西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择的研究
作者：许勇 张海英 康国斌 王永健 陈杭
单位：国家蔬菜工程技术研究中心， 北京 100089
关键词：西瓜(Citrullus lanatus)；抗枯萎病；RAPD；SCAR；分子标记辅助选择
遗传学报000210
摘要： 将西瓜野生种质PI296341抗枯萎病生理小种1的抗性基因连锁的RAPD标记OPP01/700进行克隆、测序，Southern杂交证明此标记为1个单拷贝，并转化为SCAR标记，简化了SCAR扩增产物的检测技术。上述技术在抗病转育后代选择中得到了很好的应用，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。
中图分类号： Q789 文献标识码： A
文章编号：0379-172(2000)02-151-157
, 百拇医药
Studies of Molecular Marker-assisted-selection for Resistance to Fusarium Wilt in Watermelon (Citrullus lanatus) Breeding
XU Yong, ZHANG Hai-Ying, KANG Guo-Bin, WANG Yong-Jian, CHEN Hang
(National Engineering Research Center for Vegetable, Beijing 100089, China)
Abstract: The RAPD marker OPP01/700 proved to be linked to the Fusarium wilt resistant gene in watermelon wild germplasm PI296341 was cloned and sequenced, and transferred into a SCAR marker. The linked marker was tested to be one copy by Southern blotting. The technique of detection of the SCAR-amplified products was simplified. These techniques were applied in selecting resistant plants in F3 of the introgression of the disease resistant gene. It is the first report in this field of transfer ring a RAPD marker linked to disease resistance gene into SCAR marker, and establishing the technique of molecular marker-assisted-selection for breeding Fusarium wilt resistance cultivars.
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Key words: watermelon (Citrullus lanatus); Fusarium wilt resistance; SCAR; RAPD;molecular marker-assisted-selection
西瓜枯萎病是世界范围内西瓜生产最严重的障碍，培育抗枯萎病品种是解决这一问题的有效途径[1]。西瓜枯萎病菌[Fusarium oxysporum f. sp. niveurn (E. F. Smith) Synder & Hensen]存在3个生理小种0，1，2[2]。我国大多数学者认为中国以生理小种1占主导[3～5]。野生西瓜材料PI296341是国际上目前公认的唯一1份抗枯萎病3个生理小种的抗源[6]，由于其农艺与品质性状极差，不能直接作为育种材料来使用，需要将其优良抗性转育到商业品种上，但由于传统育种的转育方法的效率较低，需要建立一种全新的更为有效的育种选择方法，分子标记技术的建立与发展为解决这一问题提供了有效途径[7]。
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本实验室已报道了与枯萎病生理小种1抗性基因连锁的RAPD(random amplified polymorphic DNA)标记OPP01/700[8]。本文采用SCAR(sequence characteristic amplified region)技术，将连锁的RAPD标记转化为以PCR为基础的检测标记，通过简化SCAR扩增产物的检测技术以及在抗病转育后代选择中进行验证，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。这为高效利用西瓜野生种质的优良抗病性状提供了可能，也为最终定位与克隆西瓜野生种质的抗病基因打下了良好基础。
1 材料和方法
1.1 试材
实验所用的西瓜野生材料(Citrulls lanatus var. citroides)由美国Clemson大学Rhodes教授赠送，代号为PI296341，该材料来源于非洲，在当地称为Tsamma西瓜，其农艺性状较差，生长势旺，甜度低，皮厚，耐贮运。普通西瓜(Citrullus lanatus var lanatus)材料
