RAPD标记构建家蚕分子连锁图
作者：李斌 鲁成 周泽扬 向仲怀
单位：西南农业大学蚕桑学农业部重点实验室，重庆 400716
关键词：随机扩增多态性DNA；家蚕；分子连锁图
遗传学报000206
摘要：以大造、C108及其F2群体构建了1个家蚕的RAPD连锁框架图，该图含RAPD标记位点182个，来自大造的103个标记分属前23个连锁群，来自C108的79个标记分属后16个连锁群，覆盖基因组的总长度为1148.3cM(centimorgan)，它能与本室用同一群体构建的SADF图谱相整合，亦可与相应的RFLP图谱相互补充。
中图分类号：S881.24 文献标识码：A
文章编号：0379-172(2000)02-127-132
, http://www.100md.com
Construction of Silkworm RAPD Molecular Linkage Map
LI Bin, LU Cheng, ZHOU Ze-Yang, XIANG Zhong-Huai
(The Key Sericultural Laboratory of Agricultural Ministry，Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China)
Abstract:In this research, a RAPD linkage map of Bombyx mori was constructed with Dazao/C108 and their F2 generation. The map consists of 182 RAPD loci, of which 103 loci come from Dazao and form the first 23 linkage groups and the other 79 loci come from C108 and form the second 16 linkage groups. This map covered a total genetic distance of over 1148.3 cM (centimorgan). It could be integrated with the SADF map of the same materials constructed in our laboratory and the corresponding RFLP linkage map.
, 百拇医药
Key words:random amplified polymorphic DNA; molecular linkage map; silkworm (Bombyx mori)
自Goldsmith等于1991年提出国际蚕分子育种计划以来[1]，家蚕分子连锁图的构建相继在各国展开。Goldsmith等率先建成了以P50和C108为亲本的家蚕RFLPs图谱[2，3]。因家蚕可用探针数少，此项工作受到了限制。于是随机引物扩增多态性DNA(RAPD)技术进入了家蚕作图工作。如Promboon等以P50和C108为亲本构建了159个标记的家蚕RAPD图谱(其中含1个形态标记)[4]，而家蚕自田中义磨(1913)发现了蚕的连锁遗传以来，历经80余年研究，现已发现和研究了440多个基因，确定了27个连锁群，定位了220多个位点和300多个基因[5]。为进一步完善与丰富家蚕分子连锁图，建立与常规遗传图谱的对应关系，以推进家蚕种质资源、遗传育种及基因克隆等研究，我们应用RAPD标记，构建了182个标记于连锁图上。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 家蚕材料 大造、C108、大造杂交C108的F1代以及104个F2代个体，为西南农业大学家蚕基因库提供。
1.1.2 主要试剂 Taq酶和dNTPs来自Promega公司，Primers 购自Operon公司。
1.2 方法
1.2.1 家蚕基因组DNA的制备 参照稍做改进的Maniatis的方法进行[6]。
1.2.2 RAPD扩增 RAPD扩增反应参照Williams[7]和夏庆友[8]的方法并略加调整，RAPD反应体系(25μl)含有100mmol/L Tris-Cl pH 8.3, 500mmol/L KCl, 1% Triton X-100, 2.0mmol/L MgCl2, dATP、 dTTP、dCTP和dGTP各为0.2mmol/L，随机引物0.2μmol/L，10～20ng模板DNA，1U Taq DNA聚合酶。反应扩增条件为94℃变性30s，40℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环之后接着72℃ 7min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测分析。
, 百拇医药
