反义核酸药物的研究现状
作者：李学军
单位：北京医科大学基础医学院药理学系，北京100083
关键词：反义寡核苷酸；反义药物；基因治疗
生理科学进展000205 摘要 反义药物以其合理设计药物的可能性和精确的特异性广泛吸引了人们的注意，但反义药物的研究并非如人们最初预想的那样简单。 本文从其特异性，稳定性，透过靶细胞的能力，作用强度，活性判定，给药途径，安全性和毒性，生产成本等诸方面对反义药物的研究现状，现存问题进行了综述。相信伴随这些问题的解决，反义药物很可能成为药典的一部分，给疾病的治疗带来益处。
学科分类号 Q786；R966
Current Status of Antisense Drugs
LI Xue-Jun
, 百拇医药
(Department of Pharmacology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
Abstract The antisense was first imagined as the therapeutic drug at the end of 1970. After 20 years the antisense drugs have been hitting into the market from laboratory and clinical research. Antisense captures general attention with their promise of rational drug design and exquisite specification. But antisense drugs are far more difficult to produce than were originally anticipated. This article reviewed the current situation and present questions involved in their specificity, stability, potency, toxicology , intracellular delivery, administration routes and costs of manufacture, etc. It is likely that the antisense drugs will be a part of the pharmacopoeia in the future and benefit for treatment of human diseases with the solution of present questions.
, 百拇医药
Key words Antisense oligonucleotides; Antisense drugs; Gene therapy
反义核酸药物即反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ODNs )其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA, 使其丧失功能。反义核酸药物是药理学的新领域或革命[1]， 即：新的药物——反义寡核苷酸；新的药物受体—— mRNA；新的受体结合方式—— Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应: (1) RNase H介导的靶RNA 的降解；(2)抑制DNA 的复制和转录及转录后的加工和翻译等。应该说，ODNs治疗比传统的治疗有更高的特异性。从70年代末到现在二十年过去了，反义核酸药物已从实验室研究进入市场。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen上市后，人们对反义疗法更为重视。
ODNs可以作为研究工具，用于对一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作为治疗药物用于病毒性疾病、心血管系统疾病、癌症和感染性疾病等许多疾病的治疗。然而，开发这些药物并非易事，首先，消除单个基因的能力还需要进一步的证实，而且一些不期望产生的非反义作用逐渐显现出来。虽然，某些非反义作用也肯定有治疗价值，但由于非反义作用通常是不可预知的，因此，难以以此来合理设计药物[2]。
, 百拇医药
目前的研究现状及存在的问题主要有以下几个方面：
一、 ODNs能否以序列依赖的方式调节特异蛋白的功能
反义核酸药物尽管存在一些非特异的作用，但仍能在体内外结合到特异的RNA上，选择性地减少靶基因的产生而产生药理学作用。
为了解决这一问题，科学家通常需要设计多个针对不同RNA区域的ODNs，找出作用较强和选择性较高的ODNs；另外，在设计反义化合物时，注意选择特别易于遭受攻击的靶基因或靶点[2]；此外，反义ODN的长度也与特异性有关，一般来说， 越长其特异性越高， 大于17个碱基的寡核苷酸与非靶基因杂交的可能性不大，但在体内经过代谢过程可能使链长度缩短，仍有可能与非靶基因结合。目前，反义ODN 的长度多为15～20个碱基，一般可在统计学上保证其特异性。总之，经过认真的选择，设立合适的对照并作出剂量反应曲线，通过大量和仔细的实验，ODNs作为有效的研究工具和治疗药物是可能的。