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为“京欣一号”父本自交系，代号为97103，及97103×PI296341杂交获得的F2代105个单株与F3代88个单株。
1.2 方法
1.2.1 西瓜苗期抗枯萎病鉴定方法 接种方法为国际通用的浸根法[9]。西瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)西瓜专化型生理小种1，采自北京通县。病情分级标准按Martyn等[9]的标准进行分级，2级以下为抗病植株，3级以上为感病植株，具有典型病害症状的植株确定为感病植株。接种存活的单株，再进行切根灌菌液处理，以进一步鉴定其抗病性，灌根处理10～15d调查其死苗情况，最终存活的植株定为抗病植株。
1.2.2 DNA提取方法 采用本实验室已报道的西瓜DNA快速简单提取方法[10]。
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1.2.3 RAPD朠CR扩增反应体系与程序 25μl的反应体系中含有10×buffer(Tris-HCl10mmol/L pH8.0, KCl 50mmol/L, MgCl2 2.0mmol/L)2.5μl, 2.5mmol/L dNTP 2.0μl,引物30ng，TaqE 1U，模板DNA 10ng。引物与dNTP购自上海生工公司(为与国际交流，将上海生工公司引物S编号转成OPERON公司的引物编号)，TaqE购自北京泰克金公司。扩增程序为94℃变性30s，37℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环。PCR仪为美国PE公司生产的PE-480扩增仪。
1.2.4 电泳检测扩增产物 取10μl反应产物，与2μl溴酚蓝(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液)混匀，点入含0.5μg/ml EB的1.5%琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳1～2h，以λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ做标准分子量标记，确定DNA片段在胶上的相对位置，利用Kodak EDAS-120凝胶分析仪进行凝胶分析。
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1.2.5 与抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700的回收、纯化与克隆 将所需条带在紫外灯下挖出，放入Eppendorf管中，如果条带所含的DNA量较少，则加入200μl ddH2O，在94℃溶解5min，取2μl DNA溶液进行重扩增，电泳检测，剩下的重扩增溶液进行纯化。采用Wizard PCR DNA纯化系统纯化。RAPD产物与载体的连接采用Promega公司的PGEM-easy vector系统。参照《分子克隆实验指南》进行重组质粒的转化与筛选。利用碱法提取重组质粒，采用酶切与PCR进行检测。
1.2.6 利用地高辛标记进行Southern杂交分析 CTAB法[11]提取抗病亲本和感病亲本的DNA各2份。以EcoRⅠ单酶切、与BamHⅠ单酶切50g DNA。在0.7%琼脂糖凝胶电泳，溴酚蓝至全长3/4时停止电泳，拍摄凝胶后开始转膜。参照《分子克隆实验指南》中的方法进行转膜。采用美国Boehringer Mannheim公司的DIG High Prime Labelling and Detection Starter Kit I进行探针标记。探针标记与膜杂交及显色方法参照试剂盒说明书进行。
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1.2.7 OPP01/700片段的测序 委托中科院微生物所测序并提供结果。
1.2.8 SCAR标记引物的设计与扩增 在OPP01/700片段2端包括RAPD引物的10个碱基再延长12～17bp，并检查所设计的引物是否形成发卡结构、退火温度是否大于50℃等引物设计的一般条件。利用已设计的引物对，进行SCAR扩增，扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，不同退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃)退火1min，72℃延长2min，35个循环。
1.2.9 SCAR扩增产物的快速检测 扩增管中加入50ng/ml EB，点到Parafilm膜上和
酶联板孔中，或点到含有EB的1% Agarose胶的点样孔中，在紫外灯下观察照相，或在高压200V电泳10min。比较几种方法的检测效果。
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1.2.10 SCAR标记在抗性转育后代中的验证 对F3代随机抽取88个单株进行苗期抗病性鉴定，并同时进行SCAR分析，比较上述2个结果，计算SCAR标记鉴定的准确率。
2 结果与分析
2.1 与西瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700的克隆与测序
