Nodal基因5′末端侧翼序列抑制子的分析
作者：胡新立 周迅蕾
单位：北京大学生命科学学院，北京 100871
关键词：Nodal基因；表达调控；启动子；抑制序列
遗传学报000202
摘要：Nodal基因属于TGF-β超家族。它在小鼠原肠期的原条形成过程中起重要作用。Nodal基因的缺失导致中胚层不能形成。使小鼠死亡。用一系列含有Nodal基因5′侧翼序列其缺失体的荧光素酶报告基因质粒瞬时转化F9细胞。通过分析这些报告基因质粒的荧光素酶活性，在转录起始点上游的1kb处的EcoRⅠ附近找到一个抑制子元件。该抑制子元件的核心部分位于EcoRⅠ位点下游约200bp处，它几乎可以完全抑制Nodal基因启动子的活性。但对于SV40启动子没有影响。在不同的细胞种类中它的作用不同，在CHO细胞中它具有增强活性。
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中图分类号：Q789 文献标识码：A
文章编号：0379-172(2000)02-101-107
Analysis of a Suppressor Element of Mouse Nodal
Gene in Its 5′ Flanking Sequences
HU Xin-Li, ZHOU Xun-Lei
(College of Life Sciences, Department of Cell Biology and Genetics, Peking University,Beijing 100871, China)
Abstract: Nodal gene is a member of the TGF-β superfamily. It is required for the formation of the primitive streak during mouse gastrulation. Mice without Nodal gene will die due to the lack of mesoderm formation. F9 cells were transiently transfected with a series of luciferase reporter constructs containing the subcones of Nodal 5′filanking sequences and their deletions. By analyzing the luciferase activity of these constructs, a suppressor element was determined at about 1kb up stream the transcription initiation site, around an EcoRⅠ site. Its centrol part was located at sbout 100bp downstream of that EcoRⅠ site. It could almost totally, suppress the Nodal gene promoter activity, though it had no effect on SV40 promoter. It behaved differently in different cell lines. In CHO cells, it had an activation activity.
, 百拇医药
Key words: Nodal gene; expression regulation; promoter; suppessor element
Nodal基因[1]首先在5.5d的小鼠胚中表达[2]，此时正是胚胎的原条开始形成的时候，随后它的表达集中原条前端的原结附近，这个区域相应鸡胚亨氏结与爪蟾的背唇，这些结构对于中胚层的发生起组织者作用。在第8.5d随着原结的消失，在鼠胚中不能再检测到Nodal基因mRNA的表达。而且Nodal基因编码的蛋白质是一种分泌型的信号分子，属于TGF-β超家族。由此推测，Nodal基因是一个在胚胎早期发育中中胚层发生以及其后的体轴形成过程中起重要作用的基因。
Nodal基因失活的纯合小鼠4.3d在原肠胚发育过程中，胚胎外层和胚外外胚层过度增殖，而没有中胚的形成，导致胚早期死亡[3，4]。
, 百拇医药
Nodal基因还可能对小鼠发育早期左右体轴的形成和左右不对称结构的发生起决定作用[5，6]。
已知Nodal基因的表达具有严格的时空限制，研究它的表达调控有助于我们认识和分析胚胎发生过程中中胚层的诱导分化和体轴形成的分子机制。
本文对Nodal基因侧翼序列的各亚克隆及缺体进行了分析。以荧光素酶为报告的基因的质粒瞬时转化F9和其他一些细胞，找到Nodal基因的5′末端的某些顺式调控元件。
1 材料和方法