, 百拇医药
需要提及的是，理论上靶基因或靶序列在基因组里只出现一次， 但目前还从未证实反义核酸药物具有只敲除一个基因的能力[3]。
另外，一些ODNs的作用来自于它的非反义作用，这似乎是不利的，但只要该作用有益，而且有高的治疗指数，仍然有临床应用价值。如抗凝血酶的寡核苷酸，就以其非反义机制产生作用，现在该药正在进行临床前的实验。还有另一个非反义寡核苷酸，即整合酶的抑制剂也正作为抗HIV药用于临床实验[4]。
二、ODNs在体内的稳定性
反义寡核苷酸必须不被内源性核酸酶降解，并被送到靶细胞内才能产生最大的效应。ODNs虽能用病毒载体转入细胞内，但考虑到安全性和临床的应用，促使人们研究和开发非病毒转移系统，即对ODNs作化学修饰和结构改造。
化学修饰可以增加反义ODN 的稳定性。方法主要有：(1)改变立体构型，如由天然的糖苷键改为α型；(2)ODN的磷酸二酯键被甲基、乙基和硫等化学基团取代和修饰；(3)ODN的末端修饰，如连接疏水基团——胆固醇；(4)肽核酸 (peptide nucleic acids ，PNAs)用多肽取代磷酸二酯键，肽核酸在化学上与肽和蛋白质更为接近,是一类非常有希望的基因治疗药物，最近有许多研究进展。开发PNA作为治疗药物在不久的将来可能产生突破，PNA 的反义活性已在培养的神经细胞甚至在大鼠脑内注射后得到证实[5，6]。
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在化学修饰中，硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligodeoxy-nucleotide, PS-ODN)是最为广泛应用的，现在进入临床的所有ODNs几乎都是PS-ODN，称第一代反义药物， 它有良好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导RNase H。在细胞系的研究中，证实它可以抑制靶mRNA的表达长达24～48小时[7]。若重复给药或加以其它修饰，则可延长其作用时间。在整体情况下，PS-ODN 的血浆半衰期(T1/2α和 T1/2β)依给药的剂量和动物种属的不同，可以持续数分钟至数小时不等。 其排泄主要通过尿。它的代谢过程比较复杂，但大部分降解产物似乎都是由3'-外切核酸酶产生的。
应用多种化学修饰将更为有益。最近的研究证实，杂合型和嵌合体结构的反义寡核苷酸表现出与PS-ODN 类似的组织分布， 但体内稳定性可明显提高，如T1/2延长。正在研究的第二代反义药物主要是嵌合体结构，以PS-ODN为核心，两翼核苷酸序列上核糖的2'位被其它基团所修饰[8], 已显示良好的前景。第二代寡核苷酸的优越之处在于：对核酸酶的抗性增高；其诱导RNase H 酶剪切的活性得到保持和提高；其生物活性与PS-ODN相当，且大大改善了由PS-ODN所造成的毒副作用(主要由于降低了寡核苷酸骨架的多阴离子性质)。
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三、ODNs的体内过程及其穿透细胞的能力
反义分子必需能以一定的数量接近靶组织，并穿入细胞膜进入细胞内方能产生作用。
目前对ODNs与血浆成分的相互作用，它在组织中的分布和细胞内的蓄积的机制了解甚少。 PS-ODN iv, ip 和皮下给药后能迅速从血浆分布到除脑以外的外周组织。在肝、肾的蓄积浓度最高。其它组织如肠、脾、皮肤和骨髓也可达到高浓度[7]。早期(约在给药后2小时)与细胞外成分结合的ODNs和一些细胞内的ODNs可以出现。后期，ODNs可以大量出现在细胞内，如在肾脏的近曲小管上皮细胞内[9]。
现有的研究结果证实，ODNs是可以进入细胞的，但机制尚不清楚。不同的ODNs进入细胞的方式可能有所不同，在哺乳动物细胞，ODNs可以通过主动过程进入细胞内，如通过受体的介导或通过细胞内吞作用进入细胞内与膜结合的囊胞中，此外也有其它方式。 1992年，Bidker 等从 CHO成纤维细胞(HL60)和其它一些细胞类型的细胞膜上分离到一种80kD的蛋白，该蛋白可以特异的结合PS-ODN。类似的已分离到的受体蛋白还有79kD和90kD等。
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不同的ODNs进入细胞的难易程度不同， 硫代磷酸-ODN难于透过细胞膜，在细胞内达到平衡的时间比未修饰的ODNs长，且细胞内的蓄积量也较少。但用脂质体包裹，用低密度脂蛋白，或增加反义药物中的含G量，或用新戊酰羟甲基暂时屏蔽PS-ODN的负电荷等方法均有可能增加ODNs透过细胞的能力。此外，应用抗体、肽、碳水化合物和维生素也可以增加ODNs接近靶细胞的能力[7]。