我们已报道与西瓜野生材料PI296341抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700，它与抗枯萎病基因之间的连锁距离为3.0cM[8]。
OPP01/700片段经回收纯化得到高质量的DNA，然后与PGEM- easy Vector连接，并转化到E. coli中。检测6个白斑克隆，经酶切与PCR扩增检测，其中4个克隆均有插入的目的片段，表现为阳性。将其阳性克隆进行测序，结果表明：在序列的两端均有RAPD的OPP01引物的结合位点，这进一步证实了克隆片段的正确性。同时，在2条所测的序列上存在互补碱基区。通过计算，OPP01/700片段的碱基数目为697个。
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2.2 OPP01/700片段的Southern杂交检测
Southern杂交检测表明：经EcoRⅠ单酶切，在抗病亲本的DNA上能杂交到1条带而感病亲本上无带(图1)。上述结果初步证明：本实验所获得的抗病连锁标记为单拷贝标记，这将十分有利于将抗病基因定位在遗传图谱上。
图1 Southern杂交检测结果1～4。ExoRI酶切的抗、感亲本DNA；CK。回收的OPP01/700
Fig.1 Results of Southern gybrization detection 1~4.Disease resistant adn susceptible parents DNA digested with Eco RI respectively;CK Re-amplified fragment of OPP01/700
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2.3 将与西瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700转化为SCAR标记依据OPP01/700片段测序的结果，在原有OPP01引物10个碱基的基础上，向内延长12～17个碱基，获得如下引物：
上游引物： 5′GTA GCA CTC CAA CAT TTA TTC TAA TTC 3′
下游引物： 5′GTA GCA CTC CCA ACT CAT ACA AAT 3′
上述引物的G+C含量较低，其Tm值仅为53.9℃，比较不同退火温度45℃、50℃、55℃、60℃的扩增效果，最终确定SCAR扩增的复性温度在55℃。
利用SCAR标记引物，在55℃的复性温度下，35个循环的条件下获得良好的SCAR扩增结果，与其对应的RAPD扩增结果完全对应(图2)，这是目前西瓜分子标记研究中第1个SCAR标记，将此命名为SCP01/700标记。
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图2 SCAR 与RAPD 引物对抗感病亲本与F2抗病单株的扩增结果1，2分别为抗病亲本的RAPD 和SCAR 谱带；5～10。分别为F2抗病单株的SCAR 和RAPD 谱带
Fig.2Amplification paterns of SCAR and RAPD of disease resistant and susceptible parents and F2 individuals 1,2 Respectively patterns of RAPD and SCAR of RAPD and SCAR of disease susceptible parentsl;5 ～10.Patterns of SCAR and RAPD of F2 individuals
2.4 SCP01/700标记在抗病转育后代选择中的验证以及抗枯萎病育种分子标记辅助选择系统的建立
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利用97103×PI296341的杂交F3后代88个单株为试材，在进行苗期抗枯萎病鉴定的同时，进行SCAR分析(图3)。通过比较上述2个鉴定结果表明：SCAR分析与苗期抗病性鉴定结果的吻合率在95%，这和RAPD标记OPP01 /700与抗病基因的遗传距离为3.0cM的结果是相一致的，95%的SCAR检测的准确率运用到实际抗病育种中，对于提高抗病育种中的效率已有相当大的保证，当然，如果能进一步研究找到抗病基因两端都存在且紧密连锁的分子标记，有可能将检测准确率提高到99%以上。
图3 SCAR引物对F3单株的扩增结果
Fig.3 Patterns of SCAR of F3 individuals
进一步使得SCAR检测技术在抗病育种中得以实际运用，本项研究对扩增产物的检测进行了进一步简化，由于SCAR扩增在抗病植株中只扩增1条带，而在感病植株中无扩增带，也就是说PCR扩增管中有大量DNA产生的为抗病单株，相反为感病单株，据此，Gu等报道[12]将琼脂糖电泳检测步骤省去，直接在PCR管中加入EB染色，在紫外灯直接观测扩增产物是否有大量DNA存在。本实验按此方法进行检测，结果表明：扩增产物在Parafilm膜或酶联板上，通过EB染色不能十分明显区别扩增产物是否有大量DNA产生，容易导致误判，与电泳检测的结果有一些出入(图4)，Gu等人的结果也认为这种方法有1%～2%误判率。这可能由于是PCR扩增产物中存在有少量非特异性扩增产物、引物二聚体以及少量模板DNA，增加了底色，干扰了判断。另外，本实验采用快速提取DNA的方法提取模板DNA，未去除RNA，也会导致扩增产物中底色偏高。本实验改用在琼脂糖电泳板上进行检测，其效果明显好于在Parafilm膜和酶联板上，这可能是琼脂糖电泳板的点样孔较小，四周都有EB存在，扩增产物中有大量DNA产生的，其荧光较强。对于少量易出现误判的，可以采取高压200V进行快速电泳，大约只需10min，琼脂糖胶只需1cm长，将指示剂赶出点样孔即可，可以清楚地区分是否有DNA扩增，完全保证了实验结果的准确性(图4)。这种方法可将原1个小电泳板改为3排电泳孔，电泳时间缩短为10min。上述方法具有成本低、快速等优点，完全可以被育种实践所接受。同时，这一方法也为大批量杂交种子纯度与真实性的分子鉴定提供了快速简单的检测SCAR-PCR扩增产物的方法。利用上述技术对F3单株的SCAR朠CR扩增产物进行检测，得到了满意的结果(图5)。
