HIV-1 p24抗原检测的应用研究
作者：尹红章 李秀华 孟淑芳 宋爱京 李德富
单位：尹红章(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及标准化研究重点实验室，北京100050)；李秀华(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定；及标准化研究重点实验室，北京100050)；孟淑芳(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及标准化研究重点实验室，北京100050)
关键词：HIV-1；p24；ELISA；单克隆抗体
中国免疫学杂志000314 摘 要 目的：用抗HIV-1 p24单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂，检测HIV-1抗体阳性及其它样品，探讨应用的可行性。方法：采用单克隆抗体固相、兔抗HIV-1 p24抗体夹心，羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法。结果：显示试剂盒HIV-1 p24抗原检出灵敏度为50 pg/ml(基因工程抗原)；特异性99.46%；HIV抗体阳性血样阳性率3.2%；抗体阴性的特殊人群血样阳性率3.9%；抗体不确定血样阳性率为15.4%，明显高于抗体阳性和阴性组血样。病毒培养1 d，抗原效价1∶80，第3天可达1∶5 120。结论：该间接夹心HIV-1 p24抗原检测试剂灵敏度高、特异性好，可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究。用抗HIV-1 p24单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂，检测HIV-1抗体阳性及其它样品，探讨应用的可行性。方法：采用单克隆抗体固相、兔抗HIV-1 p24抗体夹心，羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法。结果：显示试剂盒HIV-1 p24抗原检出灵敏度为50 pg/ml(基因工程抗原)；特异性99.46%；HIV抗体阳性血样阳性率3.2%；抗体阴性的特殊人群血样阳性率3.9%；抗体不确定血样阳性率为15.4%，明显高于抗体阳性和阴性组血样。病毒培养1 d，抗原效价1∶80，第3天可达1∶5 120。结论：该间接夹心HIV-1 p24抗原检测试剂灵敏度高、特异性好，可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392-33
Prevalence study of HIV-1 p24 antigen detection kit in different samples
YIN Hong-Zhang LI Xiu-Hua MENG Shu-Fang et al.
( The Key Lab.of Ministry of Public Health for the Control and Standard Research of Biotechnic Products, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract Objective： The indirect Sandwich ELISA kit for detection of HIV-1 p24 antigen were constructed to test different kind of samples.Methods: Sensitivity and specificity of the kit were 50 pg/ml and 99.46% respectively. Among the different samples 3.2% of anti-HIV positive,3.9%(6/152) of high risk group populations and 15.4%(4/26) of anti-HIV indeterminant samples which were shown HIV-1 p24 positive. Results:The detection of virus culture supernatant also showed the high sensitivity of the test kit.Conclusion: The HIV-1 p24 test kit will be useful for detection of HIV infection followed anti-HIV screening and for virological study.
, 百拇医药
Key words：HIV-1 p24 ELISA McAb
目前HIV的感染，以检测血中的抗体为主要方法，尤其是在献血员的筛查中。但是众所周知，病毒感染机体后，在抗体产生之前尚有一段窗口期[1]，由此在进行抗HIV筛查后，再进行HIV-1抗原的检测，对缩短HIV感染检测的窗口期，进一步控制HIV经血传播意义十分重大。1997年，美国FDA已制定了对献血员抗HIV筛查阴性样品进行HIV-1抗原筛查的法规[2]。我国由于HIV-1 p24抗原检测试剂的空白，尤其是缺乏高灵敏度的试剂，尚不能开展HIV-1抗原检测的研究。本文利用高特异性的抗HIV-1 单克隆抗体、多克隆抗体及抗多抗种属的HRP结合物构建出HIV-1 p24抗原检测试剂，并对不同样品进行检测分析，从而为我国HIV-1 p24抗原的检测奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 HIV-1 p24抗原检测试剂盒
