麻疹血凝抑制试验试剂盒的研制与应用
作者：卢亦愚 徐宝祥 严菊英 姜晓路
单位：浙江省卫生防疫站，杭州 310009
关键词：麻疹；抗体；血凝抑制试验；血凝抑制试验试剂盒
中国计划免疫000411 摘要：为了解决麻疹血凝抑制(HI)试验中猴红细胞的保存与人血清中非特异性凝集物质吸收的难点，推广麻疹HI试验方法，研制了麻疹HI试验试剂盒，并用该试剂盒与经典HI试验方法平行检测353份待检血清，结果有322份血清两法检测的效价完全一致(91.2%)，其余31份两法检测效价的差异为±2倍，即在HI试验允许误差范围内。两法检测效价的差异无显著的统计学意义 (P>0.05)。而且试剂盒不必用猴红细胞去吸收血清中的非特异性凝集物质，还可在4℃保存4个月以上。该试剂盒的研制与使用，可大大方便与促进麻疹血清流行病学工作的开展。
中图分类号：R511.1 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1006-916X(2000)04-0223-03
The Making of a Special Measles HI Test Kit and Its Application
LU Yi-yu XU Bao-xiang YAN Ju-ying
(Zhejiang Provincial Epidemic Prevention Station, Hangzhou 310009, China)
Abstract: In order to solve the problems of preserving monkey red blood cells and absorbing interference substances from serum samples in measles hemagglutination inhibition (HI) test and to popularize the measles HI method, we produced a special measles HI test kit and made parallel comparison with the classic HI method. The results showed no significant difference between the two methods (P>0.05) . No need is required to absorb interference substance in serum samples with monkey red blood cells. The kit can be kept safe for more than 4 months at 4℃. This special test kit can promote the measles research on seroepidemiology and make the research work much easier.
, 百拇医药
Key words: Measles; Antibody; HI test; HI test kit
麻疹可能是人类继消灭天花和即将消灭的脊髓灰质炎之后候选消灭的第三个传染病。我国卫生部1997年下发了《加速麻疹控制规划指南》，1998年卫生部办公厅下发了《全国麻疹监测方案(试行)》，并把及时发现麻疹病例、分析人群免疫状况、确定易感人群、预测麻疹暴发等列为麻疹监测的基本要求。国内外通常采用测定血清麻疹抗体水平来了解人群的免疫状况，血凝抑制(HI)试验是测定麻疹抗体中常用、快速、简便的实验方法，但缺点是该试验不仅要用新鲜的猴红细胞作凝集抑制试验，还需用大量的猴红细胞吸收待测人血清中的非特异性凝集物质[1～3]。因猴红细胞来源少，且不易长时间保存，使HI试验的广泛开展受到很大限制。我们针对上述两个难点研制成功了麻疹HI试验试剂盒，在我省已使用1年多，反应良好，现将结果报告如下。
材料与方法
, http://www.100md.com
1 试剂 麻疹HI试验试剂盒由本实验室研制，试剂盒中有麻疹血凝素1支，HI试验用敏感猴红细胞1瓶，猴红细胞保存液由NH4Cl、柠檬酸钾、ATP及其它生物活性物质复配而成。血清吸收物质1瓶，用于吸收人血清中的非特异性凝集物质。试验平行对照组所用新鲜猴红细胞由本站动物室提供，采集后4℃保存于阿氏液中1周内使用。
2 血清 待测静脉血清353份，来自本省3个县卫生防疫站送检的人群血清。
3 试验方法 HI试验参照卫生部《计划免疫技术管理规程》进行[3]。麻疹HI试验试剂盒使用方法，参照试剂盒说明书，在血清预处理时，吸取待检血清60μl加入1ml塑料尖底管中，56℃灭活30分钟，再加入已充分混匀的血清非特异性吸收物质90μl。将两者震摇混匀后，置4℃过夜，次日吸取上清液即为1：2稀释血清，以下步骤同常规HI试验。敏感猴红细胞开瓶后，用生理盐水洗3遍，压积猴红细胞用生理盐水配成1%猴红细胞悬液进行HI试验。