另外，我们知道常规应用的ODNs 和肽核酸不易通过血脑屏障(BBB) ，它仅允许分子量<600 Da的亲脂性分子的通透。 偶联streptavidin (SA) 和转铁蛋白受体 OX26单抗的细胞转移系统可作为通用载体转运单生物素化的肽、ODNs或PNAs到表达转铁蛋白受体的组织。 OX26单抗通过BBB上的转铁蛋白受体的transcytosis转运反义核酸药物进入血脑屏障[10]。 3'-生物素化的磷酸二酯(PO)-ODN可完全保护ODN抵抗血清和细胞的 3'-核酸外切酶，促进核酸酶H 的偶联和激活，在Alzheimer's 病和HIV-AIDS的模型中，这些转移系统显著增加细胞摄取PO-ODNs并加强其反义效应。 但生物素化的PO-ODNs 和PO-PS-ODN 杂交体易于在体内被核酸内切酶降解。 也有报道在3'-末端生物素化的PS-ODNs在体内代谢稳定,并抵抗核酸外切酶和内切酶的降解，然而由于这些低聚物与血浆蛋白有强的结合，难于转移到脑内。另外由OX26-SA作转移载体的PS-ODNs 也很少能通过静脉给药跨越BBB转运进入脑。 而PNAs不仅抵抗核酸外切酶/内切酶及蛋白酶的降解，而且发现这些分子在氨基末端被生物素化并由OX26-SA作转移系统后，其脑的摄取水平可与吗啡相比。总之，多项实验证实 PNA-OX26-SA偶联体可保持对靶mRNA的有效识别并使之灭活，提示 PNA-OX26-SA 偶联体是转移药物到脑组织的最好的反义分子[10]。
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值得注意的是，在培养细胞中观察到的现象与整体给药的情况并不一致。如反义 PS-ODN为多聚阴离子，不易透过细胞膜，体外实验常需要脂质体的包裹导入细胞，但在动物实验中，反义药物能顺利的到达靶器官，其机制还不清楚。
四、ODNs抑制靶基因的表达能力
ODNs是否能接近靶基因，与靶基因杂交？回答这个问题很复杂，但认为在某些细胞是可以的。粗略估计在一个细胞内mRNA的浓度为20 nmol/L(可以表达约1万个拷贝的靶基因)。 药理学剂量的ODNs为3～6 mg/kg ，在肾脏和肝脏可以达到5～15和1～5 μmol/L。有些组织可能会<0.05～1μmol/L(如脑)，但在某些细胞内，其浓度可增加到10倍以上。理论上，这样的浓度远超过实际mRNA的浓度，ODNs如能接近靶基因，应能抑制靶基因的表达。
ODNs 进入细胞后可分布于胞质和核内， 也可少量结合在细胞膜上。 这取决于ODNs的种类、性质以及进入细胞的方式。 而与其长度、序列和细胞系无关。多数研究报道表明PS-ODN以时间依赖的方式从液泡中分布进入胞质和核内。脂质体包裹的方式有助于PS-ODN进入细胞核。将PS-ODN微量注射入细胞质，将最终定位在细胞核。若PS-ODN 仅定位在内含体中，将降低其在活性部位胞质和核内的反义效率。
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五、增加ODNs的作用强度
至少有三种机制可以增加ODNs在体内的作用强度：加强其与受体的亲和力；降低其与非受体的相互作用；增加其转移到位于亚细胞结构中受体的效率。化学修饰可以使ODNs与靶mRNA的亲和力增加，这些修饰也同时降低ODNs与其它蛋白质的相互作用，从而达到前两种目的。但加强其转移到细胞内的效率仍无太大的进展[7]。
六、判断活性ODNs
如上所述，对于一个mRNA来说不是所有的靶点都是容易达到的。一般认为，设计反义药物选择的靶点一般为mRNA的5'端起始密码AUG周围和核糖体的装配部位，反义药物容易达到，活性较高。但研究表明mRNA的其它位置亦可成为设计的靶点，尤其是3'端的非翻译区。Monia等选择C-raf mRNA 的5'端、3'端以及编码区的34个 位置作靶点设计反义药物，结果作用于3’非翻译区的ISIS5132 的活性最强[11]。
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目前，RNA高亲和力靶点的判定全凭经验随机筛选ODNs， 比较盲目，既不经济，也不知是否真的拿到了高亲和力的ODNs。鉴定的方法需要改进，比较理想的是应用计算机手段，但由于对RNA结构了解的限制，近年之内难有大的进展。
七、口服及其它给药途径的研究
现行ODNs采取非口服给药方式。但口服给药对于疾病的长期治疗可能更为方便。1995年，Agrawal及其同事应用 2'-氧位甲基硫代磷酸酯寡核苷酸，使其在消化道的稳定性加强，口服的生物利用度增加。如对ODNs作进一步的化学修饰，口服给药将是可行的。
当然也应研究除口服以外的其它非注射给药途径。病灶周围的局部用药，可能会产生更为明显的优越性，提高局部的药物浓度从而增加特异性并降低毒性，同时降低药物的成本。实际上，目前反义核酸药物已能通过多种途径给药，包括气溶胶的吸入、滴鼻、iv和腹腔注射。
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八、降低毒性
关于毒性问题，目前尚未很好的解决。生命受到威胁的AIDS病和癌症病人通常可以耐受一定程度的非特异毒性。
