华支睾吸虫代谢抗原的应用价值研究
作者：曾明安 徐亮 李娟佑 屈振麒
单位：四川省寄生虫病防治研究所 成都 610041
关键词：
实用寄生虫病杂志990208 ELISA检测华支睾吸虫抗体(IgG)，通常是以华支睾吸虫成虫水溶性抗原(CSA)为诊断抗原。余海昕等(1988)报告以华支睾吸虫代谢抗原(CSMA)作诊断抗原，用ABC-ELISA检测感染华支睾吸虫兔血清，证实CSMA有较高的诊断敏感性，与正常兔及感染血吸虫、蛔虫的兔血清反应的OD值低于CSA[1]，但迄今尚未见到有关CSMA用于人体华支睾吸虫病特异抗体(IgG)的检测报告。为此，我们以CSMA和CSA作诊断抗原，用白色PVC快速Dot-ELISA法[2]比较检测人体华支睾吸虫病血清，以评价CSMA诊断的敏感性及特异性。
1 材料及方法
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1.1 材料 ①抗原 i.CSMA 剖检感染华支睾吸虫兔胆管内活虫，择其完整虫子以无菌NS洗净，置于盛有NS的玻璃器皿内，放37℃温箱24h，收集培养NS，再加入NS培养24h，收集培养NS，将两次培养NS合并，4000r/min离心60min，上清即CSMA，于4℃下对NS透析24h，其间换液3次，然后将透析袋悬于4℃冰箱让其自然浓缩至一定量后，加入硫柳汞使终浓度为0.01%，4℃保存备用。ii.CSA 按常法制备，4℃保存备用。CSMA和CSA蛋白含量测定均采用考马斯亮兰G250法[3]。蛋白含量为：CSMA为0.56mg/ml，CSA为1.5mg/ml。致敏白色PVC载体的蛋白量均为50μg/ml。②载体 白色PVC载体系5×2孔直径1cm深0.5cm的平底凹孔板[2]。③试剂 抗原稀释液为pH9.6碳酸盐缓冲液。血清、酶结合物稀释及洗涤液为pH7.4PBS-NP40。酶结合物按改良过碘酸钠法[4]标记的HRP-羊抗人IgG，工作浓度1∶400。显色底物为4CIN-H2O2。④血清 粪检证实的华支睾吸虫病血清92份及血吸虫病血清64份；临床确诊及ELISA阳性的包虫病血清24份和囊虫病血清5份；HBV标志物阳性血清10份；健康人血清156份。试验血清稀释度1∶10。
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1.2 方法 将CSMA和CSA分别点样于白色PVC板上下排各孔致敏，洗涤后加PBS 100μl/孔，将每份待测(或参考)血清各加10μl于上下排对应抗原孔，混匀，置25℃以上室温或37℃温箱15min，用PBS快洗1次，自来水快洗5次，甩干水份，每孔滴酶结合物1滴(约50μl)，如上温育、洗涤，甩干水份，加显色剂2滴/孔，室温显色3-5min，自来水冲洗终止反应，判读结果。凡PVC孔底中心出现兰紫色斑点者为阳性，无色或呈浅灰色斑点(环)者为阴性。
2 结果 ①CSMA致敏白色PVC的最佳蛋白含量选择 将CSMA稀释成不同蛋白含量致敏白色PVC，按前述方法试验，结果显示，CSMA致敏PVC的最佳蛋白含量为50μg/ml。②CSMA和CSA诊断华支睾吸虫病的敏感性 平行试验92份病人血清，抗体阳性均为88份，阳性率95.65%。③CSMA和CSA诊断的特异性及交叉反应 平行试验健康人血清156份，抗体阳性分别为2份和3份，特异性分别为98.72%和98.08%，二者无显著性差异(P>0.05)。试验血吸虫病人血清64份，抗体阳性为2份和1份，交叉反应率分别为3.13%和1.56%，二者无显著差异(P>0.05)。试验包虫病人血清24份，囊虫病人血清5份，HBV标志物阳性血清10份，两种抗原均无交叉阳性。④CSMA和CSA对不同EPG华支睾吸虫病人诊断的敏感性 平行试验47份不同EPG病人血清，两种抗原诊断的阳性率均随EPG增加而升高(表1)。⑤CSMA和CSA的斑点反应强度 88份华支睾吸虫病人血清的斑点反应强度，在百分率上虽有不同，但无显著差异(P>0.05)(表2)。⑥CSMA和CSA诊断效果的重现性 在3天内2人分别对20份阳性和10份阴性血清各试验1次，其阳性及阴性血清的重现率完全相符，阳性血清的斑点强度亦基本一致。
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表1.CSMA和CSA对不同EPG华支睾吸虫病人的诊断阳性率 EPG
