Wolbachia的wsp基因片段在我国尖音库蚊复合组蚊虫中的PCR扩增
作者：宋社吾 赵彤言 董言德 蒋书楠 陆宝麟
单位：宋社吾(西南农业大学植保系，重庆 400716)；赵彤言(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)；董言德(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)；蒋书楠(西南农业大学植保系，重庆 400716)；陆宝麟(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)
关键词：尖音库蚊复合组；聚合酶链反应；Wolbachia
寄生虫与医学昆虫学报000207摘要 应用Wolbachia的wsp基因特异引物，通过PCR方法对我国尖音库蚊复合组的4个亚种的实验室种群以及6个地理株种群进行了检测。结果都能扩增出600bp的特异性DNA片段。表明Wolbachia在我国尖音库蚊复合组蚊虫中的侵染较为普遍，提示其可能与复合组中蚊虫杂交的胞质不融合现象有关。
, http://www.100md.com PCR OF WSP GENE OF WOLBACHIA IN MOSQUITOES
OF CULEX PIPIENS COMPLEX IN CHINA
Song Shewu
(Department of Plant Protection,Southwest Agricultural University,Chongqing 400716)
Zhao Tongyan
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Dong Yande
, 百拇医药 (Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Jiang Shunan
(Department of Plant Protection,Southwest Agricultural University,Chongqing 400716)
Lu Baolin
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Abstract Specific primers derived from the wsp gene sequence were used to amplify DNA of Wolbachia from those mosquitoes of Culex pipiens complex in China by polymerase chain reaction (PCR). The characteristic 600bp products were observed after amplification of extracts from 4 subspecies and 6 geographical strains of Culex pipiens. Complex in China the findings indicate that the infections of Wolbachia are widespread in those mosquitoes,and the existence of Wolbachia may be related to cytoplasmic incompatibility in Culex pipiens complex in China.
, 百拇医药
Key words Culex pipiens complex PCR Wolbachia
Wolbachia属是广泛存在于节肢动物体内的立克次体微生物，引起寄主的大量遗传改变。主要表现为诱导胞质不融合(cytoplasmic incompatibility,CI)、单性生殖(parthenogenesis)以及雌性化。特别是胞质不融合现象在一种快速种的形成机制中所起的作用，正日益引起人们的关注。由于母系遗传的Wolbachia能够很快地传遍整个昆虫种群，人们还希望能通过Wolbachia将不利于病原体传播的外源基因导入媒介种群内，从而为遗传防治提供基础(Werren，1997)。wsp基因是目前报道的Wolbachia基因中进化最快的一个基因，可依据它及其序列对Wolbachia的寄主进行PCR检测以及Wolbachia品系的系统发育分析(Braig et al.,1998;Zhou et al.,1998)。尖音库蚊复合组是一个重要的媒介复合组，其4个亚种间的分类地位尚有争议，而且有现象提示其亚种之间的杂交存在有胞质不融合现象(赵彤言等，1998)。为了了解我国尖音库蚊复合组蚊虫中Wolbachia的侵染情况，从而进一步探讨复合组中各成员的分化及其与微生物的关系，本文对我国尖音库蚊复合组蚊虫进行了Wolbachia的PCR检测。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 蚊种及来源
采用本研究室尖音库蚊复合组4个实验种群，包括淡色库蚊(Cx.pipiens pallens)北京株，致倦库蚊(Cx.pipiens quinquefasciatus)广州株，尖音库蚊(Cx.pipiens pipiens)乌鲁木齐株和骚扰库蚊(Cx.pipiens molestus)北京株。另外，还分别采集了尖音库蚊复合组的威海株，合肥株，大连株，汕头株，福州株和北京株等6个地理株。
1.2 蚊虫体内Wolbachia的DNA制备
解剖多只蚊虫的卵巢或精巢置于装有300μL DNA提取裂解液(100mmol/L Tris\|HCL,pH8.0,50mmol/L NaCl,50 mmol/L EDTA,1% SDS,0.15 mmol/L精胺,0.5mmol/L亚精胺)的离心管中，加入2μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，50℃水浴2h以上。用水饱和酚(pH8.0)和氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2次，离心(9 000r/min 10min)上清液中加入0.2倍体积的乙酸铵溶液(10mol/L)和2倍体积的无水乙醇，-20℃保存2h以上离心，沉淀用冷70%乙醇洗涤后离心，沉淀凉干后溶于10μL双蒸灭菌水中，4℃保存。