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试验时将每份待测血清分为a、b、c 3组，a组为血清未吸收对照，b组为常规HI试验方法，c组按HI试验试剂盒说明书方法进行。除c组所用试剂来自试剂盒外，a、b组均用新鲜猴红细胞作HI试验。为减少误差，分别用单头移液器与8头移液器进行加样与稀释。
结 果
1 血清非特异性凝集物质的吸收效果
用4℃冰箱保存4个月的试剂盒做了试验。从待测人群的血清HI试验结果可看出，除少量血清因其非特异性凝集物质较少，未作吸收处理对结果无多大影响外，绝大部分血清因未作吸附处理而产生非特异性凝集，使HI试验结果无法判定。经新鲜猴红细胞吸收的血清，以及经麻疹HI试验试剂盒非特异性凝集吸收物质处理的血清，无1份出现非特异性凝集。其血清对照孔猴红细胞下沉与试验中凝集模式均很好，而且两者间的血凝抑制效价非常一致。我们从中选出具有较强非特异性凝集物质的血清10份，再次对其用a、b、c 3种处理进行HI试验，结果如附表所示。图1是2号和10号标本的检测结果。
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附表 三种处理对血清非特异性凝集物质吸收效果的比较(麻疹HI试验滴度) 处理
血清标本号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
a
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无法判
无法判
无法判
无法判
无法判
无法判
无法判
无法判
无法判
无法判
b
1∶16
1∶8
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<1∶2
1∶32
1∶64
1∶2
1∶4
1∶16
1∶128
1∶156
c
1∶16
1∶8
<1∶2
1∶32
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1∶64
1∶2
1∶4
1∶16
1∶128
1∶256
注： a.未吸收的血清对照； b.常规HI试验，用猴红细胞吸收； c.HI试验试剂盒物质吸收。
图1 血清非特异性凝集物质吸收效果比较
从图1与附表可见，采用4℃保存4个月的试剂盒，其对血清的非特异性凝集物质的吸收状况良好，其结果与经典的猴红细胞吸收实验无任何差异。
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2 常规HI试验与HI试验试剂盒对353份血清试验结果的比较
从图2中可以看出，两组试验的353份血清中有322份血清的效价完全一致，占91.2%；其余31份血清(占8.8%)的效价差异在±2倍以内，均在麻疹HI试验规定的允许误差范围之内。这说明两者之间的一致性很好。
图2 麻疹HI试验试剂盒与常规HI试验对353份血清试验的相关性比较
经统计学分析，上述两组试验效价之间的差异无显著的统计学意义(t＝0.3670.051.96，P>0.05)，两者之间的相关系数r＝0.9926，有非常显著的统计学意义(P<0.01)。
讨 论
, http://www.100md.com 麻疹病毒H蛋白具有凝集猴红细胞的性能，但如血清中存在麻疹抗体时H蛋白抗原可被血清中的麻疹抗体所中和，这样猴红细胞遇到麻疹病毒抗原时的凝集特性消失，使猴红细胞产生沉淀，这就是麻疹HI试验的原理[1，2]。但许多人的血清中含有使猴红细胞凝集的非特异性凝集物质，可使猴红细胞产生非特异性凝集，所以通常HI试验时必须对每份血清进行预处理，加入压积的猴红细胞0.03ml以吸附血清中的非特异性凝集物质，因此真正用于HI试验的猴红细胞数量仅为吸收所用红细胞的1/10左右，即1ml压积猴红细胞可配成100ml血球悬液，对330份血清作HI抗体测定，但它仅能吸收处理30份血清。由于猴红细胞来源困难，也有人试图用人的AB型红细胞来吸收非特异性成分[4]。我们对此也作了研究，发现用该法无法吸收血清中的非特异性凝集物质。从大量标本的研究结果看，胎儿的脐带血血清中几乎无非特异性凝集成分，而出生后随年龄、地区的不同，血清中大多存在非特异性凝集物质，个别地区这一比例甚至高达90%以上。本研究经过多次试验，筛选出若干有机物与无机物组成的可吸收血清非特异性凝集物质的混合配方，以猴红细胞吸收为对照，对我省不同地区的数百份血清标本进行了麻疹HI抗体测定，发现完全可以代替通常的猴红细胞进行血清吸收。