反义药物的毒性依发生的原因不同可分为两类：一种是以药效学为基础的毒性，是其反义作用过强或与非靶基因产生反义作用而导致的毒性，应尽量避免设计与非靶基因杂交的反义寡核苷酸。另一种毒性是ODNs与其它分子(如蛋白)相互作用的结果， 可能有序列特异性也可能与序列无关。多数PS-ODN的毒性是由于此种原因所致， 由于它们的生物物理性质相似， 毒性谱也相似。主要有：补体激活、免疫刺激、凝血时间延长、肝肾毒性、致死性的血液动力学改变等。
提高反义寡核苷酸的特异性，对其进行化学修饰，或封闭硫代磷酸链中的多阴离子，或采用局部给药的方式等将有可能增加其特异性，从而减少剂量，降低其毒性。此外，选择良好的释药系统将增加作用强度而降低不良反应，最终也将降低药物的消耗和费用。目前正在开发新的ODNs，在这方面将有所改进，以产生更特异的作用。
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九、关于生产ODNs的成本
随着合成化学的发展，在一些实验室已能应用常规自动装置合成从微克级到毫克级的ODNs。另外通过改进的合成装置，已发展到从毫克到克级，甚至有报道一次循环已能产生400克纯化的ODNs[4]。这方面的技术发展迅速，无疑将最终降低生产ODNs的费用。
十、展望
总之，ODNs的未来取决于上述问题的解决，及临床实验的成功结果。
随着基因组序列信息的不断增加，科学家需要有效的研究方法以迅速证实靶基因的生物功能，并希望能开发出与靶基因相互作用的有效治疗药物。ODNs是最能逻辑解决这些问题的工具，也是合理设计和开发药物的重要途径。
另外，反义核酸药物在临床上有较强的发展潜力，因为从化学合成开始到临床前药动学及毒理学研究的设计，都是从分子靶到分子靶。Science 杂志1998年7月报道了第一个通过FDA咨询委员会的反义药物即用于治疗AIDS病人巨细胞病毒感染的视网膜炎的fomivirsen (或称Vitravene)[12]，它虽需要直接注射入眼内，但有超过其它一些抗病毒药物的优点：作用靶点限局，仅造成轻微的不良反应，如眼内压升高和炎症，这些不良反应一般是短暂的，并可通过局部使用甾体激素得到缓解[13]。Fomivirsen的上市可以说是开发反义药物的一个里程碑，而在5年前，许多人还认为反义核酸药物只是一种欺骗。
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相信不久的将来反义药物很可能成为药典的一部分，给疾病的治疗带来益处，反义药物的发展具有光明的前景。
美国洛克菲勒基金资助项目(RF93-63＃82)
参考文献
1，Crooke ST. Oligonucleotide analogs might be designed to bind to mRNA. Anticancer drug Des， 1997，12∶311～313.
2，Branch AD. A good antisense molecule is hard to find. Trends Biochem Sci， 1998， 23∶45～50.
3，Birikh KR,Heaton PA， Eckstein F. The structure, function and application of the hammerhead ribozyme. Eur J Biochem， 1997，245∶1～16.
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4，Akhtar S, Agrawal S. In vivo studies with antisense oligonucleotides. Trends Phamacol Sci， 1997，18∶12～18.
5，Nielsen PE. Applications of peptide nucleic acids.Curr Opin Biotechnol， 1999，10∶71～75.
6，Nielsen PE. Peptide nucleic acids as therapeutic agents. Curr Opin Struct Biol， 1999， 9∶353～357.
7，Bennett CF.Antisense oligonucleotides:is the glass half full or half empty? Biochem Pharmacol,1998，53∶9～19.
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8，Monia BP. First and second generation antisense inhibitors targeted to human c-raf kinase: in vitro and in vivo studies. Anticancer Drug Des， 1997， 12∶327～339.
9，Butler M,Strecker K,Bennett CF.Cellular distribution of phosphorothioate oligodeoxynucleotides in normal rodent tissues.Lab Invest,1997，77∶379.