, 百拇医药
1.3 PCR扩增蚊虫体内Wolbachia的wsp基因片段
使用1对引物可以从所有Wolbachia品系中扩增出590～632bp左右的目的片段(Zhou et al.,1998)。上游引物为：5′TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC，下游引物为：5′AAAAATTAAACGCTACTCCA。扩增体积为20μL，包括：13.5μL dd H2O,2μL 10×buffer,2μL 25mmol/L MgCl2,0.5μL dNTP s(10mmol/L each),0.5μL 20μmol/L上游和下游引物以及1个单位的Taq DNA聚合酶。扩增条件：95℃预变性3min；94℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 1min扩增35个循环；最后72℃延伸7min。取以上PCR产物10μL，用1.4%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
2 结果
, 百拇医药
用wsp基因的特异性引物，从我国尖音库蚊复合组的4个亚种实验室种群和6个地理株的DNA中均扩增出Wolbachia的目的片段，扩增片段长度为600bp，而空白(水)的对照中未扩增出Wolbachia的特异性目的片段(见图1和图2)。在实验室种群中，分雌雄提取DNA。雌雄个体均能扩增出600bp的目的片段。
图1 尖音库蚊复合组4个亚种中特异DNA片段PCR产物电泳图
Fig.1 Eletrophoresis of PCR products obtained by amplification
of DNA extracted from 4 subspecies of C.pipiens complex
1.尖音库蚊♀(Cx.pipiens pipiens)；2.淡色库蚊♀(Cx.pipiens pallens)；
, http://www.100md.com
3.骚扰库蚊♀(Cx.pipiens molestus)；4.致倦库蚊♀(Cx.pipiens quinquefasciatus)；
5.DNA分子量标准(Molecular size standards)；6.尖音库蚊(Cx.pipiens pipiens)；
7.淡色库蚊(Cx.pipiens pallens)；8.骚扰库蚊(Cx.pipiens molestus)；
9.致倦库蚊(Cx.pipiens quinquefasciatus)；10.空白(水)对照(No DNA control)
图2 尖音库蚊复合组6个地理株中特异DNA片段PCR产物电泳图
, http://www.100md.com
Fig.2 Eletrophoresis of PCR products obtained by amplification
of DNA extracted from 6 geographical strains of C.pipiens complex
1.DNA分子量标准(Molecular size standards)；2.合肥株(Hefei)；
3.大连株(Dalian)；4.威海株(Weihai)；5.北京株(Beijing)；6.福州株(Fuzhou)；
7.汕头株(Shantou)；8.空白(水)对照(No DNA control)
3 讨论
自1942年Hertig 和Wolbach在尖音库蚊的生殖组织中发现Wolbachia以来的，迄目前为止，已在80余种昆虫、17种甲壳纲等足目鼠妇和1种螨类及线虫中有发现。Wolbahia分布广泛，受侵染寄主种类数目急剧增加，并且扩散的界限尚不清楚。我们的检测结果表明，在我国尖音库蚊复合组的4个亚种实验室种群及采集于我国华北，华东和华南的尖音库蚊复合组不同地理株蚊虫中Wolbachia的侵染十分普遍。
, 百拇医药
Wolbachia诱导的CI是一种在精子和卵子之间的生殖不融合，通常是杂交后代在胚胎期死亡。CI一般有二种形式，单向的不融合典型地出现在受Wolbachia感染的雄性精子与一个未受感染的卵子受精时，而反之是可融合的。双向的不融合典型地出现在雌雄包含有不同的Wolbachia品系或不同浓度时(Werren，1997)。赵彤言等(1998)发现我国尖音库蚊复合组中骚扰库蚊与尖音库蚊，淡色库蚊以及致倦库蚊之间杂交可能存在有胞质不融合的现象。我们的研究发现我国的尖音库蚊复合组蚊虫中普遍存在有Wolbachia的侵染，提示它们之间胞质不融合现象可能与Wolbachia的存在有关。我们正在进行其wsp基因的序列测定和系统发育关系研究，结果将另文报告。
国家自然科学基金资助项目，批准号：39770674
参考文献
1，赵彤言，陆宝麟.1996.中国尖音库蚊复合组杂交的研究.动物分类学报，21(2)：218～223.
, http://www.100md.com
2，赵彤言，陆宝麟.1998.骚扰库蚊与尖音库蚊复合组其它亚种杂交的研究.寄生虫与医学昆虫学报，5(1)：41～44.
3，Braig,H.R.,W.Zhou,S.L.Dobson et al.1998 Cloning and characterization of a gene encoding the major surface protein of the bacterial endosymbiont Wolbachia. J.Bacteriol.180(9)：2373～2378.
4，Werren,J.H. 1997 Biology of Wolbachia. Annu.Rev.Entomol.42：587～609.
5，Zhou,W.,F.Rousset and S.O'Neill 1998 Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proc. R.Soc.Lond. B 265：509～515.