1.1质粒构建Nodal基因的侧翼序列用适当限制性内切酶酶切后克隆入pBluescriptKS(图1)制备克隆。本研究中所用的表达载体为pGL2-B(promega)，简称为B。pGL2-B上没有启动子和增强子，只有荧光素酶报告基因(图2)。为了制作系列缺失体的需要，将pGL2-B多克隆位点中XhoⅠ酶切位点消除。用XhoⅠ酶切，再用Klenow处理，填平粘性末端；最后用连接酶连接。经过上述改造得到的载体称为pGL2-Bx，简称为Bx。选择适当的酶切位点将基因组及其侧翼DNA各片段从pBluescript质粒切下，克隆到表达载体pGL2-Bx的荧光素酶报告基因前面。克隆后进行系列缺失体构建，即以绿豆核酸酶取代SI核酸酶，省去SI酶切后的Klenow处理，直接用T4 DNA连接酶将缺失后的DNA连接起来，形成缺失本，转化感受态大肠杆菌DH10。
, 百拇医药
图1 Nodal 基因侧翼序列的各亚克隆的图谱
Fig.1 The subclones of the flanking sequences of Nodal gene
图2 PGL2-B质粒图谱
Fig，2 PLASMID OF pGL2-B
1.2细胞培养F9畸胎瘤细胞(由中国科学遗传研究所蒋耀青教授实验室提供)及ES
细胞(本实验室建立的MESPU-13)均使用DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，补以20%的新生牛血清(天津生化制品厂)培养。CHO、HeLa、STO及小鼠胚胎原代成纤维细胞(均由本实验室提供)以DMEM培养基，补以10%新生牛血清培养。所有细胞均培养在5%CO2，37℃培养箱中，根据其生化情况，按一定比例隔天传代一次。
, 百拇医药
1.3DNA转化用脂质体法转化细胞(LipofectminTM，GIBCOBRL)，转化前一天接种适量的细胞，用等量的质粒DNA转化细胞。每次转化都共转化含有SV40启动子和半乳糖苷酶的pSV-βgal质粒(Promega)作为检测转化效率的内源对照。转化后48h，用PBS将细胞洗两次，加入100ml细胞裂解液(Promega)，于室温下放置15min将细胞裂解。将细胞裂解液移入0.5ml的Eppendorf管，存于液氮中待测活性。
将2μl细胞裂解液及50μl荧光系酶底物在0.5μl的Eppendorf管内混匀，置于液闪计数器测定荧光酶活性，以CPM来表示。用96孔板测β-半乳糖苷活性.在每个孔中加入50μl细胞裂解液和50μl2 ×Assay Buffer(Promega)，在37℃下保温30min后，用150lμ1mol/L的Na2CO3终止反应置酶标仪上，于420nm处读取光吸收值，以ρ表示。
, 百拇医药
以共转化的β-半乳糖苷酶的活性(β)作为内源对照，以
/β为系数(以每次转化的β-半乳糖苷酶活性的平均值),比较各组在转化效率相同时荧光素酶活性的相互关系,即比较CMP1/2/β值的平均值。以没有任何插入片段时pGL2-P的荧光素酶活性增加的倍数，即荧光素酶的相对活性RLUC。RLUC反应是荧光素酶基因表达的相对水平。
1.4DNA序列测定 T7 DNA聚合酶序列测定试剂盒购自Phamacia公司，实验方法按试剂盒中提供的程序进行反应。
2 结果
2.1BNH 0.4和BNR 1.0质粒的构建
, 百拇医药
用KpnⅠ+SacⅠ分别从pBSNH 0.4质粒和pBSNR1.0质粒的多克隆位点中分离出含有NH 0.4和NE1.0片段的KS 0.4和KS1.0片段，然后将它们分别克隆到pGLZ-B载体的相应位点中，得到BNH 0.4质粒和BNR1.0质粒。
2.2NR1.0亚克隆片段缺失体的构建(图3)
图3 抑制子子元件各缺失体示意图
Nodal 基因；——不含抑制子的缺失体部分；——含抑制子的缺失体部分
Fig,3The indicative figure of various size deletion of suppressorNodal gene ;——The part of deltion without the rpressor ;——The part of deletion with the repressor
, 百拇医药
同样用KpnⅠ+SacⅠ从pBSNR1.0质粒中分离出NR1.0片段，再次克隆到pGL2-Bx载体的相应位点上。然后，以KpnⅠ酶切该质粒，产生3′凸出末端来保护载体骨架，用XhoⅠ酶切，产生5′凸出末端。 用外切酶Ⅲ在25℃条件下酶切1、2、3、4和5min后，得到插入片段长度分别还是950bp、880bp、800bp、700bp、600bp和520bp的缺失体，分别称为Bx1.0D-1、Bx1.0D-2、Bx1.0D-3、Bx1.0D-4、和Bx1.0D-5(图3)。用SmaⅠ+SacⅠ双酶切，游离出插入片段，其电泳结果见图4。
图4 BXNR1。0及其缺失片段酶切谱
BXNR 1。0经Smal I+SacI双酶切；λDNA/Bst EII ;2.BxNR1.0 3.BxNR1.0D-2; 5.BxNR1.0D-3; 6.BxNR1.0D-4
