与小麦白粉病抗性基因Pm2紧密连锁RAPD标记的筛选研究
作者：刘金元 陶文静 刘大钧 陈佩度
单位：南京农业大学，农业部作物细胞遗传重点开放实验室，南京 210095
关键词：小麦；近等基因系；抗白粉病基因；RAPD标记
遗传学报000208
摘要：以256个随机引物对含小麦抗白粉病基因Pm2近等基因系进行RAPD分析，发现17个随机引物的扩增产物在抗、感NILs材料间表现多态性，且其中5个引物经4次以上重复，均获相同结果，其多态性标记分别为OPM081600、OPI041700、OPH191100、OPE09900及OPM16850。当以这5个随机引物对14个已知含Pm2基因的抗病材料及9个不含Pm2基因的感病材料进行检测时，只有标记OPI041700在12个抗病材料中出现(另两个抗病材料中未检测到)，而在9个感病材料中均未出现。进一步用OPI04对102株(Chancellor×Ulka/8*Cc)F2分离群体进行分析，估算出标记OPI041700与Pm2基因间的遗传距离为12.2±3.3cM。
, 百拇医药
中图分类号：S512.103.4 文献标识码：A
文章编号：0379-172(2000)02-139-145
Screening and Study of RAPD Markers Tightly Linked to Wheat
Powdery Mildew Resistance Gene Pm2
LIU Jin-Yuan, TAO Wen-Jing, LIU Da-Jun, CHEN Pei-Du
(Key Open Lab of Agri, Ministry for Crop Cytogenetics, Nanjing Agri. Univ., Nanjing 210095, China)
, 百拇医药
Abstract: The random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was made in Pm2 near杋sogenic lines (NILs) with 265 random primers.Seventeen out of the 256 tested primers amplified the polymorphic DNA in the NILs. Five of them showed the same discriminating results in more than four replications. The polymorphic bands were assigned to be OPM081600, OPI041700, OPH191100 and OPE09900, respectively. Using these five polymorphic primers to detect 14 resistant materials with Pm2 and 9 susceptible materials without Pm2, only OPI041700 was amplified in 12 of the 14 resistant materials and absent in all of the 9 susceptible materials. Further RAPD analysis of (Chancellor×Ulka/8*Cc)F2 plants by primer OPI04 indicated that the genetic distance of OPI041700 to Pm2 was 12.2±3.3cM.
, 百拇医药
Key words: wheat; near isogenic line; powdery mildew resistance gene (Pm); RAPD marker
以DNA杂交为基础的RFLP标记是在遗传研究中应用最为广泛的分子标记之一，但由于其在小麦中的多态性水平较低，加之操作过程复杂、成本较高，并需使用放射性同位素，因而限制了它在育种实践中的广泛应用。90年代初由Welsh和Williams[1,2]两个小组同时提出的RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是近年来发展起来的一种以PCR扩增为基础的新的标记技术。它是用一系列人工合成的寡聚核苷酸单链(通常为9～10bp)为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，以揭示相应区域DNA多态性。由于可供选择的引物很多，检测区域几乎覆盖整个基因组，因而多态性水平相对较高。而且RAPD分析程序简单、周期短、所需DNA量较少、自动化程度又高，因而此技术诞生不久，就被广泛应用于遗传作图、基因定位、分子标记筛选、外源染色质检测及物种起源与进化等遗传研究[3]。在小麦中，借助NILs为材料或集群分离分析(Bulked segregate analysis)方法已分别筛选到与小麦抗黑穗病基因[4]、抗白粉病基因[5，6]等紧密连锁的RAPD标记，有的并已成功应用于辅助选择。本文报道的是我们用Briggle[7]的含Pm2基因NILs进行的RAPD分析，以及所筛选到的与Pm2基因紧密连锁的RAPD标记。
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1 材料和方法
1.1 供试植物材料