1.2.3 连锁分析 根据RAPD扩增电泳结果，将每个F2个体的电泳带型按亲本类型归类，与大造带型相同者赋值为1，与C108带型相同者赋值为2，带型不清或数据缺失者赋值为0，然后将数据输入计算机进行分析。计算机连锁分析采用MAPMAKER/Exp (Version3.0b)软件[9]，具体分析参照Promboon等的方法[4]。
2 结果分析
2.1 亲本的RAPD多态性分析
用425个GC含量为60%～70%的RAPD引物分别在大造、C108两亲本和大造×C108的F1间进行多态性筛选扩增(图1)，其中有137个引物586个位点在两亲本间表现多态性，随后用这137个具有多态性的引物分别对104个F2个体进行RAPD扩增，其中69个F2个体获得稳定、较好的扩增结果，以此确定其个体的表型，586个多态性扩增位点的片段大小在0.2kb～2.5kb之间，引物扩增多态性片段数在1～11条，平均为4.3条。
, http://www.100md.com
图1 在家蚕C108与大造间筛选多态性标记
Fig.1 Selection of polymorphic fragment between c108 and Dazao strains M.size marker ;C,C108;D Dazao;F1.(D×C)F2(D×C);M.Size marker
本研究RAPD引物在大造和C108间扩增多态性的比例为32.3%(425个引物中有137个引物可扩增出多态性片段)，高于已报道的水稻间的20%[10]，桃树间的16%[11]，与Promboon等所作的家蚕间的34.3%[4]接近。可利用引物率高对家蚕分子图谱的构建显得较为有利，可定位出更多的多态性位点。同时本研究中每个引物平均扩增片段数为11.7条，高于类似的RAPD研究中的平均扩增带数，如陈洪等使用1.6mmol/L的游离Mg2+在水稻中平均得到3.6条扩增片段[10]，在鱼类研究中得到平均扩增片段5.4条[12]，Majid等使用4.5mmol/L的游离的Mg2+在番茄中平均得到6.5条扩增片段[13]。Mg2+浓度较高的反应系可扩增出较多的片段，而我们采用了较为严谨的Mg2+浓度(2mmol/L)，说明本研究中平均扩增片段数较多与家蚕基因组特性有关。
, http://www.100md.com
2.2 F2群体中RAPD标记的分离
我们对RAPD分析数据进行卡平方(x2)测验，在5%水平上发现本研究中470个标记(占总标记数的80.2%)符合31的分离比率，显示孟德尔遗传。发生偏离的标记为19.8%，与类似RAPD研究中的偏离水平基本相当。图2显示了引物OPF02的RAPD扩增片段在F2代中的分离情况。
图2 引物OPF02的RAPD 片段在F2代中的分离
C.C108;.大造;F1与F2(D×C);M Size marker
Fig.2 The segregation of RAPD fragments amplified with primer OPF02 in the F2 generation C.C108 D.Dazao;F1(D×C)F2(D×C);M Size marker
, http://www.100md.com
2.3 连锁图构建
构建连锁图时，首先确定RAPD标记所属连锁群及其位点序列，校正类型错误并计算其图距，利用MAPMAKER/Exp(Version3.0b)软件设置最小Lod值为3.0，将470个RAPD标记分成39个连锁群，来自大造的103个标记分属前23个连锁群，来自C108的79个标记分属后16个连锁群，不连锁标记288个，由此构建家蚕RAPD分子连锁图，如图3所示。我们根据RAPD标记来源不同，将其划分为两大类，来自大造的每个连锁群包含2～24个标记，平均每个连锁群4.5个标记，其中第4连锁群位点较多，它可进一步分为4a与4b两个连锁群，连锁群长度在13.8～163.6cM，连锁群总长度1192.5cM，平均每个连锁群长度为49.7cM，两标记间平均图距为11.6cM；来自C108的每个连锁群包含2～12个标记，平均每个连锁群4.9个标记，连锁群长度在6.2～235.2cM，连锁群总长度1104.2cM，平均每个连锁群长度为69.0cM，两标记间平均图距为14.0cM。框架图中各连锁群位点分布较为均匀，基本体现了RAPD标记在基因组中分布的随机性与均匀性。
, 百拇医药
图3 家蚕的RAPD图谱
Fig,3 Silkworm RAPD map
3 讨论
家蚕与其他脊椎动物不同，具有雌完全连锁的特性，因而将导致以下问题出现：即当两标记处于互斥状态时，我们不能确定遗传连锁的序列。如X-y/x-Y即为互斥，此时X与Y彼此连锁，x与y是X与Y各自的隐性等位基因，因为x与y不能同时在F2个体中出现，于是我们不能计算其重组值，因此在互斥时不能确定RAPD标记的位点序列，利用MAPMAKER不能很好地将来自不同亲本的RAPD标记调整到同一连锁群中。但处于互斥状态的标记，定然会有连锁的情形，而分开计算可能将本应连锁的部分标记处理为不连锁，这也许可能是不连锁位点较多的一个原因。
目前各研究小组用于作图的群体大小因物种及材料配制的不同而有较大差异，如水
, http://www.100md.com