收稿日期：2000-03-17, 百拇医药
单位：宋社吾(西南农业大学植保系，重庆 400716)；赵彤言(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)；董言德(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)；蒋书楠(西南农业大学植保系，重庆 400716)；陆宝麟(军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071)
关键词：尖音库蚊复合组；聚合酶链反应；Wolbachia
寄生虫与医学昆虫学报000207摘要 应用Wolbachia的wsp基因特异引物，通过PCR方法对我国尖音库蚊复合组的4个亚种的实验室种群以及6个地理株种群进行了检测。结果都能扩增出600bp的特异性DNA片段。表明Wolbachia在我国尖音库蚊复合组蚊虫中的侵染较为普遍，提示其可能与复合组中蚊虫杂交的胞质不融合现象有关。
, http://www.100md.com PCR OF WSP GENE OF WOLBACHIA IN MOSQUITOES
OF CULEX PIPIENS COMPLEX IN CHINA
Song Shewu
(Department of Plant Protection,Southwest Agricultural University,Chongqing 400716)
Zhao Tongyan
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Dong Yande
, 百拇医药 (Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Jiang Shunan
(Department of Plant Protection,Southwest Agricultural University,Chongqing 400716)
Lu Baolin
(Institute of Microbiology & Epidemiology,AMMS,Beijing,100071)
Abstract Specific primers derived from the wsp gene sequence were used to amplify DNA of Wolbachia from those mosquitoes of Culex pipiens complex in China by polymerase chain reaction (PCR). The characteristic 600bp products were observed after amplification of extracts from 4 subspecies and 6 geographical strains of Culex pipiens. Complex in China the findings indicate that the infections of Wolbachia are widespread in those mosquitoes,and the existence of Wolbachia may be related to cytoplasmic incompatibility in Culex pipiens complex in China.
, 百拇医药
Key words Culex pipiens complex PCR Wolbachia
Wolbachia属是广泛存在于节肢动物体内的立克次体微生物，引起寄主的大量遗传改变。主要表现为诱导胞质不融合(cytoplasmic incompatibility,CI)、单性生殖(parthenogenesis)以及雌性化。特别是胞质不融合现象在一种快速种的形成机制中所起的作用，正日益引起人们的关注。由于母系遗传的Wolbachia能够很快地传遍整个昆虫种群，人们还希望能通过Wolbachia将不利于病原体传播的外源基因导入媒介种群内，从而为遗传防治提供基础(Werren，1997)。wsp基因是目前报道的Wolbachia基因中进化最快的一个基因，可依据它及其序列对Wolbachia的寄主进行PCR检测以及Wolbachia品系的系统发育分析(Braig et al.,1998;Zhou et al.,1998)。尖音库蚊复合组是一个重要的媒介复合组，其4个亚种间的分类地位尚有争议，而且有现象提示其亚种之间的杂交存在有胞质不融合现象(赵彤言等，1998)。为了了解我国尖音库蚊复合组蚊虫中Wolbachia的侵染情况，从而进一步探讨复合组中各成员的分化及其与微生物的关系，本文对我国尖音库蚊复合组蚊虫进行了Wolbachia的PCR检测。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 蚊种及来源
采用本研究室尖音库蚊复合组4个实验种群，包括淡色库蚊(Cx.pipiens pallens)北京株，致倦库蚊(Cx.pipiens quinquefasciatus)广州株，尖音库蚊(Cx.pipiens pipiens)乌鲁木齐株和骚扰库蚊(Cx.pipiens molestus)北京株。另外，还分别采集了尖音库蚊复合组的威海株，合肥株，大连株，汕头株，福州株和北京株等6个地理株。
1.2 蚊虫体内Wolbachia的DNA制备
解剖多只蚊虫的卵巢或精巢置于装有300μL DNA提取裂解液(100mmol/L Tris\|HCL,pH8.0,50mmol/L NaCl,50 mmol/L EDTA,1% SDS,0.15 mmol/L精胺,0.5mmol/L亚精胺)的离心管中，加入2μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，50℃水浴2h以上。用水饱和酚(pH8.0)和氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2次，离心(9 000r/min 10min)上清液中加入0.2倍体积的乙酸铵溶液(10mol/L)和2倍体积的无水乙醇，-20℃保存2h以上离心，沉淀用冷70%乙醇洗涤后离心，沉淀凉干后溶于10μL双蒸灭菌水中，4℃保存。