实验所用小麦近等基因系分别为Ulka/8*Cc、Idaed59/8*Cc(简称ID59/8*Cc)(Pm2)及CI12632/8*Cc(Pm2+6)。含已知Pm基因的材料有：Ulka(Pm2)； CI12632、 CI12633、TP114、 Maris Huntsman、 Maris Dove、 PI405718(Pm2+6)。以上这些材料分别来自南京农业大学细胞遗传所、江苏省农科院粮作所及中国农科院植保所。扬麦5号、扬85?5和扬158是江苏省里下河地区农科所育成并在淮南冬麦区大面积推广的高产品种(系)。扬麦5号和扬158对白粉病中感，扬85?8对白粉病高感。为提高这些品种(系)的白粉病抗性，选用携有Pm2+6抗病基因的亲本TP114与它们杂交并连续多代回交，从中选出抗病新品系扬94-43、扬95-5和扬95-76，经与Pm2基因紧密连锁分子标记检测，皆含Pm2基因，而且它们的农艺性状已接近或超过扬85-5或扬158。(Chancellor×Ulka/8*Cc)F2分离群体用于检测RAPD标记与Pm2基因间的连锁程度。
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1.2 基因组DNA提取
DNA大量提取法(CTAB法)参照Gill等[8]提供的方法，细节上略有修改。DNA微量提取法参照Guidet等[9]的方法并略加改进。
1.3 PCR反应
随机引物为美国Operon公司产品，长度皆为10bp，随机选用其中265个引物进行扩增筛选。PCR反应体积为25μl，其中含有15～20ng模板DNA，0.2μmol/L随机引物，200μmol/L每种dNTPs，1×缓冲液[10mmol/L Tris-HCl (pH8.5～9.0), 50mmol/L KCl, 2.0mmol/L MgCl20.1% Triton-100或0.01% Gelatin]， 1U Taq酶。反应于Perkin-ElmerCetus DNA Thermal Cycler仪上进行。用于引物筛选的扩增条件如下：前4个循环为96℃变性1min， 35℃复性1min， 72℃延伸2min。后45个循环为94℃变性45s， 36℃复性1min， 72℃延伸90s，最后72℃延伸10min。以引物OPI04对不同含Pm2基因材料及F2分离群体分析时所用扩增条件同上，只是复性温度提高至38℃。
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1.4 白粉病抗性接种及鉴定
采用南京和江苏扬州地区田间及温室采集到的白粉病菌混合菌种进行人工接种，在感病对照充分发病的情况下(20℃左右，7～10d)，调查记录抗、感分离情况，2～3d后重复调查1次，至抽穗期再调查1次。病级鉴定按盛宝钦[10，11]提出的反应型分级标准进行。
1.5 数据分析
根据Allard (1956)最大似然法计算重组率，并按Kosambi (1944)系数将重组率转化为CentiMorgan (cM)。
2 结果与分析
2.1 白粉病抗性基因Pm2近等基因系的RAPD分析
本研究采用265个随机引物对Chancellor及其含Pm2基因的近等基因系Ulka/8*Cc及CI12632/8*Cc进行了分析，其中绝大多数引物均能扩增出1～7条明显可辨的条带。在以265个引物进行第一次初选时，有17个引物的扩增产物在抗、感NILs材料间揭示出多态性，但在随后对此17个引物的重复实验中，只有5个引物经4次以上重复，均获相同的结果。这5个引物扩增产物的多态性可分3种类型：(1)抗病NILs中的扩增带较感病亲本多1条(图1)，如引物OPM08(5′ TCTGTTCCCC 3′)、OPI04 (CCGCCTAGTC)和OPH19(CTGACCAGCC)。它们分别在1.6kb、1.7kb、 1.1kb处多出1条特异带， 分别被标记为 OPM081600、OPI041700、OPH191100。由此推测，由于抗病基因的引入而增加了适于这类引物之结合位点，因而特异带得以出现。(2)抗病NILs中的扩增带较感病亲本少1条(图2，a)。引物OPE09(CTTCACCCGA)在感病亲本中扩增出大小约为0.9kb的特异带，标记为OPE09900，而NILs中缺少此特异扩增带。推测由于抗病基因的引入，破坏了引物在此处的结合位点，致使这一片段得不到扩增。(3)抗、感材料间扩增出的特异带位置相同，但带的强弱差异显著(图2，b)。引物OPM16(GTAACCAGCC)在抗、感材料中皆扩增出一大小约为0.85kb的扩增带，标记为OPM16850，其在感病亲本中的强度明显高于抗病NILs中的，原因可能是感病材料中，此处引物结合位点较抗病NILs中的更适于其扩增，如果提高复性温度，NILs中的这条弱带也许会消失。
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图1 引物OPM08(a)、OPI04(b)及OPH19(C)的PCR 扩增结果箭头示多态性PCR扩增片段
Fig.1 The PCR ammlification results with primer of opm08(a),OPI04(b)and OPH19(c)M1.50～2000bp ladder (BIO-RAD ),M2,λ DNA HindⅢ/EcoRI,C.Chancellor ,U Ulda/8*Cc.D,ID59/8*Cc,I CI126328/8*Cc.Arrows show the polymorphic amplification bands
图2 引物OPE09(a)、OPM16(b)的PCR扩增结果CS。中国春；C、U、I的解释见图1箭头示多态性PCR 护增片段
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Fig.2 The PCR amplification results with primer of OPE09(a)and OPM16(b)CS.Chinese Spring,C,uIsee Fig.1 Arrows show the polymorphic bands