10，Boado RJ, Tsukamoto H, Pardridge WM. Alzheimer's disease and cerebral AIDS. Drug delivery of antisense molecules to the brain for treatment of Alzheimer's disease and cerebral AIDS. J Pharm Sci， 1998， 87∶1308～1315.
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11，Monia BP, Johnston JF, Geiger T, et al. Antitumor activity of a phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide targeted against C-raf kinase. Nat Med， 1996， 2∶668～675.
12，ScienceScop. Green light for antisense drug. Science， 1998， 281∶625.
13，Perry CM， Balfour JA. Fomivirsen. Drugs， 1999， 57∶375～380.
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关键词：反义寡核苷酸；反义药物；基因治疗
生理科学进展000205 摘要 反义药物以其合理设计药物的可能性和精确的特异性广泛吸引了人们的注意，但反义药物的研究并非如人们最初预想的那样简单。 本文从其特异性，稳定性，透过靶细胞的能力，作用强度，活性判定，给药途径，安全性和毒性，生产成本等诸方面对反义药物的研究现状，现存问题进行了综述。相信伴随这些问题的解决，反义药物很可能成为药典的一部分，给疾病的治疗带来益处。
学科分类号 Q786；R966
Current Status of Antisense Drugs
LI Xue-Jun
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Abstract The antisense was first imagined as the therapeutic drug at the end of 1970. After 20 years the antisense drugs have been hitting into the market from laboratory and clinical research. Antisense captures general attention with their promise of rational drug design and exquisite specification. But antisense drugs are far more difficult to produce than were originally anticipated. This article reviewed the current situation and present questions involved in their specificity, stability, potency, toxicology , intracellular delivery, administration routes and costs of manufacture, etc. It is likely that the antisense drugs will be a part of the pharmacopoeia in the future and benefit for treatment of human diseases with the solution of present questions.
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Key words Antisense oligonucleotides; Antisense drugs; Gene therapy
反义核酸药物即反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ODNs )其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA, 使其丧失功能。反义核酸药物是药理学的新领域或革命[1]， 即：新的药物——反义寡核苷酸；新的药物受体—— mRNA；新的受体结合方式—— Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应: (1) RNase H介导的靶RNA 的降解；(2)抑制DNA 的复制和转录及转录后的加工和翻译等。应该说，ODNs治疗比传统的治疗有更高的特异性。从70年代末到现在二十年过去了，反义核酸药物已从实验室研究进入市场。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen上市后，人们对反义疗法更为重视。