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图4 利用EB染色在parafilm膜(A)酶联板(B)和含EB琼脂糖胶(C，D)直接检测SCAR-PCR产物1～4。抗病亲本PI296341单株；5～8。感病亲本97103单株
Fig.4 Detecting SCAR-PCR products by direct staining with EB on parafilm(A)plastic plate(B)and agarose plate containingEB(C,D)
1～4.Disease resistant parent PI296341 Plants;5～8.Disease susceptible parent 9713 plants
图5 利用含EB琼脂糖(A)和高压(200V)快速电泳(B)对F3单株检测
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2，5，9，11，13，14，17，19，20，22。抗病单株；1，3，4，6，7，8，10，12，15，16，18，21.感病单株
Fig.5 Screening F2 individuals directly detection on agarose p;ate containing EB(A)and fast electrophoresising withhigh voltage (200v)(B)
2，5，9，11，13，14，17，19，20，22。Disease resistant plants;1，3，4，6，7，8，10，12，15，16，18，21.Disease resistant plants;1
通过利用本实验室已报道的西瓜DNA快速简单提取技术[10]，以及本项研究将抗病连锁RAPD标记转化为SCAR标记和扩增产物检测技术的实用化，构成了1整套西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择的技术系统。利用该技术系统，2个熟练技术人员可以对100个单株群体，在1个工作日内完成检测任务，且只需半籽种子(较大的西瓜种子)，不影响试材进行其他实验，其抗病选择的准确率达到95%。其检测费用也完全可以被育种家所接受。而传统西瓜苗期抗病鉴定方法常常因病原菌的制备、接种方法以及外界环境等原因影响实验的准确性与稳定性，且周期长。因此，本项研究所建立的西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术具有简单、快速、实用与费用低等多项优点，完全可以在抗病育种实践中应用。这是国内外目前为止，首次在西瓜上获得的抗病基因RAPD标记，并转化为SCAR标记，且建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。
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3 讨论
由于RAPD技术原理本身存在着缺陷，有必要采用新的标记技术来提高RAPD技术的稳定性[7]。目前最有效的方法是将已获得目标性状连锁的RAPD标记转化为SCAR标记，由于SCAR标记的引物比RAPD的引物加长10多个碱基，其退火温度可以提高到50℃～60℃，其不稳定的因素就可以克服了，同时SCAR标记有可能成为共显性标记。对显性标记可以对PCR产物直接进行染色，而无需进行电泳检测，因此SCAR标记在育种实践中更具有简单实用且成本低等多项优点。本实验通过对与抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700转化为SCAR标记的研究，进一步证实了SCAR标记所具有的优越性。
由于PI296341具有枯萎病生理小种2的抗性，进一步研究完全将有可能获得其连锁标记，并转化为SCAR标记。利用分子标记辅助选择方法，开展枯萎病多个生理小种抗性基因的转育与富聚，与传统抗病育种方法相比，具有高效、简单、快速等优点，而且对新的
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小种来讲，可以避免因大规模的接种实验所导致的病原菌扩散。本项研究是国内首次建立的蔬菜抗病育种分子标记辅助育种系统，对于其他蔬菜作物来讲，也有其借鉴意义。
利用本实验所建立的分子标记辅助选择系统，在实际育种中仍有一定的局限性。因为它只能对抗枯萎病生理小种1的基因进行选择，而对其他农艺性状和品质性状，还不能做到分子标记辅助选择，而在进行野生种的抗性基因转育过程中，与其说是在选择抗病基因，还不如说是在不断剔除其不良性状的连锁累赘，也就是说，如果能在转育后代中，利用分子标记技术在进行抗病基因选择的同时对农艺性状与品质性状进行选择，将会大大提高西瓜育种效率。因此，进一步开展西瓜优良农艺性状与品质性状QTL分子标记研究，就显得更为重要。这也是本实验室目前正在进行的一项研究工作。