检测数
阳性数(%)
CSMA
CSA
<500
23
22(95.65)
22(95.65)
>500
4
4(100.00)
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4(100.00)
≥1000
20
20(100.00)
20(100.00)
表2.88份华支睾吸虫病人血清CSMA和CSA的斑点反应强度 斑点强度
例 数(%)
CSMA
CSA
+
64(72.73)
66(75.00)
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18(20.45)
16(18.10)
6(6.82)
6(6.82)
3 讨论 本文证实，用CSMA作诊断抗原，以白色PVC快速Dot-ELISA法诊断人体华支睾吸虫病及其他寄生虫病，其诊断效果与CSA相同。CSMA和CSA诊断的敏感性均达95.65%，特异性分别达98.71%和98.08%。交叉反应仅出现于血吸虫病，虽CSMA(3.13%)略高于CSA(1.56%)，但无统计学意义。CSMA和CSA对不同EPG病人的诊断效果、斑点反应强度及诊断的重现性亦无特别明显差异。
通常所称的CSA实际上是虫体抗原和代谢抗原的一种混合型抗原，只不过由于制备方法的限制，代谢抗原的含量较少，但其诊断反应的实质仍是二者的共同效应。本文比较试验结果，虽未显示某种抗原特别优越，但从抗原得量上看，本次收集的CSMA的蛋白含量是单一制备CSA的1/3，所以，作者认为在制备CSA之前，先收集CSMA，然后将二者合并后用于诊断，这不仅比剖检虫子立即干燥后作CSA增加了抗原得量，而且在试验中还可能有较好的互补作用。
4 参考文献
1 余海昕，等.华支睾吸虫成虫四种抗原的电泳及血清学分析.中国寄生虫学与寄生虫病杂志(学术交流会论文摘要特辑)1988：87.
2 曾明安，等.诊断华支睾吸虫病的Fast-Dot-ELISA试剂盒的建立及应用.实用寄生虫病杂志 1993；4(1)∶35.
3 徐为宜编.实验免疫学技术.第一版.科学出版社，1979：199.
4 蒋成淦编.酶免疫测定法.第一版.人民卫生出版社，1984：40., 百拇医药
单位：四川省寄生虫病防治研究所 成都 610041
关键词：
实用寄生虫病杂志990208 ELISA检测华支睾吸虫抗体(IgG)，通常是以华支睾吸虫成虫水溶性抗原(CSA)为诊断抗原。余海昕等(1988)报告以华支睾吸虫代谢抗原(CSMA)作诊断抗原，用ABC-ELISA检测感染华支睾吸虫兔血清，证实CSMA有较高的诊断敏感性，与正常兔及感染血吸虫、蛔虫的兔血清反应的OD值低于CSA[1]，但迄今尚未见到有关CSMA用于人体华支睾吸虫病特异抗体(IgG)的检测报告。为此，我们以CSMA和CSA作诊断抗原，用白色PVC快速Dot-ELISA法[2]比较检测人体华支睾吸虫病血清，以评价CSMA诊断的敏感性及特异性。
1 材料及方法
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1.1 材料 ①抗原 i.CSMA 剖检感染华支睾吸虫兔胆管内活虫，择其完整虫子以无菌NS洗净，置于盛有NS的玻璃器皿内，放37℃温箱24h，收集培养NS，再加入NS培养24h，收集培养NS，将两次培养NS合并，4000r/min离心60min，上清即CSMA，于4℃下对NS透析24h，其间换液3次，然后将透析袋悬于4℃冰箱让其自然浓缩至一定量后，加入硫柳汞使终浓度为0.01%，4℃保存备用。ii.CSA 按常法制备，4℃保存备用。CSMA和CSA蛋白含量测定均采用考马斯亮兰G250法[3]。蛋白含量为：CSMA为0.56mg/ml，CSA为1.5mg/ml。致敏白色PVC载体的蛋白量均为50μg/ml。②载体 白色PVC载体系5×2孔直径1cm深0.5cm的平底凹孔板[2]。③试剂 抗原稀释液为pH9.6碳酸盐缓冲液。血清、酶结合物稀释及洗涤液为pH7.4PBS-NP40。酶结合物按改良过碘酸钠法[4]标记的HRP-羊抗人IgG，工作浓度1∶400。显色底物为4CIN-H2O2。④血清 粪检证实的华支睾吸虫病血清92份及血吸虫病血清64份；临床确诊及ELISA阳性的包虫病血清24份和囊虫病血清5份；HBV标志物阳性血清10份；健康人血清156份。试验血清稀释度1∶10。