, 百拇医药
1.1.1 鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体 基因工程抗原免疫，常规PEG法制备杂交瘤细胞；辛酸硫酸铵法纯化单抗用于固相。
1.1.2 兔抗HIV-1 p24多抗 基因工程抗原免疫制备兔抗HIV-1 p24抗血清，EIA效价≥1∶105。
1.1.3 羊抗兔HRP结合物 美国Jackson公司产品，EIA效价≥1∶105。
1.1.4 灵敏度测定 基因工程HIV-1 p24抗原 1 600 pg/ml，用1%BSA 0.02 mol/L pH7.2 PBS系列稀释至50 pg/ml，测定试剂的灵敏度。
1.1.5 特异性测定 义务献血员样品912份，测定试剂的特异性。
1.2 样品 经筛查并确证的HIV-1抗体阳性样品249份、阴性血样221份，由河南、成都等地购进。滴度为10-6的HIV-1ⅢB株病毒接种细胞，分别于培养的不同时间收集病毒上清液，系列稀释测定HIV-1 p24抗原的活性。
, 百拇医药
1.3 HIV-1 p24抗原的检测及结果确证
1.3.1 抗原检测 按试剂盒说明书操作及判定结果，主要检测步骤如下：①固相抗HIV-1 p24 单克隆抗体板，加待检样品100 μl，37℃反应60 min；洗涤。②1∶1 000倍兔抗HIV-1 p24多抗，37℃ 60 min；③1∶10 000倍的羊抗兔HRP结合物，37℃ 60 min；④OPD底物37℃反应30 min；⑤硫酸终止，测492 nm吸收值。
1.3.2 HIV-1 p24抗原检测结果确证 初测并经复测阳性的样品用阻断试验确证：固相板中20 μl HIV-1抗体阳性的人血浆及80 μl抗原阳性样品，混匀37℃60 min，并设抗体阴性人血浆阻断阴性对照。其余检测步骤同上抗原检测。以抗体阳性孔OD/阴性孔OD×100%≤50%为确证阳性。
2 结果
, 百拇医药 2.1 灵敏度测定结果 表1结果显示对HIV-1 p24抗原试剂的检出灵敏度可达50 pg/ml。
表1 试剂盒敏感度测定结果
Tab.1 The sensitivity of the test kit Rp24(pg/ml)
S/Co
1 600
15.4
800
8.4
400
5.4
200
, http://www.100md.com
3.1
100
1.9
50
1.0
2.2 特异性结果检测 表2结果显示，912份健康义务献血员中，约99.5%的样本OD492≤0.1，总样本均值为0.049，标准差(s)为0.015，用单侧99%的可信限判定，总样本有6份阳性，与按试剂盒说明书判定其阳性数(5份)基本一致，其假阳性率为5.46‰(5/912)。5份样品经复测未见阳性反应。表2 试剂盒特异性测定结果
Tab.2 The results of specificity of test kit OD492
, 百拇医药
No.samples
Accumilated%
0.02
1
0.11
0.03
29
3.28
0.04
228
28.29
0.05
318
, 百拇医药
63.16
0.06
186
83.55
0.07
93
93.75
0.08
28
96.82
0.09
18
98.79
, http://www.100md.com
0.10
6
99.45
0.12
3
99.78
0.14
1
99.89
0.24
1
100.00
2.3 不同人群血样检测结果 表3显示不同人群血样检测结果，由此可见HIV抗体阳性血样抗原初测阳性率及确证率均明显低于抗体阴性及不确定样品血样。
, 百拇医药
表3 不同人群血样抗原测定结果
Tab.3 HIV-1 p24 antigen seroprevalence study in different samples Samples
No.case
Initial reactive
Repeatedly reactive
No.neutralized
Anti-HIV positive
249
18
8
, 百拇医药
6
Anti-HIV negative
152
10
6
5
Anti-HIV indeterminant
26
4
4
4
2.4 病毒培养液抗原活性测定 表4结果显示HIV-1 p24抗原活性测定结果与病毒培养时间呈明显的正相关。
, 百拇医药
表4 病毒培养上清液HIV-1 p24抗原检测结果(S/Co)
Tab.4 HIV-1 p24 antigen prevalence in virus culture supernatant(S/Co) Dilution/day
1
2
3
4
5
1∶40
1.90
2.90
15.00
, http://www.100md.com
>30.30
>30.30
1∶80
1.20
1.29
8.97
20.00
19.60
1∶160
0.89
1.04
6.50
11.50
, 百拇医药
11.40
1∶320
0.80
0.97
4.20
7.30
7.20
1∶640
2.10
5.00
5.90
1∶1 280
1.80
, http://www.100md.com
3.10
3.30
1∶2 560
1.20
1.90