本实验通过Southern杂交检测已证明所获得的抗病基因连锁标记为1个单拷贝标记，这为进一步开展抗病基因定位提供了可能。由于西瓜的基因组(4.3×105kb)较小，与水稻相近，完全有可能在短时间内获得饱和的分子遗传图谱。本实验所获得的SCAR标记SCP01/700，可以成为西瓜抗枯萎病基因在西瓜基因组中的1个“界标”，进一步开展研究，在此区域内获得高饱和的精细连锁图谱和进行染色体步行，将最终获得紧密连锁的分子标记(遗传距离小于0.3cM)。近几年内，利用图谱定位克隆技术克隆植物抗病基因的报道越来越多，番茄的抗枯萎病基因已被克隆[13]，说明图谱定位克隆技术已越来越完善。因此，有理由相信，西瓜抗枯萎病基因将在不久的将来被克隆。这将会有利于最终阐明西瓜抗枯萎病机制，并为提高西瓜枯萎病抗性提供新的策略与方法。
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参考文献
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单位：国家蔬菜工程技术研究中心， 北京 100089
关键词：西瓜(Citrullus lanatus)；抗枯萎病；RAPD；SCAR；分子标记辅助选择
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摘要： 将西瓜野生种质PI296341抗枯萎病生理小种1的抗性基因连锁的RAPD标记OPP01/700进行克隆、测序，Southern杂交证明此标记为1个单拷贝，并转化为SCAR标记，简化了SCAR扩增产物的检测技术。上述技术在抗病转育后代选择中得到了很好的应用，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。
中图分类号： Q789 文献标识码： A
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Abstract: The RAPD marker OPP01/700 proved to be linked to the Fusarium wilt resistant gene in watermelon wild germplasm PI296341 was cloned and sequenced, and transferred into a SCAR marker. The linked marker was tested to be one copy by Southern blotting. The technique of detection of the SCAR-amplified products was simplified. These techniques were applied in selecting resistant plants in F3 of the introgression of the disease resistant gene. It is the first report in this field of transfer ring a RAPD marker linked to disease resistance gene into SCAR marker, and establishing the technique of molecular marker-assisted-selection for breeding Fusarium wilt resistance cultivars.
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1 材料和方法
1.1 试材
实验所用的西瓜野生材料(Citrulls lanatus var. citroides)由美国Clemson大学Rhodes教授赠送，代号为PI296341，该材料来源于非洲，在当地称为Tsamma西瓜，其农艺性状较差，生长势旺，甜度低，皮厚，耐贮运。普通西瓜(Citrullus lanatus var lanatus)材料
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为“京欣一号”父本自交系，代号为97103，及97103×PI296341杂交获得的F2代105个单株与F3代88个单株。
1.2 方法
1.2.1 西瓜苗期抗枯萎病鉴定方法 接种方法为国际通用的浸根法[9]。西瓜枯萎病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)西瓜专化型生理小种1，采自北京通县。病情分级标准按Martyn等[9]的标准进行分级，2级以下为抗病植株，3级以上为感病植株，具有典型病害症状的植株确定为感病植株。接种存活的单株，再进行切根灌菌液处理，以进一步鉴定其抗病性，灌根处理10～15d调查其死苗情况，最终存活的植株定为抗病植株。
1.2.2 DNA提取方法 采用本实验室已报道的西瓜DNA快速简单提取方法[10]。