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1.2 方法 将CSMA和CSA分别点样于白色PVC板上下排各孔致敏，洗涤后加PBS 100μl/孔，将每份待测(或参考)血清各加10μl于上下排对应抗原孔，混匀，置25℃以上室温或37℃温箱15min，用PBS快洗1次，自来水快洗5次，甩干水份，每孔滴酶结合物1滴(约50μl)，如上温育、洗涤，甩干水份，加显色剂2滴/孔，室温显色3-5min，自来水冲洗终止反应，判读结果。凡PVC孔底中心出现兰紫色斑点者为阳性，无色或呈浅灰色斑点(环)者为阴性。
2 结果 ①CSMA致敏白色PVC的最佳蛋白含量选择 将CSMA稀释成不同蛋白含量致敏白色PVC，按前述方法试验，结果显示，CSMA致敏PVC的最佳蛋白含量为50μg/ml。②CSMA和CSA诊断华支睾吸虫病的敏感性 平行试验92份病人血清，抗体阳性均为88份，阳性率95.65%。③CSMA和CSA诊断的特异性及交叉反应 平行试验健康人血清156份，抗体阳性分别为2份和3份，特异性分别为98.72%和98.08%，二者无显著性差异(P>0.05)。试验血吸虫病人血清64份，抗体阳性为2份和1份，交叉反应率分别为3.13%和1.56%，二者无显著差异(P>0.05)。试验包虫病人血清24份，囊虫病人血清5份，HBV标志物阳性血清10份，两种抗原均无交叉阳性。④CSMA和CSA对不同EPG华支睾吸虫病人诊断的敏感性 平行试验47份不同EPG病人血清，两种抗原诊断的阳性率均随EPG增加而升高(表1)。⑤CSMA和CSA的斑点反应强度 88份华支睾吸虫病人血清的斑点反应强度，在百分率上虽有不同，但无显著差异(P>0.05)(表2)。⑥CSMA和CSA诊断效果的重现性 在3天内2人分别对20份阳性和10份阴性血清各试验1次，其阳性及阴性血清的重现率完全相符，阳性血清的斑点强度亦基本一致。
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表1.CSMA和CSA对不同EPG华支睾吸虫病人的诊断阳性率 EPG
检测数
阳性数(%)
CSMA
CSA
<500
23
22(95.65)
22(95.65)
>500
4
4(100.00)
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4(100.00)
≥1000
20
20(100.00)
20(100.00)
表2.88份华支睾吸虫病人血清CSMA和CSA的斑点反应强度 斑点强度
例 数(%)
CSMA
CSA
+
64(72.73)
66(75.00)
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18(20.45)
16(18.10)
6(6.82)
6(6.82)
3 讨论 本文证实，用CSMA作诊断抗原，以白色PVC快速Dot-ELISA法诊断人体华支睾吸虫病及其他寄生虫病，其诊断效果与CSA相同。CSMA和CSA诊断的敏感性均达95.65%，特异性分别达98.71%和98.08%。交叉反应仅出现于血吸虫病，虽CSMA(3.13%)略高于CSA(1.56%)，但无统计学意义。CSMA和CSA对不同EPG病人的诊断效果、斑点反应强度及诊断的重现性亦无特别明显差异。
通常所称的CSA实际上是虫体抗原和代谢抗原的一种混合型抗原，只不过由于制备方法的限制，代谢抗原的含量较少，但其诊断反应的实质仍是二者的共同效应。本文比较试验结果，虽未显示某种抗原特别优越，但从抗原得量上看，本次收集的CSMA的蛋白含量是单一制备CSA的1/3，所以，作者认为在制备CSA之前，先收集CSMA，然后将二者合并后用于诊断，这不仅比剖检虫子立即干燥后作CSA增加了抗原得量，而且在试验中还可能有较好的互补作用。
4 参考文献
1 余海昕，等.华支睾吸虫成虫四种抗原的电泳及血清学分析.中国寄生虫学与寄生虫病杂志(学术交流会论文摘要特辑)1988：87.
2 曾明安，等.诊断华支睾吸虫病的Fast-Dot-ELISA试剂盒的建立及应用.实用寄生虫病杂志 1993；4(1)∶35.
3 徐为宜编.实验免疫学技术.第一版.科学出版社，1979：199.
4 蒋成淦编.酶免疫测定法.第一版.人民卫生出版社，1984：40., 百拇医药