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在麻疹HI试验中，猴红细胞的保存也是一个棘手的问题，由于猴红细胞在阿氏液中4℃保存不宜超过10天，猴血采多了，造成浪费；采少了，又需重采；而且每个月的供需要求不一致，这对合理采集带来很大的困难。为解决猴红细胞的4℃保存问题，也是本试剂盒研制的一个关键，我们采用了多种配方，从增强红细胞的营养供应，细胞膜的保护与降低红细胞的代谢等几方面着手，筛选出一个较为理想的配方，4℃保存可达4个月以上，当保存至6个月时虽有部分猴红细胞溶血，但剩余的仍可正常进行试验。而且4℃保存的猴红细胞，比冷冻保存的猴红细胞在HI试验中的凝集模式更好，与新鲜猴红细胞相比，无论其凝集模式还是试验结果均无任何差异。
上述试剂盒1999年开始在我省推广，开展麻疹抗体监测的6个地区，对上千份血清作了HI试验，效果令人十分满意。该试验盒的研制成功与推广，使大量的麻疹HI抗体测定成为可能，可大量进行免疫成功率与人群抗体水平监测，这将大大促进麻疹的血清学监测与血清流行病学工作的开展，为控制乃至最终消灭麻疹的工作作出贡献。
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作者简介：卢亦愚(1948)，男，浙江省杭州市人，浙江省卫生防疫站病毒研究所主任技师，医学博士，主要从事病毒学和免疫学的实验室工作。
参考文献：
[1]中国医学科学院流行病学微生物学防治研究所. 常见病毒病实验技术[M].北京：科学出版社，1978，246-248.
[2]小浜友昭.麻疹ウィルス[J]. 日本公众卫生协会，1987，129-132.
[3]卫生部.计划免疫技术管理规程[S].1998，146-159.
[4]项金法.AB型人红细胞处理麻疹待检血清中非特异性凝集素[J].浙江医学，1988，10(3)：144-145.
收稿日期：2000-03-07, http://www.100md.com
单位：浙江省卫生防疫站，杭州 310009
关键词：麻疹；抗体；血凝抑制试验；血凝抑制试验试剂盒
中国计划免疫000411 摘要：为了解决麻疹血凝抑制(HI)试验中猴红细胞的保存与人血清中非特异性凝集物质吸收的难点，推广麻疹HI试验方法，研制了麻疹HI试验试剂盒，并用该试剂盒与经典HI试验方法平行检测353份待检血清，结果有322份血清两法检测的效价完全一致(91.2%)，其余31份两法检测效价的差异为±2倍，即在HI试验允许误差范围内。两法检测效价的差异无显著的统计学意义 (P>0.05)。而且试剂盒不必用猴红细胞去吸收血清中的非特异性凝集物质，还可在4℃保存4个月以上。该试剂盒的研制与使用，可大大方便与促进麻疹血清流行病学工作的开展。
中图分类号：R511.1 文献标识码：A
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文章编号：1006-916X(2000)04-0223-03
The Making of a Special Measles HI Test Kit and Its Application
LU Yi-yu XU Bao-xiang YAN Ju-ying
(Zhejiang Provincial Epidemic Prevention Station, Hangzhou 310009, China)
Abstract: In order to solve the problems of preserving monkey red blood cells and absorbing interference substances from serum samples in measles hemagglutination inhibition (HI) test and to popularize the measles HI method, we produced a special measles HI test kit and made parallel comparison with the classic HI method. The results showed no significant difference between the two methods (P>0.05) . No need is required to absorb interference substance in serum samples with monkey red blood cells. The kit can be kept safe for more than 4 months at 4℃. This special test kit can promote the measles research on seroepidemiology and make the research work much easier.