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Fig.4 The electrophoresis of the nested deletions of BxNR 1.0 The reporter constructs were digested with Smal Iand Sac I;1.λDNA/Bst EII ;2.BxNR1.0 3.BxNR1.0D-2; 5.BxNR1.0D-3; 6.BxNR1.0D-4
2.3NR1.0系列缺失体及其对荧光素酶转录活性影响
将BNH0.4和BNR1.0及其各缺失体转化F9细胞。经校正转化效率之后，比较各报告基因质粒与pGL2-B载体本身的荧光素酶活性。BNR1.0、Bx1.0D-1和Bx1.0D-2较pGL2-B活性有所降低。这3个报告基因质粒中所含插入片段有抑制子元件存在。BNR1.0的酶活性与没有启动子的pGL2-B接近，表明其中片段具有最强的抑制作用。缺失至260bp后，报告基因活性与BNH0.4没有差别，Bx1.0D-3、Bx1.0D-4、Bx1.0D-5的活性分别是BNH0.4的1.08、1.01和1.10倍。上述结果表明，NR1.0片段中有一个抑制子元件在EcoRⅠ位点下游约200bp，这个抑制子元件对Nodal基因的增强子有很强的抑制作用(图5)。
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图5 抑制序列及其各缺失体对荧光素酶转录活性的效应
PGL2-B质粒的荧光素酶转录活性作为对照
Fig.5 The luciferase activity of the reporter constructs constructs containing the repressor element and its deletions The luciferase activity of PGL-2B as control
2.4 NR1.0片段5′末端EcoRⅠ下游区DNA测序
以5′-TGTATCTTATGGTCTGTAACTG-3′为测序引物测定EcoRⅠ下游约450bp的序列(图6)。
, 百拇医药
图6 抑制序列部分测序结果(图中：…表示可出现茎环结构的区域)
Fig.6 The DNA sequence of part of the repressor element (In the figure …indicates the possible stem-loop structure of the sequence)
2.5抑制子元件细胞种类特异性分析
用BNR1.0分别转化F9、ES、CHO、HeLa、ME(胚胎原代成纤维细胞)和STO细胞来鉴
定抑制子元件的作用是否具有细胞种类的特异性。结果如图7所示：抑制序列只F9和ES细胞中表现抑制作用，它们的RLUC值低于NH0.4。在HeLa、STO和ME细胞中不表现出抑制作用，而在CHO细胞中显示微弱的增强作用，因为它的RLUC值高于NH0.4。同时用BNH0.4分别转化以上各细胞作为对照，因为启动子元件存在于NH0.4片段中(将在另一篇论文中发表)。
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图7 基本启动子元件及抑制序列细胞中种类特异性示意图
Fig,7 The indicative figure of the cell type specificity of the basic promotor element and repressor sequence
3 讨论
在5′侧翼序列中所找到的抑制子序列中，有两茎环结构出现。茎环结构的出现是存
在调控元件的一个重要特征，这种结构可能有利于反式因子与它们所识别的顺式元件的结合[7]，而且确实是一些蛋白质因子识别的结合位点[8]。在抑制子元件中，可形成茎环结构序列中包含Mye和Ebox反式因子识别位点。这两个茎环结构中一个在第一个缺失点(1.0D-1)之前，另一个在第二个和第三个缺失点(1.0D-2和1.0D-3)之间。这似乎与各种缺失体的抑制活性的变化相关，抑制活性下降很可能是由于缺失造成茎环结构的破坏所致。这段序列的功能将是今后深入开展工作的一个要点。
, 百拇医药
抑制序列表现了细胞的特异性，只在F9和ES细胞中表现抑制作用。这与1995年Hewitt实验室WT1的抑制序列工作所得结果相似[9]。现在普遍认为，顺式元件的组织或细胞特异性不是绝对的，因为有些顺式元件可以与多个不同的反式因子结合，结合后才能决定其抑制或增加效应。其次，与之结合的反式因子的作用也是绝对的抑制或增强作用，因为这种作用还受到与启动子结合的反式因子的影响。例如NR1.0中抑制序列只对基因的启动子有抑制作用，而对SV40的启动子则表现出很弱的增强作用。在发现的负调控元件中，有一些是可以对不同的启动子都起抑制作用[10～12]。在很多情况下，细胞不具备与这段保守序列结合的反式因子，这时，这段保守序列就不表现调控活性。特别是ES细胞和F9细胞属于胚性细胞，而其他几种细胞是已分化的细胞，它们所具有的反式因子的种类和数量不会相同，这必然会影响到顺式元件的功能。