2.2 多态性引物对Pm2基因的检测
以上述筛选出的5个随机引物，对14个已知含Pm2基因的抗病材料及9个不含Pm2基因的感病材料分别进行扩增，以验证它们在检测不同遗传背景中Pm2基因的有效性。结果发现只有标记OPI041700能在大多数抗病材料中检测到，且在所有不含Pm2基因的材料中不出现(图3)， 其余4个引物未能将不同遗传背景中的Pm2基因检测出来，这表明标记OPI041700与Pm2基因是连锁的， 而其他4个引物的特异结合位点则与Pm2基因不连锁。
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图3 引物OPI04对不同麦材料的PCR扩增检测结晶
箭头示1。7kb多态性PCR扩增片段
Fig.3 PCR amplification results to different wheat materials with primer OPI04
M1.50～2000bp ladder (BIO-RAD ,)M2.λ DNA HinⅢ/EcoRI,1.Chancellor ,2.Ulja/8*Cc.3.(Cc×Ulk8*Cc)F1,4.ID59/8*Cc,5.CI12632/8*Cc,6.(Cc×CI12632/8*Cc)F1.7.uLKA,8.ci12633,9.Maris Dove ,10TP1114,11.y
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yANGMAI158,13.Yang95-75,14.Yang 95-76.Arrow shows the 1.7kb polymorphic band
2.3 (感病轮回亲本×抗病NIL)F2分离群体的RAPD分析
为进一步探讨标记OPI041700与Pm2基因间的连锁关系，我们对Chancellor×Ulka/8*Cc杂交F2分离群体进行了RAPD分析。种植于温室中的102株F2植株，苗期以当地混合菌株接种并分两次详细记载其发病情况。其中有81株表现抗病，21株感病，经χ2测验，抗病株感病株符合31分离比例(x2＝1.05920.05＝3.83)，进一步证实Ulka/8*Cc的抗病性由1显性基因控制(Briggle, 1969)。引物OPI04对102株F2植株扩增结果见图4及表1。
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图4 引物OPI04对(Chancellor×Ulka/8*Cc)F2分离群体PCR 扩增检测结果箭头示1.7kb多态性PCR 扩增片段
Fig.4 PCR amplification results to (Chancellor×Ulka/8*Cc)F2 population with primer OPI104C.Chancellor ,U,Uika ,M2:λDNA HindⅢ/EcoR I,Arrow shows the 1.7kb polymorphic band
表1 F2群体白粉病抗性分离与引物OPI04扩增结果的联系
Table 1 The reationship between resistance segregation and RAPDamplification results of OPI04 in F2 generation 抗性
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Resistan
株数
有OPIO41700标记
无OPI041700标记
抗病Resistant
81
80
1
感病Susceptible
21
9
12
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由表1可知，在81株F2抗病单株中，80株含OPI041700标记，另有1株无此标记，而在21株感病个体中，无此标记的只有12株，另外9株也具此标记。感病植株中出现此标记的机率较高的原因可能与混合菌种接种而引起调查误差有关，如果以Pm2专化白粉病菌菌株接种，此误差将会大大减小。按最大似然法及Kosambi公式计算出此标记与Pm2基因间的连锁距离为12.2±3.3cM。由于“中国春”中缺少此标记，因而无法藉缺体-四体材料将此标记定位至特定染色体上。在以扩增片段PI041700为RFLP探针进行Southern杂交分析时，其杂交结果呈重复序列带型。
3 讨论
本实验所用NILs是Briggle(1969)以含Pm2基因的Ulka或CI12632为供体，Chancellor为感病轮回亲本，经7代回交及1代自交后育成，其中供体DNA所占比例理论值为(1/2)8＝1/256，按六倍体小麦基因组大小16000M计算[12]，供体DNA片段仍占41.7Mb左右。虽然NILs是在施以白粉病的选择压力下育成，其中也存在在非选择压力下通过交换保存下来的供体DNA成分，如非编码区等，它们的存在对于RAPD扩增(扩增片段一般小于4kb)来讲往往会带来假象，因而在NILs中呈多态性的标记不一定与Pm2基因连锁。我们在以265个引物进行的初选扩增中，发现有17个引物(≈6.42%)在抗、感NILs间揭示出多态性，然而在进一步检测时发现最终只有5个引物(≈1.89%)可重复获得稳定的多态性，这一结果与Dweikat et al[13]在用RAPD对不同小麦品种分析时所得出的结果一致，他们发现RAPD在任意两个小麦品种之间扩增出多态性的频率在2%左右。