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1.2.3 RAPD朠CR扩增反应体系与程序 25μl的反应体系中含有10×buffer(Tris-HCl10mmol/L pH8.0, KCl 50mmol/L, MgCl2 2.0mmol/L)2.5μl, 2.5mmol/L dNTP 2.0μl,引物30ng，TaqE 1U，模板DNA 10ng。引物与dNTP购自上海生工公司(为与国际交流，将上海生工公司引物S编号转成OPERON公司的引物编号)，TaqE购自北京泰克金公司。扩增程序为94℃变性30s，37℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环。PCR仪为美国PE公司生产的PE-480扩增仪。
1.2.4 电泳检测扩增产物 取10μl反应产物，与2μl溴酚蓝(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液)混匀，点入含0.5μg/ml EB的1.5%琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳1～2h，以λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ做标准分子量标记，确定DNA片段在胶上的相对位置，利用Kodak EDAS-120凝胶分析仪进行凝胶分析。
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1.2.5 与抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700的回收、纯化与克隆 将所需条带在紫外灯下挖出，放入Eppendorf管中，如果条带所含的DNA量较少，则加入200μl ddH2O，在94℃溶解5min，取2μl DNA溶液进行重扩增，电泳检测，剩下的重扩增溶液进行纯化。采用Wizard PCR DNA纯化系统纯化。RAPD产物与载体的连接采用Promega公司的PGEM-easy vector系统。参照《分子克隆实验指南》进行重组质粒的转化与筛选。利用碱法提取重组质粒，采用酶切与PCR进行检测。
1.2.6 利用地高辛标记进行Southern杂交分析 CTAB法[11]提取抗病亲本和感病亲本的DNA各2份。以EcoRⅠ单酶切、与BamHⅠ单酶切50g DNA。在0.7%琼脂糖凝胶电泳，溴酚蓝至全长3/4时停止电泳，拍摄凝胶后开始转膜。参照《分子克隆实验指南》中的方法进行转膜。采用美国Boehringer Mannheim公司的DIG High Prime Labelling and Detection Starter Kit I进行探针标记。探针标记与膜杂交及显色方法参照试剂盒说明书进行。
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1.2.7 OPP01/700片段的测序 委托中科院微生物所测序并提供结果。
1.2.8 SCAR标记引物的设计与扩增 在OPP01/700片段2端包括RAPD引物的10个碱基再延长12～17bp，并检查所设计的引物是否形成发卡结构、退火温度是否大于50℃等引物设计的一般条件。利用已设计的引物对，进行SCAR扩增，扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，不同退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃)退火1min，72℃延长2min，35个循环。
1.2.9 SCAR扩增产物的快速检测 扩增管中加入50ng/ml EB，点到Parafilm膜上和
酶联板孔中，或点到含有EB的1% Agarose胶的点样孔中，在紫外灯下观察照相，或在高压200V电泳10min。比较几种方法的检测效果。
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1.2.10 SCAR标记在抗性转育后代中的验证 对F3代随机抽取88个单株进行苗期抗病性鉴定，并同时进行SCAR分析，比较上述2个结果，计算SCAR标记鉴定的准确率。
2 结果与分析
2.1 与西瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700的克隆与测序
我们已报道与西瓜野生材料PI296341抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700，它与抗枯萎病基因之间的连锁距离为3.0cM[8]。
OPP01/700片段经回收纯化得到高质量的DNA，然后与PGEM- easy Vector连接，并转化到E. coli中。检测6个白斑克隆，经酶切与PCR扩增检测，其中4个克隆均有插入的目的片段，表现为阳性。将其阳性克隆进行测序，结果表明：在序列的两端均有RAPD的OPP01引物的结合位点，这进一步证实了克隆片段的正确性。同时，在2条所测的序列上存在互补碱基区。通过计算，OPP01/700片段的碱基数目为697个。
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2.2 OPP01/700片段的Southern杂交检测
Southern杂交检测表明：经EcoRⅠ单酶切，在抗病亲本的DNA上能杂交到1条带而感病亲本上无带(图1)。上述结果初步证明：本实验所获得的抗病连锁标记为单拷贝标记，这将十分有利于将抗病基因定位在遗传图谱上。