2.10
1∶5 120
1.00
1.50
1.70
3 讨论
HIV-1 p24抗原的检测，对于献血员筛查作为抗体筛查的补充，对进一步控制HIV感染的血源传播十分重要。本文作者构建的间接夹心法试剂检测灵敏度可达到50 pg/ml，且特异性好，为我国进一步开展HIV-1 p24抗原的检测研究奠定了基础。
, 百拇医药
本文结果显示在高危人群HIV抗体阴性样品中有6例HIV-1 p24抗原检测阳性，且可由确证试验证实，从而提示对献血员，尤其是临床供血员在抗体筛查阴性后进一步筛查HIV-1 p24抗原很有必要。此外病毒培养物的检测结果提示，HIV-1 p24抗原的检测对于监测病毒繁殖生长是一种简便快速的方法，对于临床艾滋病病程观察及抗病毒疗法疗效的监测等基础研究方面很有应用价值[3]。 HIV抗体阳性样品中有一定比例的抗原阳性，但中和确证率较低，本文结果显示仅为75%，与美国雅培报告的数据基本一致，有关机制目前尚不清楚，有待进一步研究。
基金项目：国家“九五”科技攻关资助(96-C02-01-16)
作者简介：尹红章，副研究员，从事HIV感染检测的研究；
李德富，研究员，从事单克隆抗体及病毒学研究
作者单位：宋爱京(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及标
, http://www.100md.com
准化研究重点实验室，北京100050)
李德富(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及
标准化研究重点实验室，北京100050)
参考文献：
[1]Fransen K,Mertens G,Stynen D et al. Evaluation of a newly developed HIV antigen test. J Med Virol,1997;53:1,31-5
[2]Recommendations for donors screening with a Licensed test for HIV-1 p24 antigen.FDA.U.S.A.1995 Aug.
[3]Bi J,Opravil M, Tomasik Z et al. Simple monitoring of antiroviral therapy with a signal-amplification-boosted HIV-1 p24 antigen assay with heat-dnatured plasma.AIDS,1997;11:6,F47-52
收稿日期：1999-02-07, 百拇医药
单位：尹红章(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及标准化研究重点实验室，北京100050)；李秀华(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定；及标准化研究重点实验室，北京100050)；孟淑芳(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及标准化研究重点实验室，北京100050)
关键词：HIV-1；p24；ELISA；单克隆抗体
中国免疫学杂志000314 摘 要 目的：用抗HIV-1 p24单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂，检测HIV-1抗体阳性及其它样品，探讨应用的可行性。方法：采用单克隆抗体固相、兔抗HIV-1 p24抗体夹心，羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法。结果：显示试剂盒HIV-1 p24抗原检出灵敏度为50 pg/ml(基因工程抗原)；特异性99.46%；HIV抗体阳性血样阳性率3.2%；抗体阴性的特殊人群血样阳性率3.9%；抗体不确定血样阳性率为15.4%，明显高于抗体阳性和阴性组血样。病毒培养1 d，抗原效价1∶80，第3天可达1∶5 120。结论：该间接夹心HIV-1 p24抗原检测试剂灵敏度高、特异性好，可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究。用抗HIV-1 p24单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂，检测HIV-1抗体阳性及其它样品，探讨应用的可行性。方法：采用单克隆抗体固相、兔抗HIV-1 p24抗体夹心，羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法。结果：显示试剂盒HIV-1 p24抗原检出灵敏度为50 pg/ml(基因工程抗原)；特异性99.46%；HIV抗体阳性血样阳性率3.2%；抗体阴性的特殊人群血样阳性率3.9%；抗体不确定血样阳性率为15.4%，明显高于抗体阳性和阴性组血样。病毒培养1 d，抗原效价1∶80，第3天可达1∶5 120。结论：该间接夹心HIV-1 p24抗原检测试剂灵敏度高、特异性好，可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392-33
Prevalence study of HIV-1 p24 antigen detection kit in different samples
YIN Hong-Zhang LI Xiu-Hua MENG Shu-Fang et al.