参考文献
[1]Zhou X, Sasaki H, lowe L et al. Nodal is a novel TGF-β-like gene expressed in the mouse node during gastrulation. Nature., 993.361:543～547.
, http://www.100md.com
[2]Conlon F K, lyons M, Tanaesu N et al. A primary requirement for nodal in the formation and maintenance of the primitive streak in the mouse. Development., 1994, 120:1919～1928.
[3]Conlon F L, Barth K S, Robertson E J. A novel retrovirally induced embryonic lethal mutation in the mouse: assessment of the developmental fate of embryonic stem cells homozygous for the 413-d previral insertion. Development., 1991, 111:969～981.
[4]Iannaccone P M, Zhou X, Khoukha M et al. Insertional mutation of a gene involves of a gene in growth regulation of the early mouse embryo. Development Dynamics., 1992, 194:198～208.
, 百拇医药
[5]Collignon J, Varlet I, Robertson F J. Relationship between asymmetric nodal expression and the direction of embryonic turning. Nature., 1996, 381:155～158.
[6]Lowe L A, Sampath S K, Okoyama T Y et al. Concerved left-right asymmetry of nodal expression and alterations in murine situs inversus. Nature., 1996. 381:158～161.
[7]Lee-huang S, Lin J J, Kung H et al. The 3′ flanking region of the human arythropoietin-encoding gene contains nitrogen-regulatory/oxyen-sensing consensus sequences and tissue-specific transcriptional regulatory element. Gene., 1993, 137:203～210.
, 百拇医药
[8]Lehninger A J, Nelson N L, Cox M M. Principles of Biochemistry (2nd edition). Worth Publishers. Tnc, 1993.
[9]Hewitt S M, Fraiacr G C, Saunders G F. Transcriptional silencer of the Wilms’ tumor gene WTI contains an Alu repeat. J. Biol. Chen., 1995, 270:17908～17912.
[10]Wioto A, Baltimmore D. π ρ Lineage-specific expression of the π T cell receptor gene by nearby silencer.Cell., 1989, 59:649～655.
[11]Cao S X, Gutman P D, Dave H P G. Identification of a transcriptional silencer in the 5′-flanking region of the human ε-globin gene. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:5306～5309.