图1 Southern杂交检测结果1～4。ExoRI酶切的抗、感亲本DNA；CK。回收的OPP01/700
Fig.1 Results of Southern gybrization detection 1~4.Disease resistant adn susceptible parents DNA digested with Eco RI respectively;CK Re-amplified fragment of OPP01/700
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2.3 将与西瓜抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700转化为SCAR标记依据OPP01/700片段测序的结果，在原有OPP01引物10个碱基的基础上，向内延长12～17个碱基，获得如下引物：
上游引物： 5′GTA GCA CTC CAA CAT TTA TTC TAA TTC 3′
下游引物： 5′GTA GCA CTC CCA ACT CAT ACA AAT 3′
上述引物的G+C含量较低，其Tm值仅为53.9℃，比较不同退火温度45℃、50℃、55℃、60℃的扩增效果，最终确定SCAR扩增的复性温度在55℃。
利用SCAR标记引物，在55℃的复性温度下，35个循环的条件下获得良好的SCAR扩增结果，与其对应的RAPD扩增结果完全对应(图2)，这是目前西瓜分子标记研究中第1个SCAR标记，将此命名为SCP01/700标记。
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图2 SCAR 与RAPD 引物对抗感病亲本与F2抗病单株的扩增结果1，2分别为抗病亲本的RAPD 和SCAR 谱带；5～10。分别为F2抗病单株的SCAR 和RAPD 谱带
Fig.2Amplification paterns of SCAR and RAPD of disease resistant and susceptible parents and F2 individuals 1,2 Respectively patterns of RAPD and SCAR of RAPD and SCAR of disease susceptible parentsl;5 ～10.Patterns of SCAR and RAPD of F2 individuals
2.4 SCP01/700标记在抗病转育后代选择中的验证以及抗枯萎病育种分子标记辅助选择系统的建立
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利用97103×PI296341的杂交F3后代88个单株为试材，在进行苗期抗枯萎病鉴定的同时，进行SCAR分析(图3)。通过比较上述2个鉴定结果表明：SCAR分析与苗期抗病性鉴定结果的吻合率在95%，这和RAPD标记OPP01 /700与抗病基因的遗传距离为3.0cM的结果是相一致的，95%的SCAR检测的准确率运用到实际抗病育种中，对于提高抗病育种中的效率已有相当大的保证，当然，如果能进一步研究找到抗病基因两端都存在且紧密连锁的分子标记，有可能将检测准确率提高到99%以上。
图3 SCAR引物对F3单株的扩增结果
Fig.3 Patterns of SCAR of F3 individuals
进一步使得SCAR检测技术在抗病育种中得以实际运用，本项研究对扩增产物的检测进行了进一步简化，由于SCAR扩增在抗病植株中只扩增1条带，而在感病植株中无扩增带，也就是说PCR扩增管中有大量DNA产生的为抗病单株，相反为感病单株，据此，Gu等报道[12]将琼脂糖电泳检测步骤省去，直接在PCR管中加入EB染色，在紫外灯直接观测扩增产物是否有大量DNA存在。本实验按此方法进行检测，结果表明：扩增产物在Parafilm膜或酶联板上，通过EB染色不能十分明显区别扩增产物是否有大量DNA产生，容易导致误判，与电泳检测的结果有一些出入(图4)，Gu等人的结果也认为这种方法有1%～2%误判率。这可能由于是PCR扩增产物中存在有少量非特异性扩增产物、引物二聚体以及少量模板DNA，增加了底色，干扰了判断。另外，本实验采用快速提取DNA的方法提取模板DNA，未去除RNA，也会导致扩增产物中底色偏高。本实验改用在琼脂糖电泳板上进行检测，其效果明显好于在Parafilm膜和酶联板上，这可能是琼脂糖电泳板的点样孔较小，四周都有EB存在，扩增产物中有大量DNA产生的，其荧光较强。对于少量易出现误判的，可以采取高压200V进行快速电泳，大约只需10min，琼脂糖胶只需1cm长，将指示剂赶出点样孔即可，可以清楚地区分是否有DNA扩增，完全保证了实验结果的准确性(图4)。这种方法可将原1个小电泳板改为3排电泳孔，电泳时间缩短为10min。上述方法具有成本低、快速等优点，完全可以被育种实践所接受。同时，这一方法也为大批量杂交种子纯度与真实性的分子鉴定提供了快速简单的检测SCAR-PCR扩增产物的方法。利用上述技术对F3单株的SCAR朠CR扩增产物进行检测，得到了满意的结果(图5)。
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图4 利用EB染色在parafilm膜(A)酶联板(B)和含EB琼脂糖胶(C，D)直接检测SCAR-PCR产物1～4。抗病亲本PI296341单株；5～8。感病亲本97103单株