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Key words: Measles; Antibody; HI test; HI test kit
麻疹可能是人类继消灭天花和即将消灭的脊髓灰质炎之后候选消灭的第三个传染病。我国卫生部1997年下发了《加速麻疹控制规划指南》，1998年卫生部办公厅下发了《全国麻疹监测方案(试行)》，并把及时发现麻疹病例、分析人群免疫状况、确定易感人群、预测麻疹暴发等列为麻疹监测的基本要求。国内外通常采用测定血清麻疹抗体水平来了解人群的免疫状况，血凝抑制(HI)试验是测定麻疹抗体中常用、快速、简便的实验方法，但缺点是该试验不仅要用新鲜的猴红细胞作凝集抑制试验，还需用大量的猴红细胞吸收待测人血清中的非特异性凝集物质[1～3]。因猴红细胞来源少，且不易长时间保存，使HI试验的广泛开展受到很大限制。我们针对上述两个难点研制成功了麻疹HI试验试剂盒，在我省已使用1年多，反应良好，现将结果报告如下。
材料与方法
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1 试剂 麻疹HI试验试剂盒由本实验室研制，试剂盒中有麻疹血凝素1支，HI试验用敏感猴红细胞1瓶，猴红细胞保存液由NH4Cl、柠檬酸钾、ATP及其它生物活性物质复配而成。血清吸收物质1瓶，用于吸收人血清中的非特异性凝集物质。试验平行对照组所用新鲜猴红细胞由本站动物室提供，采集后4℃保存于阿氏液中1周内使用。
2 血清 待测静脉血清353份，来自本省3个县卫生防疫站送检的人群血清。
3 试验方法 HI试验参照卫生部《计划免疫技术管理规程》进行[3]。麻疹HI试验试剂盒使用方法，参照试剂盒说明书，在血清预处理时，吸取待检血清60μl加入1ml塑料尖底管中，56℃灭活30分钟，再加入已充分混匀的血清非特异性吸收物质90μl。将两者震摇混匀后，置4℃过夜，次日吸取上清液即为1：2稀释血清，以下步骤同常规HI试验。敏感猴红细胞开瓶后，用生理盐水洗3遍，压积猴红细胞用生理盐水配成1%猴红细胞悬液进行HI试验。
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试验时将每份待测血清分为a、b、c 3组，a组为血清未吸收对照，b组为常规HI试验方法，c组按HI试验试剂盒说明书方法进行。除c组所用试剂来自试剂盒外，a、b组均用新鲜猴红细胞作HI试验。为减少误差，分别用单头移液器与8头移液器进行加样与稀释。
结 果
1 血清非特异性凝集物质的吸收效果
用4℃冰箱保存4个月的试剂盒做了试验。从待测人群的血清HI试验结果可看出，除少量血清因其非特异性凝集物质较少，未作吸收处理对结果无多大影响外，绝大部分血清因未作吸附处理而产生非特异性凝集，使HI试验结果无法判定。经新鲜猴红细胞吸收的血清，以及经麻疹HI试验试剂盒非特异性凝集吸收物质处理的血清，无1份出现非特异性凝集。其血清对照孔猴红细胞下沉与试验中凝集模式均很好，而且两者间的血凝抑制效价非常一致。我们从中选出具有较强非特异性凝集物质的血清10份，再次对其用a、b、c 3种处理进行HI试验，结果如附表所示。图1是2号和10号标本的检测结果。
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附表 三种处理对血清非特异性凝集物质吸收效果的比较(麻疹HI试验滴度) 处理
血清标本号
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注： a.未吸收的血清对照； b.常规HI试验，用猴红细胞吸收； c.HI试验试剂盒物质吸收。
图1 血清非特异性凝集物质吸收效果比较
从图1与附表可见，采用4℃保存4个月的试剂盒，其对血清的非特异性凝集物质的吸收状况良好，其结果与经典的猴红细胞吸收实验无任何差异。