稻RAPD图谱用了52个DH株系[10]，水稻RFLP图谱用了58个DH株系[14]和81个DH株系[15]，香蕉图谱RAPD标记来自89个F2个体，RFLP标记来自82个F2个体[16]，本研究中F2群体经137个引物扩增后，选择其结果稳定性较高的个体69个，占104个F-群体的66.3%，而另外35个F2个体扩增重复性较差，原因可能是：第一，DNA在反复抽提过程中被随机剪切，导致引物结合位点改变，因而扩增结果不够理想：第二，随机引物扩增多态性DNA引物与模板DNA结合位点是随机的，因而特异性降低，稳定性较差，故这部分未纳入图谱的构建，因此构图群体为69个F2个体，鉴于RAPD标记是显性标记，且家蚕具雌完全连锁特性，所用群体的个体数略微偏小，但实验中严格控制扩增反应，并严格地筛选了扩增稳定性较好的多态性标记，从而提高了结果的可靠性，同时国际上虽已有高密度家蚕分子连锁图的构建，但尚未在正式学术刊物上报道，该框架图的构建为后继的育种及克隆等研究奠定了基础，同时该图与本实验室用SADF法构建的图谱使用了同一亲本与F2群体，故这两个图谱可相互整合，亦可与相应的RFLPs图谱整合，使其更加丰富和充实，更好地推动蚕分子育种计划。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Goldsmith M R. The Bombyx Genome Mapping Project. In sericologia, 1991, 31(suppl.), 24~25.
[2]Goldsmith M R, Shi J. Amolecular map for the silkworm: constructing new links between basic and applied research. American Chemical Society Symposium Serics, 1994, 544:45～48.
[3]Shi J, Heckel D G, Goldsmith M R. A genetic linkage map for the domesticated silkworm, Bombyx mori, based on RFLPs. Genet. Res. Camb., 1995, 66:109～126.
, 百拇医药
[4]Promboon A, Shimada T, Fujiwara H et al. Linkage map of RAPDs in the silkworm, Bombyx mori. Genet. Res. Camb., 1995, 66:1～7.
[5]鲁 成. 家蚕突变基因研究. 西南农业大学博士学位论文，1995.
[6]Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al. Molecular Cloning A Laboratory Mannal. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. N Y, 1989, 463～466.
[7]Williams J G K, Kubelik A R, Kivak K J et al. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 1990, 18:6531～6535.
, 百拇医药
[8]夏庆友. 家蚕分子系统学和基因分子标记研究. 西南农业大学博士学位论文. 1996.
[9]Lander E S, Green P, Abrahamson J. Mapmaker: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural population. Genomics, 1987, 1:174～181.
[10]陈 洪，朱立煌，徐吉臣等. RAPD标记构建水稻分子连锁图. 植物学报，1995，37(9)：677～684.
[11]Chaparro J X, Werner D J, Malley D et al. Targeted mapping and linkage analysis of morphological isozyme, and RAPD markers in peach. TAG, 1994, 87:805～815.
, 百拇医药
[12]陈 洪， 杨 靖，薛国雄等. RAPD技术在异精激发方正银鲫比较研究中的应用. 科学通报，1994，39：661～663.
[13]Majid R F, Richard A J, Raymond L R. RAPD markers for constructing intraspecific tomato genetic map. Plant Cell Rep., 1993, 12:293～297.
[14]徐吉臣，朱立煌，陈 英等. 用双单倍体群体构建水稻的分子连锁图. 遗传学报，1994，21(3)：205～214.
[15]李 平，朱立煌，周开达等. 利用分子标记和水稻籼粳交双单倍体群体进行作图研究. 植物学报，1996，38(11)：881～886.