( The Key Lab.of Ministry of Public Health for the Control and Standard Research of Biotechnic Products, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Abstract Objective： The indirect Sandwich ELISA kit for detection of HIV-1 p24 antigen were constructed to test different kind of samples.Methods: Sensitivity and specificity of the kit were 50 pg/ml and 99.46% respectively. Among the different samples 3.2% of anti-HIV positive,3.9%(6/152) of high risk group populations and 15.4%(4/26) of anti-HIV indeterminant samples which were shown HIV-1 p24 positive. Results:The detection of virus culture supernatant also showed the high sensitivity of the test kit.Conclusion: The HIV-1 p24 test kit will be useful for detection of HIV infection followed anti-HIV screening and for virological study.
, 百拇医药
Key words：HIV-1 p24 ELISA McAb
目前HIV的感染，以检测血中的抗体为主要方法，尤其是在献血员的筛查中。但是众所周知，病毒感染机体后，在抗体产生之前尚有一段窗口期[1]，由此在进行抗HIV筛查后，再进行HIV-1抗原的检测，对缩短HIV感染检测的窗口期，进一步控制HIV经血传播意义十分重大。1997年，美国FDA已制定了对献血员抗HIV筛查阴性样品进行HIV-1抗原筛查的法规[2]。我国由于HIV-1 p24抗原检测试剂的空白，尤其是缺乏高灵敏度的试剂，尚不能开展HIV-1抗原检测的研究。本文利用高特异性的抗HIV-1 单克隆抗体、多克隆抗体及抗多抗种属的HRP结合物构建出HIV-1 p24抗原检测试剂，并对不同样品进行检测分析，从而为我国HIV-1 p24抗原的检测奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 HIV-1 p24抗原检测试剂盒
, 百拇医药
1.1.1 鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体 基因工程抗原免疫，常规PEG法制备杂交瘤细胞；辛酸硫酸铵法纯化单抗用于固相。
1.1.2 兔抗HIV-1 p24多抗 基因工程抗原免疫制备兔抗HIV-1 p24抗血清，EIA效价≥1∶105。
1.1.3 羊抗兔HRP结合物 美国Jackson公司产品，EIA效价≥1∶105。
1.1.4 灵敏度测定 基因工程HIV-1 p24抗原 1 600 pg/ml，用1%BSA 0.02 mol/L pH7.2 PBS系列稀释至50 pg/ml，测定试剂的灵敏度。
1.1.5 特异性测定 义务献血员样品912份，测定试剂的特异性。
1.2 样品 经筛查并确证的HIV-1抗体阳性样品249份、阴性血样221份，由河南、成都等地购进。滴度为10-6的HIV-1ⅢB株病毒接种细胞，分别于培养的不同时间收集病毒上清液，系列稀释测定HIV-1 p24抗原的活性。
, 百拇医药
1.3 HIV-1 p24抗原的检测及结果确证
1.3.1 抗原检测 按试剂盒说明书操作及判定结果，主要检测步骤如下：①固相抗HIV-1 p24 单克隆抗体板，加待检样品100 μl，37℃反应60 min；洗涤。②1∶1 000倍兔抗HIV-1 p24多抗，37℃ 60 min；③1∶10 000倍的羊抗兔HRP结合物，37℃ 60 min；④OPD底物37℃反应30 min；⑤硫酸终止，测492 nm吸收值。
1.3.2 HIV-1 p24抗原检测结果确证 初测并经复测阳性的样品用阻断试验确证：固相板中20 μl HIV-1抗体阳性的人血浆及80 μl抗原阳性样品，混匀37℃60 min，并设抗体阴性人血浆阻断阴性对照。其余检测步骤同上抗原检测。以抗体阳性孔OD/阴性孔OD×100%≤50%为确证阳性。
2 结果
, 百拇医药 2.1 灵敏度测定结果 表1结果显示对HIV-1 p24抗原试剂的检出灵敏度可达50 pg/ml。
表1 试剂盒敏感度测定结果
Tab.1 The sensitivity of the test kit Rp24(pg/ml)
S/Co
1 600
15.4
800
8.4
400
5.4
200
, http://www.100md.com
3.1
100
1.9
50
1.0
2.2 特异性结果检测 表2结果显示，912份健康义务献血员中，约99.5%的样本OD492≤0.1，总样本均值为0.049，标准差(s)为0.015，用单侧99%的可信限判定，总样本有6份阳性，与按试剂盒说明书判定其阳性数(5份)基本一致，其假阳性率为5.46‰(5/912)。5份样品经复测未见阳性反应。表2 试剂盒特异性测定结果
Tab.2 The results of specificity of test kit OD492
, 百拇医药
No.samples
Accumilated%
0.02
1