[12]Berg P E, Williama D H, Qian R-L et al. A common protein binds to two silencers 5′ to human β-globin gene. Nuc. Acid. Res., 1989 17:8833～8852., 百拇医药
单位：北京大学生命科学学院，北京 100871
关键词：Nodal基因；表达调控；启动子；抑制序列
遗传学报000202
摘要：Nodal基因属于TGF-β超家族。它在小鼠原肠期的原条形成过程中起重要作用。Nodal基因的缺失导致中胚层不能形成。使小鼠死亡。用一系列含有Nodal基因5′侧翼序列其缺失体的荧光素酶报告基因质粒瞬时转化F9细胞。通过分析这些报告基因质粒的荧光素酶活性，在转录起始点上游的1kb处的EcoRⅠ附近找到一个抑制子元件。该抑制子元件的核心部分位于EcoRⅠ位点下游约200bp处，它几乎可以完全抑制Nodal基因启动子的活性。但对于SV40启动子没有影响。在不同的细胞种类中它的作用不同，在CHO细胞中它具有增强活性。
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中图分类号：Q789 文献标识码：A
文章编号：0379-172(2000)02-101-107
Analysis of a Suppressor Element of Mouse Nodal
Gene in Its 5′ Flanking Sequences
HU Xin-Li, ZHOU Xun-Lei
(College of Life Sciences, Department of Cell Biology and Genetics, Peking University,Beijing 100871, China)
Abstract: Nodal gene is a member of the TGF-β superfamily. It is required for the formation of the primitive streak during mouse gastrulation. Mice without Nodal gene will die due to the lack of mesoderm formation. F9 cells were transiently transfected with a series of luciferase reporter constructs containing the subcones of Nodal 5′filanking sequences and their deletions. By analyzing the luciferase activity of these constructs, a suppressor element was determined at about 1kb up stream the transcription initiation site, around an EcoRⅠ site. Its centrol part was located at sbout 100bp downstream of that EcoRⅠ site. It could almost totally, suppress the Nodal gene promoter activity, though it had no effect on SV40 promoter. It behaved differently in different cell lines. In CHO cells, it had an activation activity.
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Key words: Nodal gene; expression regulation; promoter; suppessor element
Nodal基因[1]首先在5.5d的小鼠胚中表达[2]，此时正是胚胎的原条开始形成的时候，随后它的表达集中原条前端的原结附近，这个区域相应鸡胚亨氏结与爪蟾的背唇，这些结构对于中胚层的发生起组织者作用。在第8.5d随着原结的消失，在鼠胚中不能再检测到Nodal基因mRNA的表达。而且Nodal基因编码的蛋白质是一种分泌型的信号分子，属于TGF-β超家族。由此推测，Nodal基因是一个在胚胎早期发育中中胚层发生以及其后的体轴形成过程中起重要作用的基因。
Nodal基因失活的纯合小鼠4.3d在原肠胚发育过程中，胚胎外层和胚外外胚层过度增殖，而没有中胚的形成，导致胚早期死亡[3，4]。
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Nodal基因还可能对小鼠发育早期左右体轴的形成和左右不对称结构的发生起决定作用[5，6]。
已知Nodal基因的表达具有严格的时空限制，研究它的表达调控有助于我们认识和分析胚胎发生过程中中胚层的诱导分化和体轴形成的分子机制。
本文对Nodal基因侧翼序列的各亚克隆及缺体进行了分析。以荧光素酶为报告的基因的质粒瞬时转化F9和其他一些细胞，找到Nodal基因的5′末端的某些顺式调控元件。