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RAPD扩增对反应条件变化较敏感，特别是Taq DNA多聚酶、Mg++浓度及模板浓度。
我们发现不同来源的Taq酶、同一来源但生产批次不同的Taq酶对扩增的成败皆有显著影响。对小麦而言，模板用量以15～20ng为宜，过高则扩增产物常会出现较强的“Smear”现象。另外，由于不同的引物在模板上的结合位点数及结合的紧密程度不一，因而它们对扩增条件要求的严格程度有所不同， 针对某一特异引物应该有其最佳扩增条件。
引物OPI04对扩增条件的要求看来相对较宽，即使不同来源的Taq酶，模板的质量及数量略有变化(在一定幅度内)时，也能扩增出重复性很好的结果。而且复性温度达40℃时，仍能获得满意的结果，也就是说其稳定性和可重复性较高。虽然标记OPI041700与Pm2基因之间的连锁距离超过10cM，但它在12个遗传背景不同的已知含Pm2基因小麦材料中皆能出现(表1)、而所有检测过的9个不含Pm2基因的感病品种(系)中均无此引物的特异扩增片段。这表明它在跟踪检测Pm2基因中仍具较大应用潜力。而且如果将此标记转化为更加稳定的SCAR标记，将更方便可靠地用于辅助选择育种，这方面的工作正在进行中。
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另外，我们还比较了来自大量提取法和微量提取法模板DNA对RAPD扩增的影响，结果发现两种方法所提DNA模板对RAPD扩增基本没有影响。但微量提取法简单、快速、成本低廉，这将为育种实践中大群体的操作带来极大的方便。
参考文献
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[11]盛宝钦，周益林，王剑雄等. 河北省和北京地区小麦白粉病菌寄主范围研究.华北农学报，1994，9(1)：101～107.
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单位：南京农业大学，农业部作物细胞遗传重点开放实验室，南京 210095
关键词：小麦；近等基因系；抗白粉病基因；RAPD标记
遗传学报000208
摘要：以256个随机引物对含小麦抗白粉病基因Pm2近等基因系进行RAPD分析，发现17个随机引物的扩增产物在抗、感NILs材料间表现多态性，且其中5个引物经4次以上重复，均获相同结果，其多态性标记分别为OPM081600、OPI041700、OPH191100、OPE09900及OPM16850。当以这5个随机引物对14个已知含Pm2基因的抗病材料及9个不含Pm2基因的感病材料进行检测时，只有标记OPI041700在12个抗病材料中出现(另两个抗病材料中未检测到)，而在9个感病材料中均未出现。进一步用OPI04对102株(Chancellor×Ulka/8*Cc)F2分离群体进行分析，估算出标记OPI041700与Pm2基因间的遗传距离为12.2±3.3cM。
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中图分类号：S512.103.4 文献标识码：A
文章编号：0379-172(2000)02-139-145
Screening and Study of RAPD Markers Tightly Linked to Wheat
Powdery Mildew Resistance Gene Pm2
LIU Jin-Yuan, TAO Wen-Jing, LIU Da-Jun, CHEN Pei-Du
(Key Open Lab of Agri, Ministry for Crop Cytogenetics, Nanjing Agri. Univ., Nanjing 210095, China)
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Abstract: The random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was made in Pm2 near杋sogenic lines (NILs) with 265 random primers.Seventeen out of the 256 tested primers amplified the polymorphic DNA in the NILs. Five of them showed the same discriminating results in more than four replications. The polymorphic bands were assigned to be OPM081600, OPI041700, OPH191100 and OPE09900, respectively. Using these five polymorphic primers to detect 14 resistant materials with Pm2 and 9 susceptible materials without Pm2, only OPI041700 was amplified in 12 of the 14 resistant materials and absent in all of the 9 susceptible materials. Further RAPD analysis of (Chancellor×Ulka/8*Cc)F2 plants by primer OPI04 indicated that the genetic distance of OPI041700 to Pm2 was 12.2±3.3cM.