0.11
0.03
29
3.28
0.04
228
28.29
0.05
318
, 百拇医药
63.16
0.06
186
83.55
0.07
93
93.75
0.08
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0.09
18
98.79
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0.10
6
99.45
0.12
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0.14
1
99.89
0.24
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2.3 不同人群血样检测结果 表3显示不同人群血样检测结果，由此可见HIV抗体阳性血样抗原初测阳性率及确证率均明显低于抗体阴性及不确定样品血样。
, 百拇医药
表3 不同人群血样抗原测定结果
Tab.3 HIV-1 p24 antigen seroprevalence study in different samples Samples
No.case
Initial reactive
Repeatedly reactive
No.neutralized
Anti-HIV positive
249
18
8
, 百拇医药
6
Anti-HIV negative
152
10
6
5
Anti-HIV indeterminant
26
4
4
4
2.4 病毒培养液抗原活性测定 表4结果显示HIV-1 p24抗原活性测定结果与病毒培养时间呈明显的正相关。
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表4 病毒培养上清液HIV-1 p24抗原检测结果(S/Co)
Tab.4 HIV-1 p24 antigen prevalence in virus culture supernatant(S/Co) Dilution/day
1
2
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1∶40
1.90
2.90
15.00
, http://www.100md.com
>30.30
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1∶80
1.20
1.29
8.97
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19.60
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1.04
6.50
11.50
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11.40
1∶320
0.80
0.97
4.20
7.30
7.20
1∶640
2.10
5.00
5.90
1∶1 280
1.80
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3.10
3.30
1∶2 560
1.20
1.90
2.10
1∶5 120
1.00
1.50
1.70
3 讨论
HIV-1 p24抗原的检测，对于献血员筛查作为抗体筛查的补充，对进一步控制HIV感染的血源传播十分重要。本文作者构建的间接夹心法试剂检测灵敏度可达到50 pg/ml，且特异性好，为我国进一步开展HIV-1 p24抗原的检测研究奠定了基础。
, 百拇医药
本文结果显示在高危人群HIV抗体阴性样品中有6例HIV-1 p24抗原检测阳性，且可由确证试验证实，从而提示对献血员，尤其是临床供血员在抗体筛查阴性后进一步筛查HIV-1 p24抗原很有必要。此外病毒培养物的检测结果提示，HIV-1 p24抗原的检测对于监测病毒繁殖生长是一种简便快速的方法，对于临床艾滋病病程观察及抗病毒疗法疗效的监测等基础研究方面很有应用价值[3]。 HIV抗体阳性样品中有一定比例的抗原阳性，但中和确证率较低，本文结果显示仅为75%，与美国雅培报告的数据基本一致，有关机制目前尚不清楚，有待进一步研究。
基金项目：国家“九五”科技攻关资助(96-C02-01-16)
作者简介：尹红章，副研究员，从事HIV感染检测的研究；
李德富，研究员，从事单克隆抗体及病毒学研究
作者单位：宋爱京(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及标
, http://www.100md.com
准化研究重点实验室，北京100050)
李德富(中国药品生物制品检定所卫生部生物技术产品检定及
标准化研究重点实验室，北京100050)
参考文献：
[1]Fransen K,Mertens G,Stynen D et al. Evaluation of a newly developed HIV antigen test. J Med Virol,1997;53:1,31-5
[2]Recommendations for donors screening with a Licensed test for HIV-1 p24 antigen.FDA.U.S.A.1995 Aug.
[3]Bi J,Opravil M, Tomasik Z et al. Simple monitoring of antiroviral therapy with a signal-amplification-boosted HIV-1 p24 antigen assay with heat-dnatured plasma.AIDS,1997;11:6,F47-52
收稿日期：1999-02-07, 百拇医药