1 材料和方法
1.1质粒构建Nodal基因的侧翼序列用适当限制性内切酶酶切后克隆入pBluescriptKS(图1)制备克隆。本研究中所用的表达载体为pGL2-B(promega)，简称为B。pGL2-B上没有启动子和增强子，只有荧光素酶报告基因(图2)。为了制作系列缺失体的需要，将pGL2-B多克隆位点中XhoⅠ酶切位点消除。用XhoⅠ酶切，再用Klenow处理，填平粘性末端；最后用连接酶连接。经过上述改造得到的载体称为pGL2-Bx，简称为Bx。选择适当的酶切位点将基因组及其侧翼DNA各片段从pBluescript质粒切下，克隆到表达载体pGL2-Bx的荧光素酶报告基因前面。克隆后进行系列缺失体构建，即以绿豆核酸酶取代SI核酸酶，省去SI酶切后的Klenow处理，直接用T4 DNA连接酶将缺失后的DNA连接起来，形成缺失本，转化感受态大肠杆菌DH10。
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图1 Nodal 基因侧翼序列的各亚克隆的图谱
Fig.1 The subclones of the flanking sequences of Nodal gene
图2 PGL2-B质粒图谱
Fig，2 PLASMID OF pGL2-B
1.2细胞培养F9畸胎瘤细胞(由中国科学遗传研究所蒋耀青教授实验室提供)及ES
细胞(本实验室建立的MESPU-13)均使用DMEM(高糖)培养基(GIBCO)，补以20%的新生牛血清(天津生化制品厂)培养。CHO、HeLa、STO及小鼠胚胎原代成纤维细胞(均由本实验室提供)以DMEM培养基，补以10%新生牛血清培养。所有细胞均培养在5%CO2，37℃培养箱中，根据其生化情况，按一定比例隔天传代一次。
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1.3DNA转化用脂质体法转化细胞(LipofectminTM，GIBCOBRL)，转化前一天接种适量的细胞，用等量的质粒DNA转化细胞。每次转化都共转化含有SV40启动子和半乳糖苷酶的pSV-βgal质粒(Promega)作为检测转化效率的内源对照。转化后48h，用PBS将细胞洗两次，加入100ml细胞裂解液(Promega)，于室温下放置15min将细胞裂解。将细胞裂解液移入0.5ml的Eppendorf管，存于液氮中待测活性。
将2μl细胞裂解液及50μl荧光系酶底物在0.5μl的Eppendorf管内混匀，置于液闪计数器测定荧光酶活性，以CPM来表示。用96孔板测β-半乳糖苷活性.在每个孔中加入50μl细胞裂解液和50μl2 ×Assay Buffer(Promega)，在37℃下保温30min后，用150lμ1mol/L的Na2CO3终止反应置酶标仪上，于420nm处读取光吸收值，以ρ表示。
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以共转化的β-半乳糖苷酶的活性(β)作为内源对照，以
/β为系数(以每次转化的β-半乳糖苷酶活性的平均值),比较各组在转化效率相同时荧光素酶活性的相互关系,即比较CMP1/2/β值的平均值。以没有任何插入片段时pGL2-P的荧光素酶活性增加的倍数，即荧光素酶的相对活性RLUC。RLUC反应是荧光素酶基因表达的相对水平。1.4DNA序列测定 T7 DNA聚合酶序列测定试剂盒购自Phamacia公司，实验方法按试剂盒中提供的程序进行反应。
2 结果
2.1BNH 0.4和BNR 1.0质粒的构建
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用KpnⅠ+SacⅠ分别从pBSNH 0.4质粒和pBSNR1.0质粒的多克隆位点中分离出含有NH 0.4和NE1.0片段的KS 0.4和KS1.0片段，然后将它们分别克隆到pGLZ-B载体的相应位点中，得到BNH 0.4质粒和BNR1.0质粒。
2.2NR1.0亚克隆片段缺失体的构建(图3)
图3 抑制子子元件各缺失体示意图
Nodal 基因；——不含抑制子的缺失体部分；——含抑制子的缺失体部分Fig,3The indicative figure of various size deletion of suppressor
Nodal gene ;——The part of deltion without the rpressor ;——The part of deletion with the repressor, 百拇医药
同样用KpnⅠ+SacⅠ从pBSNR1.0质粒中分离出NR1.0片段，再次克隆到pGL2-Bx载体的相应位点上。然后，以KpnⅠ酶切该质粒，产生3′凸出末端来保护载体骨架，用XhoⅠ酶切，产生5′凸出末端。 用外切酶Ⅲ在25℃条件下酶切1、2、3、4和5min后，得到插入片段长度分别还是950bp、880bp、800bp、700bp、600bp和520bp的缺失体，分别称为Bx1.0D-1、Bx1.0D-2、Bx1.0D-3、Bx1.0D-4、和Bx1.0D-5(图3)。用SmaⅠ+SacⅠ双酶切，游离出插入片段，其电泳结果见图4。
图4 BXNR1。0及其缺失片段酶切谱