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2 常规HI试验与HI试验试剂盒对353份血清试验结果的比较
从图2中可以看出，两组试验的353份血清中有322份血清的效价完全一致，占91.2%；其余31份血清(占8.8%)的效价差异在±2倍以内，均在麻疹HI试验规定的允许误差范围之内。这说明两者之间的一致性很好。
图2 麻疹HI试验试剂盒与常规HI试验对353份血清试验的相关性比较
经统计学分析，上述两组试验效价之间的差异无显著的统计学意义(t＝0.367
讨 论
, http://www.100md.com 麻疹病毒H蛋白具有凝集猴红细胞的性能，但如血清中存在麻疹抗体时H蛋白抗原可被血清中的麻疹抗体所中和，这样猴红细胞遇到麻疹病毒抗原时的凝集特性消失，使猴红细胞产生沉淀，这就是麻疹HI试验的原理[1，2]。但许多人的血清中含有使猴红细胞凝集的非特异性凝集物质，可使猴红细胞产生非特异性凝集，所以通常HI试验时必须对每份血清进行预处理，加入压积的猴红细胞0.03ml以吸附血清中的非特异性凝集物质，因此真正用于HI试验的猴红细胞数量仅为吸收所用红细胞的1/10左右，即1ml压积猴红细胞可配成100ml血球悬液，对330份血清作HI抗体测定，但它仅能吸收处理30份血清。由于猴红细胞来源困难，也有人试图用人的AB型红细胞来吸收非特异性成分[4]。我们对此也作了研究，发现用该法无法吸收血清中的非特异性凝集物质。从大量标本的研究结果看，胎儿的脐带血血清中几乎无非特异性凝集成分，而出生后随年龄、地区的不同，血清中大多存在非特异性凝集物质，个别地区这一比例甚至高达90%以上。本研究经过多次试验，筛选出若干有机物与无机物组成的可吸收血清非特异性凝集物质的混合配方，以猴红细胞吸收为对照，对我省不同地区的数百份血清标本进行了麻疹HI抗体测定，发现完全可以代替通常的猴红细胞进行血清吸收。
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在麻疹HI试验中，猴红细胞的保存也是一个棘手的问题，由于猴红细胞在阿氏液中4℃保存不宜超过10天，猴血采多了，造成浪费；采少了，又需重采；而且每个月的供需要求不一致，这对合理采集带来很大的困难。为解决猴红细胞的4℃保存问题，也是本试剂盒研制的一个关键，我们采用了多种配方，从增强红细胞的营养供应，细胞膜的保护与降低红细胞的代谢等几方面着手，筛选出一个较为理想的配方，4℃保存可达4个月以上，当保存至6个月时虽有部分猴红细胞溶血，但剩余的仍可正常进行试验。而且4℃保存的猴红细胞，比冷冻保存的猴红细胞在HI试验中的凝集模式更好，与新鲜猴红细胞相比，无论其凝集模式还是试验结果均无任何差异。
上述试剂盒1999年开始在我省推广，开展麻疹抗体监测的6个地区，对上千份血清作了HI试验，效果令人十分满意。该试验盒的研制成功与推广，使大量的麻疹HI抗体测定成为可能，可大量进行免疫成功率与人群抗体水平监测，这将大大促进麻疹的血清学监测与血清流行病学工作的开展，为控制乃至最终消灭麻疹的工作作出贡献。
, 百拇医药
作者简介：卢亦愚(1948)，男，浙江省杭州市人，浙江省卫生防疫站病毒研究所主任技师，医学博士，主要从事病毒学和免疫学的实验室工作。
参考文献：
[1]中国医学科学院流行病学微生物学防治研究所. 常见病毒病实验技术[M].北京：科学出版社，1978，246-248.
[2]小浜友昭.麻疹ウィルス[J]. 日本公众卫生协会，1987，129-132.
[3]卫生部.计划免疫技术管理规程[S].1998，146-159.
[4]项金法.AB型人红细胞处理麻疹待检血清中非特异性凝集素[J].浙江医学，1988，10(3)：144-145.
收稿日期：2000-03-07, http://www.100md.com