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Key words: wheat; near isogenic line; powdery mildew resistance gene (Pm); RAPD marker
以DNA杂交为基础的RFLP标记是在遗传研究中应用最为广泛的分子标记之一，但由于其在小麦中的多态性水平较低，加之操作过程复杂、成本较高，并需使用放射性同位素，因而限制了它在育种实践中的广泛应用。90年代初由Welsh和Williams[1,2]两个小组同时提出的RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是近年来发展起来的一种以PCR扩增为基础的新的标记技术。它是用一系列人工合成的寡聚核苷酸单链(通常为9～10bp)为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，以揭示相应区域DNA多态性。由于可供选择的引物很多，检测区域几乎覆盖整个基因组，因而多态性水平相对较高。而且RAPD分析程序简单、周期短、所需DNA量较少、自动化程度又高，因而此技术诞生不久，就被广泛应用于遗传作图、基因定位、分子标记筛选、外源染色质检测及物种起源与进化等遗传研究[3]。在小麦中，借助NILs为材料或集群分离分析(Bulked segregate analysis)方法已分别筛选到与小麦抗黑穗病基因[4]、抗白粉病基因[5，6]等紧密连锁的RAPD标记，有的并已成功应用于辅助选择。本文报道的是我们用Briggle[7]的含Pm2基因NILs进行的RAPD分析，以及所筛选到的与Pm2基因紧密连锁的RAPD标记。
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1 材料和方法
1.1 供试植物材料
实验所用小麦近等基因系分别为Ulka/8*Cc、Idaed59/8*Cc(简称ID59/8*Cc)(Pm2)及CI12632/8*Cc(Pm2+6)。含已知Pm基因的材料有：Ulka(Pm2)； CI12632、 CI12633、TP114、 Maris Huntsman、 Maris Dove、 PI405718(Pm2+6)。以上这些材料分别来自南京农业大学细胞遗传所、江苏省农科院粮作所及中国农科院植保所。扬麦5号、扬85?5和扬158是江苏省里下河地区农科所育成并在淮南冬麦区大面积推广的高产品种(系)。扬麦5号和扬158对白粉病中感，扬85?8对白粉病高感。为提高这些品种(系)的白粉病抗性，选用携有Pm2+6抗病基因的亲本TP114与它们杂交并连续多代回交，从中选出抗病新品系扬94-43、扬95-5和扬95-76，经与Pm2基因紧密连锁分子标记检测，皆含Pm2基因，而且它们的农艺性状已接近或超过扬85-5或扬158。(Chancellor×Ulka/8*Cc)F2分离群体用于检测RAPD标记与Pm2基因间的连锁程度。
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1.2 基因组DNA提取
DNA大量提取法(CTAB法)参照Gill等[8]提供的方法，细节上略有修改。DNA微量提取法参照Guidet等[9]的方法并略加改进。
1.3 PCR反应
随机引物为美国Operon公司产品，长度皆为10bp，随机选用其中265个引物进行扩增筛选。PCR反应体积为25μl，其中含有15～20ng模板DNA，0.2μmol/L随机引物，200μmol/L每种dNTPs，1×缓冲液[10mmol/L Tris-HCl (pH8.5～9.0), 50mmol/L KCl, 2.0mmol/L MgCl20.1% Triton-100或0.01% Gelatin]， 1U Taq酶。反应于Perkin-ElmerCetus DNA Thermal Cycler仪上进行。用于引物筛选的扩增条件如下：前4个循环为96℃变性1min， 35℃复性1min， 72℃延伸2min。后45个循环为94℃变性45s， 36℃复性1min， 72℃延伸90s，最后72℃延伸10min。以引物OPI04对不同含Pm2基因材料及F2分离群体分析时所用扩增条件同上，只是复性温度提高至38℃。
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1.4 白粉病抗性接种及鉴定
采用南京和江苏扬州地区田间及温室采集到的白粉病菌混合菌种进行人工接种，在感病对照充分发病的情况下(20℃左右，7～10d)，调查记录抗、感分离情况，2～3d后重复调查1次，至抽穗期再调查1次。病级鉴定按盛宝钦[10，11]提出的反应型分级标准进行。
1.5 数据分析
根据Allard (1956)最大似然法计算重组率，并按Kosambi (1944)系数将重组率转化为CentiMorgan (cM)。
2 结果与分析
2.1 白粉病抗性基因Pm2近等基因系的RAPD分析