BXNR 1。0经Smal I+SacI双酶切；λDNA/Bst EII ;2.BxNR1.0 3.BxNR1.0D-2; 5.BxNR1.0D-3; 6.BxNR1.0D-4
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Fig.4 The electrophoresis of the nested deletions of BxNR 1.0 The reporter constructs were digested with Smal Iand Sac I;1.λDNA/Bst EII ;2.BxNR1.0 3.BxNR1.0D-2; 5.BxNR1.0D-3; 6.BxNR1.0D-4
2.3NR1.0系列缺失体及其对荧光素酶转录活性影响
将BNH0.4和BNR1.0及其各缺失体转化F9细胞。经校正转化效率之后，比较各报告基因质粒与pGL2-B载体本身的荧光素酶活性。BNR1.0、Bx1.0D-1和Bx1.0D-2较pGL2-B活性有所降低。这3个报告基因质粒中所含插入片段有抑制子元件存在。BNR1.0的酶活性与没有启动子的pGL2-B接近，表明其中片段具有最强的抑制作用。缺失至260bp后，报告基因活性与BNH0.4没有差别，Bx1.0D-3、Bx1.0D-4、Bx1.0D-5的活性分别是BNH0.4的1.08、1.01和1.10倍。上述结果表明，NR1.0片段中有一个抑制子元件在EcoRⅠ位点下游约200bp，这个抑制子元件对Nodal基因的增强子有很强的抑制作用(图5)。
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图5 抑制序列及其各缺失体对荧光素酶转录活性的效应
PGL2-B质粒的荧光素酶转录活性作为对照
Fig.5 The luciferase activity of the reporter constructs constructs containing the repressor element and its deletions The luciferase activity of PGL-2B as control
2.4 NR1.0片段5′末端EcoRⅠ下游区DNA测序
以5′-TGTATCTTATGGTCTGTAACTG-3′为测序引物测定EcoRⅠ下游约450bp的序列(图6)。
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图6 抑制序列部分测序结果(图中：…表示可出现茎环结构的区域)
Fig.6 The DNA sequence of part of the repressor element (In the figure …indicates the possible stem-loop structure of the sequence)
2.5抑制子元件细胞种类特异性分析
用BNR1.0分别转化F9、ES、CHO、HeLa、ME(胚胎原代成纤维细胞)和STO细胞来鉴
定抑制子元件的作用是否具有细胞种类的特异性。结果如图7所示：抑制序列只F9和ES细胞中表现抑制作用，它们的RLUC值低于NH0.4。在HeLa、STO和ME细胞中不表现出抑制作用，而在CHO细胞中显示微弱的增强作用，因为它的RLUC值高于NH0.4。同时用BNH0.4分别转化以上各细胞作为对照，因为启动子元件存在于NH0.4片段中(将在另一篇论文中发表)。
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图7 基本启动子元件及抑制序列细胞中种类特异性示意图
Fig,7 The indicative figure of the cell type specificity of the basic promotor element and repressor sequence
3 讨论
在5′侧翼序列中所找到的抑制子序列中，有两茎环结构出现。茎环结构的出现是存
在调控元件的一个重要特征，这种结构可能有利于反式因子与它们所识别的顺式元件的结合[7]，而且确实是一些蛋白质因子识别的结合位点[8]。在抑制子元件中，可形成茎环结构序列中包含Mye和Ebox反式因子识别位点。这两个茎环结构中一个在第一个缺失点(1.0D-1)之前，另一个在第二个和第三个缺失点(1.0D-2和1.0D-3)之间。这似乎与各种缺失体的抑制活性的变化相关，抑制活性下降很可能是由于缺失造成茎环结构的破坏所致。这段序列的功能将是今后深入开展工作的一个要点。
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抑制序列表现了细胞的特异性，只在F9和ES细胞中表现抑制作用。这与1995年Hewitt实验室WT1的抑制序列工作所得结果相似[9]。现在普遍认为，顺式元件的组织或细胞特异性不是绝对的，因为有些顺式元件可以与多个不同的反式因子结合，结合后才能决定其抑制或增加效应。其次，与之结合的反式因子的作用也是绝对的抑制或增强作用，因为这种作用还受到与启动子结合的反式因子的影响。例如NR1.0中抑制序列只对基因的启动子有抑制作用，而对SV40的启动子则表现出很弱的增强作用。在发现的负调控元件中，有一些是可以对不同的启动子都起抑制作用[10～12]。在很多情况下，细胞不具备与这段保守序列结合的反式因子，这时，这段保守序列就不表现调控活性。特别是ES细胞和F9细胞属于胚性细胞，而其他几种细胞是已分化的细胞，它们所具有的反式因子的种类和数量不会相同，这必然会影响到顺式元件的功能。