ODNs可以作为研究工具，用于对一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作为治疗药物用于病毒性疾病、心血管系统疾病、癌症和感染性疾病等许多疾病的治疗。然而，开发这些药物并非易事，首先，消除单个基因的能力还需要进一步的证实，而且一些不期望产生的非反义作用逐渐显现出来。虽然，某些非反义作用也肯定有治疗价值，但由于非反义作用通常是不可预知的，因此，难以以此来合理设计药物[2]。
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目前的研究现状及存在的问题主要有以下几个方面：
一、 ODNs能否以序列依赖的方式调节特异蛋白的功能
反义核酸药物尽管存在一些非特异的作用，但仍能在体内外结合到特异的RNA上，选择性地减少靶基因的产生而产生药理学作用。
为了解决这一问题，科学家通常需要设计多个针对不同RNA区域的ODNs，找出作用较强和选择性较高的ODNs；另外，在设计反义化合物时，注意选择特别易于遭受攻击的靶基因或靶点[2]；此外，反义ODN的长度也与特异性有关，一般来说， 越长其特异性越高， 大于17个碱基的寡核苷酸与非靶基因杂交的可能性不大，但在体内经过代谢过程可能使链长度缩短，仍有可能与非靶基因结合。目前，反义ODN 的长度多为15～20个碱基，一般可在统计学上保证其特异性。总之，经过认真的选择，设立合适的对照并作出剂量反应曲线，通过大量和仔细的实验，ODNs作为有效的研究工具和治疗药物是可能的。
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需要提及的是，理论上靶基因或靶序列在基因组里只出现一次， 但目前还从未证实反义核酸药物具有只敲除一个基因的能力[3]。
另外，一些ODNs的作用来自于它的非反义作用，这似乎是不利的，但只要该作用有益，而且有高的治疗指数，仍然有临床应用价值。如抗凝血酶的寡核苷酸，就以其非反义机制产生作用，现在该药正在进行临床前的实验。还有另一个非反义寡核苷酸，即整合酶的抑制剂也正作为抗HIV药用于临床实验[4]。
二、ODNs在体内的稳定性
反义寡核苷酸必须不被内源性核酸酶降解，并被送到靶细胞内才能产生最大的效应。ODNs虽能用病毒载体转入细胞内，但考虑到安全性和临床的应用，促使人们研究和开发非病毒转移系统，即对ODNs作化学修饰和结构改造。
化学修饰可以增加反义ODN 的稳定性。方法主要有：(1)改变立体构型，如由天然的糖苷键改为α型；(2)ODN的磷酸二酯键被甲基、乙基和硫等化学基团取代和修饰；(3)ODN的末端修饰，如连接疏水基团——胆固醇；(4)肽核酸 (peptide nucleic acids ，PNAs)用多肽取代磷酸二酯键，肽核酸在化学上与肽和蛋白质更为接近,是一类非常有希望的基因治疗药物，最近有许多研究进展。开发PNA作为治疗药物在不久的将来可能产生突破，PNA 的反义活性已在培养的神经细胞甚至在大鼠脑内注射后得到证实[5，6]。
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在化学修饰中，硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligodeoxy-nucleotide, PS-ODN)是最为广泛应用的，现在进入临床的所有ODNs几乎都是PS-ODN，称第一代反义药物， 它有良好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导RNase H。在细胞系的研究中，证实它可以抑制靶mRNA的表达长达24～48小时[7]。若重复给药或加以其它修饰，则可延长其作用时间。在整体情况下，PS-ODN 的血浆半衰期(T1/2α和 T1/2β)依给药的剂量和动物种属的不同，可以持续数分钟至数小时不等。 其排泄主要通过尿。它的代谢过程比较复杂，但大部分降解产物似乎都是由3'-外切核酸酶产生的。
应用多种化学修饰将更为有益。最近的研究证实，杂合型和嵌合体结构的反义寡核苷酸表现出与PS-ODN 类似的组织分布， 但体内稳定性可明显提高，如T1/2延长。正在研究的第二代反义药物主要是嵌合体结构，以PS-ODN为核心，两翼核苷酸序列上核糖的2'位被其它基团所修饰[8], 已显示良好的前景。第二代寡核苷酸的优越之处在于：对核酸酶的抗性增高；其诱导RNase H 酶剪切的活性得到保持和提高；其生物活性与PS-ODN相当，且大大改善了由PS-ODN所造成的毒副作用(主要由于降低了寡核苷酸骨架的多阴离子性质)。
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三、ODNs的体内过程及其穿透细胞的能力
反义分子必需能以一定的数量接近靶组织，并穿入细胞膜进入细胞内方能产生作用。
目前对ODNs与血浆成分的相互作用，它在组织中的分布和细胞内的蓄积的机制了解甚少。 PS-ODN iv, ip 和皮下给药后能迅速从血浆分布到除脑以外的外周组织。在肝、肾的蓄积浓度最高。其它组织如肠、脾、皮肤和骨髓也可达到高浓度[7]。早期(约在给药后2小时)与细胞外成分结合的ODNs和一些细胞内的ODNs可以出现。后期，ODNs可以大量出现在细胞内，如在肾脏的近曲小管上皮细胞内[9]。