Fig.4 Detecting SCAR-PCR products by direct staining with EB on parafilm(A)plastic plate(B)and agarose plate containingEB(C,D)
1～4.Disease resistant parent PI296341 Plants;5～8.Disease susceptible parent 9713 plants
图5 利用含EB琼脂糖(A)和高压(200V)快速电泳(B)对F3单株检测
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2，5，9，11，13，14，17，19，20，22。抗病单株；1，3，4，6，7，8，10，12，15，16，18，21.感病单株
Fig.5 Screening F2 individuals directly detection on agarose p;ate containing EB(A)and fast electrophoresising withhigh voltage (200v)(B)
2，5，9，11，13，14，17，19，20，22。Disease resistant plants;1，3，4，6，7，8，10，12，15，16，18，21.Disease resistant plants;1
通过利用本实验室已报道的西瓜DNA快速简单提取技术[10]，以及本项研究将抗病连锁RAPD标记转化为SCAR标记和扩增产物检测技术的实用化，构成了1整套西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择的技术系统。利用该技术系统，2个熟练技术人员可以对100个单株群体，在1个工作日内完成检测任务，且只需半籽种子(较大的西瓜种子)，不影响试材进行其他实验，其抗病选择的准确率达到95%。其检测费用也完全可以被育种家所接受。而传统西瓜苗期抗病鉴定方法常常因病原菌的制备、接种方法以及外界环境等原因影响实验的准确性与稳定性，且周期长。因此，本项研究所建立的西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术具有简单、快速、实用与费用低等多项优点，完全可以在抗病育种实践中应用。这是国内外目前为止，首次在西瓜上获得的抗病基因RAPD标记，并转化为SCAR标记，且建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。
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3 讨论
由于RAPD技术原理本身存在着缺陷，有必要采用新的标记技术来提高RAPD技术的稳定性[7]。目前最有效的方法是将已获得目标性状连锁的RAPD标记转化为SCAR标记，由于SCAR标记的引物比RAPD的引物加长10多个碱基，其退火温度可以提高到50℃～60℃，其不稳定的因素就可以克服了，同时SCAR标记有可能成为共显性标记。对显性标记可以对PCR产物直接进行染色，而无需进行电泳检测，因此SCAR标记在育种实践中更具有简单实用且成本低等多项优点。本实验通过对与抗枯萎病基因连锁的RAPD标记OPP01/700转化为SCAR标记的研究，进一步证实了SCAR标记所具有的优越性。
由于PI296341具有枯萎病生理小种2的抗性，进一步研究完全将有可能获得其连锁标记，并转化为SCAR标记。利用分子标记辅助选择方法，开展枯萎病多个生理小种抗性基因的转育与富聚，与传统抗病育种方法相比，具有高效、简单、快速等优点，而且对新的
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小种来讲，可以避免因大规模的接种实验所导致的病原菌扩散。本项研究是国内首次建立的蔬菜抗病育种分子标记辅助育种系统，对于其他蔬菜作物来讲，也有其借鉴意义。
利用本实验所建立的分子标记辅助选择系统，在实际育种中仍有一定的局限性。因为它只能对抗枯萎病生理小种1的基因进行选择，而对其他农艺性状和品质性状，还不能做到分子标记辅助选择，而在进行野生种的抗性基因转育过程中，与其说是在选择抗病基因，还不如说是在不断剔除其不良性状的连锁累赘，也就是说，如果能在转育后代中，利用分子标记技术在进行抗病基因选择的同时对农艺性状与品质性状进行选择，将会大大提高西瓜育种效率。因此，进一步开展西瓜优良农艺性状与品质性状QTL分子标记研究，就显得更为重要。这也是本实验室目前正在进行的一项研究工作。
本实验通过Southern杂交检测已证明所获得的抗病基因连锁标记为1个单拷贝标记，这为进一步开展抗病基因定位提供了可能。由于西瓜的基因组(4.3×105kb)较小，与水稻相近，完全有可能在短时间内获得饱和的分子遗传图谱。本实验所获得的SCAR标记SCP01/700，可以成为西瓜抗枯萎病基因在西瓜基因组中的1个“界标”，进一步开展研究，在此区域内获得高饱和的精细连锁图谱和进行染色体步行，将最终获得紧密连锁的分子标记(遗传距离小于0.3cM)。近几年内，利用图谱定位克隆技术克隆植物抗病基因的报道越来越多，番茄的抗枯萎病基因已被克隆[13]，说明图谱定位克隆技术已越来越完善。因此，有理由相信，西瓜抗枯萎病基因将在不久的将来被克隆。这将会有利于最终阐明西瓜抗枯萎病机制，并为提高西瓜枯萎病抗性提供新的策略与方法。
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