参考文献
[1]Zhou X, Sasaki H, lowe L et al. Nodal is a novel TGF-β-like gene expressed in the mouse node during gastrulation. Nature., 993.361:543～547.
, http://www.100md.com
[2]Conlon F K, lyons M, Tanaesu N et al. A primary requirement for nodal in the formation and maintenance of the primitive streak in the mouse. Development., 1994, 120:1919～1928.
[3]Conlon F L, Barth K S, Robertson E J. A novel retrovirally induced embryonic lethal mutation in the mouse: assessment of the developmental fate of embryonic stem cells homozygous for the 413-d previral insertion. Development., 1991, 111:969～981.
[4]Iannaccone P M, Zhou X, Khoukha M et al. Insertional mutation of a gene involves of a gene in growth regulation of the early mouse embryo. Development Dynamics., 1992, 194:198～208.
, 百拇医药
[5]Collignon J, Varlet I, Robertson F J. Relationship between asymmetric nodal expression and the direction of embryonic turning. Nature., 1996, 381:155～158.
[6]Lowe L A, Sampath S K, Okoyama T Y et al. Concerved left-right asymmetry of nodal expression and alterations in murine situs inversus. Nature., 1996. 381:158～161.
[7]Lee-huang S, Lin J J, Kung H et al. The 3′ flanking region of the human arythropoietin-encoding gene contains nitrogen-regulatory/oxyen-sensing consensus sequences and tissue-specific transcriptional regulatory element. Gene., 1993, 137:203～210.
, 百拇医药
[8]Lehninger A J, Nelson N L, Cox M M. Principles of Biochemistry (2nd edition). Worth Publishers. Tnc, 1993.
[9]Hewitt S M, Fraiacr G C, Saunders G F. Transcriptional silencer of the Wilms’ tumor gene WTI contains an Alu repeat. J. Biol. Chen., 1995, 270:17908～17912.
[10]Wioto A, Baltimmore D. π ρ Lineage-specific expression of the π T cell receptor gene by nearby silencer.Cell., 1989, 59:649～655.
[11]Cao S X, Gutman P D, Dave H P G. Identification of a transcriptional silencer in the 5′-flanking region of the human ε-globin gene. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:5306～5309.
[12]Berg P E, Williama D H, Qian R-L et al. A common protein binds to two silencers 5′ to human β-globin gene. Nuc. Acid. Res., 1989 17:8833～8852., 百拇医药