本研究采用265个随机引物对Chancellor及其含Pm2基因的近等基因系Ulka/8*Cc及CI12632/8*Cc进行了分析，其中绝大多数引物均能扩增出1～7条明显可辨的条带。在以265个引物进行第一次初选时，有17个引物的扩增产物在抗、感NILs材料间揭示出多态性，但在随后对此17个引物的重复实验中，只有5个引物经4次以上重复，均获相同的结果。这5个引物扩增产物的多态性可分3种类型：(1)抗病NILs中的扩增带较感病亲本多1条(图1)，如引物OPM08(5′ TCTGTTCCCC 3′)、OPI04 (CCGCCTAGTC)和OPH19(CTGACCAGCC)。它们分别在1.6kb、1.7kb、 1.1kb处多出1条特异带， 分别被标记为 OPM081600、OPI041700、OPH191100。由此推测，由于抗病基因的引入而增加了适于这类引物之结合位点，因而特异带得以出现。(2)抗病NILs中的扩增带较感病亲本少1条(图2，a)。引物OPE09(CTTCACCCGA)在感病亲本中扩增出大小约为0.9kb的特异带，标记为OPE09900，而NILs中缺少此特异扩增带。推测由于抗病基因的引入，破坏了引物在此处的结合位点，致使这一片段得不到扩增。(3)抗、感材料间扩增出的特异带位置相同，但带的强弱差异显著(图2，b)。引物OPM16(GTAACCAGCC)在抗、感材料中皆扩增出一大小约为0.85kb的扩增带，标记为OPM16850，其在感病亲本中的强度明显高于抗病NILs中的，原因可能是感病材料中，此处引物结合位点较抗病NILs中的更适于其扩增，如果提高复性温度，NILs中的这条弱带也许会消失。
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图1 引物OPM08(a)、OPI04(b)及OPH19(C)的PCR 扩增结果箭头示多态性PCR扩增片段
Fig.1 The PCR ammlification results with primer of opm08(a),OPI04(b)and OPH19(c)M1.50～2000bp ladder (BIO-RAD ),M2,λ DNA HindⅢ/EcoRI,C.Chancellor ,U Ulda/8*Cc.D,ID59/8*Cc,I CI126328/8*Cc.Arrows show the polymorphic amplification bands
图2 引物OPE09(a)、OPM16(b)的PCR扩增结果CS。中国春；C、U、I的解释见图1箭头示多态性PCR 护增片段
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Fig.2 The PCR amplification results with primer of OPE09(a)and OPM16(b)CS.Chinese Spring,C,uIsee Fig.1 Arrows show the polymorphic bands
2.2 多态性引物对Pm2基因的检测
以上述筛选出的5个随机引物，对14个已知含Pm2基因的抗病材料及9个不含Pm2基因的感病材料分别进行扩增，以验证它们在检测不同遗传背景中Pm2基因的有效性。结果发现只有标记OPI041700能在大多数抗病材料中检测到，且在所有不含Pm2基因的材料中不出现(图3)， 其余4个引物未能将不同遗传背景中的Pm2基因检测出来，这表明标记OPI041700与Pm2基因是连锁的， 而其他4个引物的特异结合位点则与Pm2基因不连锁。
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图3 引物OPI04对不同麦材料的PCR扩增检测结晶
箭头示1。7kb多态性PCR扩增片段
Fig.3 PCR amplification results to different wheat materials with primer OPI04
M1.50～2000bp ladder (BIO-RAD ,)M2.λ DNA HinⅢ/EcoRI,1.Chancellor ,2.Ulja/8*Cc.3.(Cc×Ulk8*Cc)F1,4.ID59/8*Cc,5.CI12632/8*Cc,6.(Cc×CI12632/8*Cc)F1.7.uLKA,8.ci12633,9.Maris Dove ,10TP1114,11.y
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yANGMAI158,13.Yang95-75,14.Yang 95-76.Arrow shows the 1.7kb polymorphic band
2.3 (感病轮回亲本×抗病NIL)F2分离群体的RAPD分析
为进一步探讨标记OPI041700与Pm2基因间的连锁关系，我们对Chancellor×Ulka/8*Cc杂交F2分离群体进行了RAPD分析。种植于温室中的102株F2植株，苗期以当地混合菌株接种并分两次详细记载其发病情况。其中有81株表现抗病，21株感病，经χ2测验，抗病株感病株符合31分离比例(x2＝1.059