现有的研究结果证实，ODNs是可以进入细胞的，但机制尚不清楚。不同的ODNs进入细胞的方式可能有所不同，在哺乳动物细胞，ODNs可以通过主动过程进入细胞内，如通过受体的介导或通过细胞内吞作用进入细胞内与膜结合的囊胞中，此外也有其它方式。 1992年，Bidker 等从 CHO成纤维细胞(HL60)和其它一些细胞类型的细胞膜上分离到一种80kD的蛋白，该蛋白可以特异的结合PS-ODN。类似的已分离到的受体蛋白还有79kD和90kD等。
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不同的ODNs进入细胞的难易程度不同， 硫代磷酸-ODN难于透过细胞膜，在细胞内达到平衡的时间比未修饰的ODNs长，且细胞内的蓄积量也较少。但用脂质体包裹，用低密度脂蛋白，或增加反义药物中的含G量，或用新戊酰羟甲基暂时屏蔽PS-ODN的负电荷等方法均有可能增加ODNs透过细胞的能力。此外，应用抗体、肽、碳水化合物和维生素也可以增加ODNs接近靶细胞的能力[7]。
另外，我们知道常规应用的ODNs 和肽核酸不易通过血脑屏障(BBB) ，它仅允许分子量<600 Da的亲脂性分子的通透。 偶联streptavidin (SA) 和转铁蛋白受体 OX26单抗的细胞转移系统可作为通用载体转运单生物素化的肽、ODNs或PNAs到表达转铁蛋白受体的组织。 OX26单抗通过BBB上的转铁蛋白受体的transcytosis转运反义核酸药物进入血脑屏障[10]。 3'-生物素化的磷酸二酯(PO)-ODN可完全保护ODN抵抗血清和细胞的 3'-核酸外切酶，促进核酸酶H 的偶联和激活，在Alzheimer's 病和HIV-AIDS的模型中，这些转移系统显著增加细胞摄取PO-ODNs并加强其反义效应。 但生物素化的PO-ODNs 和PO-PS-ODN 杂交体易于在体内被核酸内切酶降解。 也有报道在3'-末端生物素化的PS-ODNs在体内代谢稳定,并抵抗核酸外切酶和内切酶的降解，然而由于这些低聚物与血浆蛋白有强的结合，难于转移到脑内。另外由OX26-SA作转移载体的PS-ODNs 也很少能通过静脉给药跨越BBB转运进入脑。 而PNAs不仅抵抗核酸外切酶/内切酶及蛋白酶的降解，而且发现这些分子在氨基末端被生物素化并由OX26-SA作转移系统后，其脑的摄取水平可与吗啡相比。总之，多项实验证实 PNA-OX26-SA偶联体可保持对靶mRNA的有效识别并使之灭活，提示 PNA-OX26-SA 偶联体是转移药物到脑组织的最好的反义分子[10]。
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值得注意的是，在培养细胞中观察到的现象与整体给药的情况并不一致。如反义 PS-ODN为多聚阴离子，不易透过细胞膜，体外实验常需要脂质体的包裹导入细胞，但在动物实验中，反义药物能顺利的到达靶器官，其机制还不清楚。
四、ODNs抑制靶基因的表达能力
ODNs是否能接近靶基因，与靶基因杂交？回答这个问题很复杂，但认为在某些细胞是可以的。粗略估计在一个细胞内mRNA的浓度为20 nmol/L(可以表达约1万个拷贝的靶基因)。 药理学剂量的ODNs为3～6 mg/kg ，在肾脏和肝脏可以达到5～15和1～5 μmol/L。有些组织可能会<0.05～1μmol/L(如脑)，但在某些细胞内，其浓度可增加到10倍以上。理论上，这样的浓度远超过实际mRNA的浓度，ODNs如能接近靶基因，应能抑制靶基因的表达。
ODNs 进入细胞后可分布于胞质和核内， 也可少量结合在细胞膜上。 这取决于ODNs的种类、性质以及进入细胞的方式。 而与其长度、序列和细胞系无关。多数研究报道表明PS-ODN以时间依赖的方式从液泡中分布进入胞质和核内。脂质体包裹的方式有助于PS-ODN进入细胞核。将PS-ODN微量注射入细胞质，将最终定位在细胞核。若PS-ODN 仅定位在内含体中，将降低其在活性部位胞质和核内的反义效率。
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五、增加ODNs的作用强度
至少有三种机制可以增加ODNs在体内的作用强度：加强其与受体的亲和力；降低其与非受体的相互作用；增加其转移到位于亚细胞结构中受体的效率。化学修饰可以使ODNs与靶mRNA的亲和力增加，这些修饰也同时降低ODNs与其它蛋白质的相互作用，从而达到前两种目的。但加强其转移到细胞内的效率仍无太大的进展[7]。
六、判断活性ODNs
如上所述，对于一个mRNA来说不是所有的靶点都是容易达到的。一般认为，设计反义药物选择的靶点一般为mRNA的5'端起始密码AUG周围和核糖体的装配部位，反义药物容易达到，活性较高。但研究表明mRNA的其它位置亦可成为设计的靶点，尤其是3'端的非翻译区。Monia等选择C-raf mRNA 的5'端、3'端以及编码区的34个 位置作靶点设计反义药物，结果作用于3’非翻译区的ISIS5132 的活性最强[11]。
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目前，RNA高亲和力靶点的判定全凭经验随机筛选ODNs， 比较盲目，既不经济，也不知是否真的拿到了高亲和力的ODNs。鉴定的方法需要改进，比较理想的是应用计算机手段，但由于对RNA结构了解的限制，近年之内难有大的进展。