[16]Faure S, Noyer J L, Horry J P et al. A molecular marker-based linkage map of diploid bananas (Musa acuminata). TAG, 1993, 87:517～526., 百拇医药
单位：西南农业大学蚕桑学农业部重点实验室，重庆 400716
关键词：随机扩增多态性DNA；家蚕；分子连锁图
遗传学报000206
摘要：以大造、C108及其F2群体构建了1个家蚕的RAPD连锁框架图，该图含RAPD标记位点182个，来自大造的103个标记分属前23个连锁群，来自C108的79个标记分属后16个连锁群，覆盖基因组的总长度为1148.3cM(centimorgan)，它能与本室用同一群体构建的SADF图谱相整合，亦可与相应的RFLP图谱相互补充。
中图分类号：S881.24 文献标识码：A
文章编号：0379-172(2000)02-127-132
, http://www.100md.com
Construction of Silkworm RAPD Molecular Linkage Map
LI Bin, LU Cheng, ZHOU Ze-Yang, XIANG Zhong-Huai
(The Key Sericultural Laboratory of Agricultural Ministry，Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China)
Abstract:In this research, a RAPD linkage map of Bombyx mori was constructed with Dazao/C108 and their F2 generation. The map consists of 182 RAPD loci, of which 103 loci come from Dazao and form the first 23 linkage groups and the other 79 loci come from C108 and form the second 16 linkage groups. This map covered a total genetic distance of over 1148.3 cM (centimorgan). It could be integrated with the SADF map of the same materials constructed in our laboratory and the corresponding RFLP linkage map.
, 百拇医药
Key words:random amplified polymorphic DNA; molecular linkage map; silkworm (Bombyx mori)
自Goldsmith等于1991年提出国际蚕分子育种计划以来[1]，家蚕分子连锁图的构建相继在各国展开。Goldsmith等率先建成了以P50和C108为亲本的家蚕RFLPs图谱[2，3]。因家蚕可用探针数少，此项工作受到了限制。于是随机引物扩增多态性DNA(RAPD)技术进入了家蚕作图工作。如Promboon等以P50和C108为亲本构建了159个标记的家蚕RAPD图谱(其中含1个形态标记)[4]，而家蚕自田中义磨(1913)发现了蚕的连锁遗传以来，历经80余年研究，现已发现和研究了440多个基因，确定了27个连锁群，定位了220多个位点和300多个基因[5]。为进一步完善与丰富家蚕分子连锁图，建立与常规遗传图谱的对应关系，以推进家蚕种质资源、遗传育种及基因克隆等研究，我们应用RAPD标记，构建了182个标记于连锁图上。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 家蚕材料 大造、C108、大造杂交C108的F1代以及104个F2代个体，为西南农业大学家蚕基因库提供。
1.1.2 主要试剂 Taq酶和dNTPs来自Promega公司，Primers 购自Operon公司。
1.2 方法
1.2.1 家蚕基因组DNA的制备 参照稍做改进的Maniatis的方法进行[6]。
1.2.2 RAPD扩增 RAPD扩增反应参照Williams[7]和夏庆友[8]的方法并略加调整，RAPD反应体系(25μl)含有100mmol/L Tris-Cl pH 8.3, 500mmol/L KCl, 1% Triton X-100, 2.0mmol/L MgCl2, dATP、 dTTP、dCTP和dGTP各为0.2mmol/L，随机引物0.2μmol/L，10～20ng模板DNA，1U Taq DNA聚合酶。反应扩增条件为94℃变性30s，40℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环之后接着72℃ 7min。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测分析。
, 百拇医药