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图4 引物OPI04对(Chancellor×Ulka/8*Cc)F2分离群体PCR 扩增检测结果箭头示1.7kb多态性PCR 扩增片段
Fig.4 PCR amplification results to (Chancellor×Ulka/8*Cc)F2 population with primer OPI104C.Chancellor ,U,Uika ,M2:λDNA HindⅢ/EcoR I,Arrow shows the 1.7kb polymorphic band
表1 F2群体白粉病抗性分离与引物OPI04扩增结果的联系
Table 1 The reationship between resistance segregation and RAPDamplification results of OPI04 in F2 generation 抗性
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Resistan
株数
有OPIO41700标记
无OPI041700标记
抗病Resistant
81
80
1
感病Susceptible
21
9
12
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由表1可知，在81株F2抗病单株中，80株含OPI041700标记，另有1株无此标记，而在21株感病个体中，无此标记的只有12株，另外9株也具此标记。感病植株中出现此标记的机率较高的原因可能与混合菌种接种而引起调查误差有关，如果以Pm2专化白粉病菌菌株接种，此误差将会大大减小。按最大似然法及Kosambi公式计算出此标记与Pm2基因间的连锁距离为12.2±3.3cM。由于“中国春”中缺少此标记，因而无法藉缺体-四体材料将此标记定位至特定染色体上。在以扩增片段PI041700为RFLP探针进行Southern杂交分析时，其杂交结果呈重复序列带型。
3 讨论
本实验所用NILs是Briggle(1969)以含Pm2基因的Ulka或CI12632为供体，Chancellor为感病轮回亲本，经7代回交及1代自交后育成，其中供体DNA所占比例理论值为(1/2)8＝1/256，按六倍体小麦基因组大小16000M计算[12]，供体DNA片段仍占41.7Mb左右。虽然NILs是在施以白粉病的选择压力下育成，其中也存在在非选择压力下通过交换保存下来的供体DNA成分，如非编码区等，它们的存在对于RAPD扩增(扩增片段一般小于4kb)来讲往往会带来假象，因而在NILs中呈多态性的标记不一定与Pm2基因连锁。我们在以265个引物进行的初选扩增中，发现有17个引物(≈6.42%)在抗、感NILs间揭示出多态性，然而在进一步检测时发现最终只有5个引物(≈1.89%)可重复获得稳定的多态性，这一结果与Dweikat et al[13]在用RAPD对不同小麦品种分析时所得出的结果一致，他们发现RAPD在任意两个小麦品种之间扩增出多态性的频率在2%左右。
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RAPD扩增对反应条件变化较敏感，特别是Taq DNA多聚酶、Mg++浓度及模板浓度。
我们发现不同来源的Taq酶、同一来源但生产批次不同的Taq酶对扩增的成败皆有显著影响。对小麦而言，模板用量以15～20ng为宜，过高则扩增产物常会出现较强的“Smear”现象。另外，由于不同的引物在模板上的结合位点数及结合的紧密程度不一，因而它们对扩增条件要求的严格程度有所不同， 针对某一特异引物应该有其最佳扩增条件。
引物OPI04对扩增条件的要求看来相对较宽，即使不同来源的Taq酶，模板的质量及数量略有变化(在一定幅度内)时，也能扩增出重复性很好的结果。而且复性温度达40℃时，仍能获得满意的结果，也就是说其稳定性和可重复性较高。虽然标记OPI041700与Pm2基因之间的连锁距离超过10cM，但它在12个遗传背景不同的已知含Pm2基因小麦材料中皆能出现(表1)、而所有检测过的9个不含Pm2基因的感病品种(系)中均无此引物的特异扩增片段。这表明它在跟踪检测Pm2基因中仍具较大应用潜力。而且如果将此标记转化为更加稳定的SCAR标记，将更方便可靠地用于辅助选择育种，这方面的工作正在进行中。
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另外，我们还比较了来自大量提取法和微量提取法模板DNA对RAPD扩增的影响，结果发现两种方法所提DNA模板对RAPD扩增基本没有影响。但微量提取法简单、快速、成本低廉，这将为育种实践中大群体的操作带来极大的方便。
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