条件下β-半乳糖苷酶活性值依次增大(7.24<28.31<39.9)。而某些突变体，如327、299、169、225等，引入Glu和Tyr均不能恢复PurR调节功能。
参考文献
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