1.2.3 连锁分析 根据RAPD扩增电泳结果，将每个F2个体的电泳带型按亲本类型归类，与大造带型相同者赋值为1，与C108带型相同者赋值为2，带型不清或数据缺失者赋值为0，然后将数据输入计算机进行分析。计算机连锁分析采用MAPMAKER/Exp (Version3.0b)软件[9]，具体分析参照Promboon等的方法[4]。
2 结果分析
2.1 亲本的RAPD多态性分析
用425个GC含量为60%～70%的RAPD引物分别在大造、C108两亲本和大造×C108的F1间进行多态性筛选扩增(图1)，其中有137个引物586个位点在两亲本间表现多态性，随后用这137个具有多态性的引物分别对104个F2个体进行RAPD扩增，其中69个F2个体获得稳定、较好的扩增结果，以此确定其个体的表型，586个多态性扩增位点的片段大小在0.2kb～2.5kb之间，引物扩增多态性片段数在1～11条，平均为4.3条。
, http://www.100md.com
图1 在家蚕C108与大造间筛选多态性标记
Fig.1 Selection of polymorphic fragment between c108 and Dazao strains M.size marker ;C,C108;D Dazao;F1.(D×C)F2(D×C);M.Size marker
本研究RAPD引物在大造和C108间扩增多态性的比例为32.3%(425个引物中有137个引物可扩增出多态性片段)，高于已报道的水稻间的20%[10]，桃树间的16%[11]，与Promboon等所作的家蚕间的34.3%[4]接近。可利用引物率高对家蚕分子图谱的构建显得较为有利，可定位出更多的多态性位点。同时本研究中每个引物平均扩增片段数为11.7条，高于类似的RAPD研究中的平均扩增带数，如陈洪等使用1.6mmol/L的游离Mg2+在水稻中平均得到3.6条扩增片段[10]，在鱼类研究中得到平均扩增片段5.4条[12]，Majid等使用4.5mmol/L的游离的Mg2+在番茄中平均得到6.5条扩增片段[13]。Mg2+浓度较高的反应系可扩增出较多的片段，而我们采用了较为严谨的Mg2+浓度(2mmol/L)，说明本研究中平均扩增片段数较多与家蚕基因组特性有关。
, http://www.100md.com
2.2 F2群体中RAPD标记的分离
我们对RAPD分析数据进行卡平方(x2)测验，在5%水平上发现本研究中470个标记(占总标记数的80.2%)符合31的分离比率，显示孟德尔遗传。发生偏离的标记为19.8%，与类似RAPD研究中的偏离水平基本相当。图2显示了引物OPF02的RAPD扩增片段在F2代中的分离情况。
图2 引物OPF02的RAPD 片段在F2代中的分离
C.C108;.大造;F1与F2(D×C);M Size marker
Fig.2 The segregation of RAPD fragments amplified with primer OPF02 in the F2 generation C.C108 D.Dazao;F1(D×C)F2(D×C);M Size marker
, http://www.100md.com
2.3 连锁图构建
构建连锁图时，首先确定RAPD标记所属连锁群及其位点序列，校正类型错误并计算其图距，利用MAPMAKER/Exp(Version3.0b)软件设置最小Lod值为3.0，将470个RAPD标记分成39个连锁群，来自大造的103个标记分属前23个连锁群，来自C108的79个标记分属后16个连锁群，不连锁标记288个，由此构建家蚕RAPD分子连锁图，如图3所示。我们根据RAPD标记来源不同，将其划分为两大类，来自大造的每个连锁群包含2～24个标记，平均每个连锁群4.5个标记，其中第4连锁群位点较多，它可进一步分为4a与4b两个连锁群，连锁群长度在13.8～163.6cM，连锁群总长度1192.5cM，平均每个连锁群长度为49.7cM，两标记间平均图距为11.6cM；来自C108的每个连锁群包含2～12个标记，平均每个连锁群4.9个标记，连锁群长度在6.2～235.2cM，连锁群总长度1104.2cM，平均每个连锁群长度为69.0cM，两标记间平均图距为14.0cM。框架图中各连锁群位点分布较为均匀，基本体现了RAPD标记在基因组中分布的随机性与均匀性。
, 百拇医药
图3 家蚕的RAPD图谱
Fig,3 Silkworm RAPD map
3 讨论
家蚕与其他脊椎动物不同，具有雌完全连锁的特性，因而将导致以下问题出现：即当两标记处于互斥状态时，我们不能确定遗传连锁的序列。如X-y/x-Y即为互斥，此时X与Y彼此连锁，x与y是X与Y各自的隐性等位基因，因为x与y不能同时在F2个体中出现，于是我们不能计算其重组值，因此在互斥时不能确定RAPD标记的位点序列，利用MAPMAKER不能很好地将来自不同亲本的RAPD标记调整到同一连锁群中。但处于互斥状态的标记，定然会有连锁的情形，而分开计算可能将本应连锁的部分标记处理为不连锁，这也许可能是不连锁位点较多的一个原因。
目前各研究小组用于作图的群体大小因物种及材料配制的不同而有较大差异，如水
, http://www.100md.com