, 百拇医药
1.3 PCR扩增蚊虫体内Wolbachia的wsp基因片段
使用1对引物可以从所有Wolbachia品系中扩增出590～632bp左右的目的片段(Zhou et al.,1998)。上游引物为：5′TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC，下游引物为：5′AAAAATTAAACGCTACTCCA。扩增体积为20μL，包括：13.5μL dd H2O,2μL 10×buffer,2μL 25mmol/L MgCl2,0.5μL dNTP s(10mmol/L each),0.5μL 20μmol/L上游和下游引物以及1个单位的Taq DNA聚合酶。扩增条件：95℃预变性3min；94℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 1min扩增35个循环；最后72℃延伸7min。取以上PCR产物10μL，用1.4%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
2 结果
, 百拇医药
用wsp基因的特异性引物，从我国尖音库蚊复合组的4个亚种实验室种群和6个地理株的DNA中均扩增出Wolbachia的目的片段，扩增片段长度为600bp，而空白(水)的对照中未扩增出Wolbachia的特异性目的片段(见图1和图2)。在实验室种群中，分雌雄提取DNA。雌雄个体均能扩增出600bp的目的片段。
图1 尖音库蚊复合组4个亚种中特异DNA片段PCR产物电泳图
Fig.1 Eletrophoresis of PCR products obtained by amplification
of DNA extracted from 4 subspecies of C.pipiens complex
1.尖音库蚊♀(Cx.pipiens pipiens)；2.淡色库蚊♀(Cx.pipiens pallens)；
, http://www.100md.com
3.骚扰库蚊♀(Cx.pipiens molestus)；4.致倦库蚊♀(Cx.pipiens quinquefasciatus)；
5.DNA分子量标准(Molecular size standards)；6.尖音库蚊(Cx.pipiens pipiens)；
7.淡色库蚊(Cx.pipiens pallens)；8.骚扰库蚊(Cx.pipiens molestus)；
9.致倦库蚊(Cx.pipiens quinquefasciatus)；10.空白(水)对照(No DNA control)
图2 尖音库蚊复合组6个地理株中特异DNA片段PCR产物电泳图
, http://www.100md.com
Fig.2 Eletrophoresis of PCR products obtained by amplification
of DNA extracted from 6 geographical strains of C.pipiens complex
1.DNA分子量标准(Molecular size standards)；2.合肥株(Hefei)；
3.大连株(Dalian)；4.威海株(Weihai)；5.北京株(Beijing)；6.福州株(Fuzhou)；
7.汕头株(Shantou)；8.空白(水)对照(No DNA control)
3 讨论
自1942年Hertig 和Wolbach在尖音库蚊的生殖组织中发现Wolbachia以来的，迄目前为止，已在80余种昆虫、17种甲壳纲等足目鼠妇和1种螨类及线虫中有发现。Wolbahia分布广泛，受侵染寄主种类数目急剧增加，并且扩散的界限尚不清楚。我们的检测结果表明，在我国尖音库蚊复合组的4个亚种实验室种群及采集于我国华北，华东和华南的尖音库蚊复合组不同地理株蚊虫中Wolbachia的侵染十分普遍。
, 百拇医药
Wolbachia诱导的CI是一种在精子和卵子之间的生殖不融合，通常是杂交后代在胚胎期死亡。CI一般有二种形式，单向的不融合典型地出现在受Wolbachia感染的雄性精子与一个未受感染的卵子受精时，而反之是可融合的。双向的不融合典型地出现在雌雄包含有不同的Wolbachia品系或不同浓度时(Werren，1997)。赵彤言等(1998)发现我国尖音库蚊复合组中骚扰库蚊与尖音库蚊，淡色库蚊以及致倦库蚊之间杂交可能存在有胞质不融合的现象。我们的研究发现我国的尖音库蚊复合组蚊虫中普遍存在有Wolbachia的侵染，提示它们之间胞质不融合现象可能与Wolbachia的存在有关。我们正在进行其wsp基因的序列测定和系统发育关系研究，结果将另文报告。
国家自然科学基金资助项目，批准号：39770674
参考文献
1，赵彤言，陆宝麟.1996.中国尖音库蚊复合组杂交的研究.动物分类学报，21(2)：218～223.
, http://www.100md.com
2，赵彤言，陆宝麟.1998.骚扰库蚊与尖音库蚊复合组其它亚种杂交的研究.寄生虫与医学昆虫学报，5(1)：41～44.
3，Braig,H.R.,W.Zhou,S.L.Dobson et al.1998 Cloning and characterization of a gene encoding the major surface protein of the bacterial endosymbiont Wolbachia. J.Bacteriol.180(9)：2373～2378.
4，Werren,J.H. 1997 Biology of Wolbachia. Annu.Rev.Entomol.42：587～609.
5，Zhou,W.,F.Rousset and S.O'Neill 1998 Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proc. R.Soc.Lond. B 265：509～515.
收稿日期：2000-03-17, 百拇医药
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