稻RAPD图谱用了52个DH株系[10]，水稻RFLP图谱用了58个DH株系[14]和81个DH株系[15]，香蕉图谱RAPD标记来自89个F2个体，RFLP标记来自82个F2个体[16]，本研究中F2群体经137个引物扩增后，选择其结果稳定性较高的个体69个，占104个F-群体的66.3%，而另外35个F2个体扩增重复性较差，原因可能是：第一，DNA在反复抽提过程中被随机剪切，导致引物结合位点改变，因而扩增结果不够理想：第二，随机引物扩增多态性DNA引物与模板DNA结合位点是随机的，因而特异性降低，稳定性较差，故这部分未纳入图谱的构建，因此构图群体为69个F2个体，鉴于RAPD标记是显性标记，且家蚕具雌完全连锁特性，所用群体的个体数略微偏小，但实验中严格控制扩增反应，并严格地筛选了扩增稳定性较好的多态性标记，从而提高了结果的可靠性，同时国际上虽已有高密度家蚕分子连锁图的构建，但尚未在正式学术刊物上报道，该框架图的构建为后继的育种及克隆等研究奠定了基础，同时该图与本实验室用SADF法构建的图谱使用了同一亲本与F2群体，故这两个图谱可相互整合，亦可与相应的RFLPs图谱整合，使其更加丰富和充实，更好地推动蚕分子育种计划。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Goldsmith M R. The Bombyx Genome Mapping Project. In sericologia, 1991, 31(suppl.), 24~25.
[2]Goldsmith M R, Shi J. Amolecular map for the silkworm: constructing new links between basic and applied research. American Chemical Society Symposium Serics, 1994, 544:45～48.
[3]Shi J, Heckel D G, Goldsmith M R. A genetic linkage map for the domesticated silkworm, Bombyx mori, based on RFLPs. Genet. Res. Camb., 1995, 66:109～126.
, 百拇医药
[4]Promboon A, Shimada T, Fujiwara H et al. Linkage map of RAPDs in the silkworm, Bombyx mori. Genet. Res. Camb., 1995, 66:1～7.
[5]鲁 成. 家蚕突变基因研究. 西南农业大学博士学位论文，1995.
[6]Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al. Molecular Cloning A Laboratory Mannal. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. N Y, 1989, 463～466.
[7]Williams J G K, Kubelik A R, Kivak K J et al. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 1990, 18:6531～6535.
, 百拇医药
[8]夏庆友. 家蚕分子系统学和基因分子标记研究. 西南农业大学博士学位论文. 1996.
[9]Lander E S, Green P, Abrahamson J. Mapmaker: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural population. Genomics, 1987, 1:174～181.
[10]陈 洪，朱立煌，徐吉臣等. RAPD标记构建水稻分子连锁图. 植物学报，1995，37(9)：677～684.
[11]Chaparro J X, Werner D J, Malley D et al. Targeted mapping and linkage analysis of morphological isozyme, and RAPD markers in peach. TAG, 1994, 87:805～815.
, 百拇医药
[12]陈 洪， 杨 靖，薛国雄等. RAPD技术在异精激发方正银鲫比较研究中的应用. 科学通报，1994，39：661～663.
[13]Majid R F, Richard A J, Raymond L R. RAPD markers for constructing intraspecific tomato genetic map. Plant Cell Rep., 1993, 12:293～297.
[14]徐吉臣，朱立煌，陈 英等. 用双单倍体群体构建水稻的分子连锁图. 遗传学报，1994，21(3)：205～214.
[15]李 平，朱立煌，周开达等. 利用分子标记和水稻籼粳交双单倍体群体进行作图研究. 植物学报，1996，38(11)：881～886.
[16]Faure S, Noyer J L, Horry J P et al. A molecular marker-based linkage map of diploid bananas (Musa acuminata). TAG, 1993, 87:517～526., 百拇医药