七、口服及其它给药途径的研究
现行ODNs采取非口服给药方式。但口服给药对于疾病的长期治疗可能更为方便。1995年，Agrawal及其同事应用 2'-氧位甲基硫代磷酸酯寡核苷酸，使其在消化道的稳定性加强，口服的生物利用度增加。如对ODNs作进一步的化学修饰，口服给药将是可行的。
当然也应研究除口服以外的其它非注射给药途径。病灶周围的局部用药，可能会产生更为明显的优越性，提高局部的药物浓度从而增加特异性并降低毒性，同时降低药物的成本。实际上，目前反义核酸药物已能通过多种途径给药，包括气溶胶的吸入、滴鼻、iv和腹腔注射。
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八、降低毒性
关于毒性问题，目前尚未很好的解决。生命受到威胁的AIDS病和癌症病人通常可以耐受一定程度的非特异毒性。
反义药物的毒性依发生的原因不同可分为两类：一种是以药效学为基础的毒性，是其反义作用过强或与非靶基因产生反义作用而导致的毒性，应尽量避免设计与非靶基因杂交的反义寡核苷酸。另一种毒性是ODNs与其它分子(如蛋白)相互作用的结果， 可能有序列特异性也可能与序列无关。多数PS-ODN的毒性是由于此种原因所致， 由于它们的生物物理性质相似， 毒性谱也相似。主要有：补体激活、免疫刺激、凝血时间延长、肝肾毒性、致死性的血液动力学改变等。
提高反义寡核苷酸的特异性，对其进行化学修饰，或封闭硫代磷酸链中的多阴离子，或采用局部给药的方式等将有可能增加其特异性，从而减少剂量，降低其毒性。此外，选择良好的释药系统将增加作用强度而降低不良反应，最终也将降低药物的消耗和费用。目前正在开发新的ODNs，在这方面将有所改进，以产生更特异的作用。
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九、关于生产ODNs的成本
随着合成化学的发展，在一些实验室已能应用常规自动装置合成从微克级到毫克级的ODNs。另外通过改进的合成装置，已发展到从毫克到克级，甚至有报道一次循环已能产生400克纯化的ODNs[4]。这方面的技术发展迅速，无疑将最终降低生产ODNs的费用。
十、展望
总之，ODNs的未来取决于上述问题的解决，及临床实验的成功结果。
随着基因组序列信息的不断增加，科学家需要有效的研究方法以迅速证实靶基因的生物功能，并希望能开发出与靶基因相互作用的有效治疗药物。ODNs是最能逻辑解决这些问题的工具，也是合理设计和开发药物的重要途径。
另外，反义核酸药物在临床上有较强的发展潜力，因为从化学合成开始到临床前药动学及毒理学研究的设计，都是从分子靶到分子靶。Science 杂志1998年7月报道了第一个通过FDA咨询委员会的反义药物即用于治疗AIDS病人巨细胞病毒感染的视网膜炎的fomivirsen (或称Vitravene)[12]，它虽需要直接注射入眼内，但有超过其它一些抗病毒药物的优点：作用靶点限局，仅造成轻微的不良反应，如眼内压升高和炎症，这些不良反应一般是短暂的，并可通过局部使用甾体激素得到缓解[13]。Fomivirsen的上市可以说是开发反义药物的一个里程碑，而在5年前，许多人还认为反义核酸药物只是一种欺骗。
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相信不久的将来反义药物很可能成为药典的一部分，给疾病的治疗带来益处，反义药物的发展具有光明的前景。
美国洛克菲勒基金资助项目(RF93-63＃82)
参考文献
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2，Branch AD. A good antisense molecule is hard to find. Trends Biochem Sci， 1998， 23∶45～50.
3，Birikh KR,Heaton PA， Eckstein F. The structure, function and application of the hammerhead ribozyme. Eur J Biochem， 1997，245∶1～16.
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4，Akhtar S, Agrawal S. In vivo studies with antisense oligonucleotides. Trends Phamacol Sci， 1997，18∶12～18.
5，Nielsen PE. Applications of peptide nucleic acids.Curr Opin Biotechnol， 1999，10∶71～75.
6，Nielsen PE. Peptide nucleic acids as therapeutic agents. Curr Opin Struct Biol， 1999， 9∶353～357.
7，Bennett CF.Antisense oligonucleotides:is the glass half full or half empty? Biochem Pharmacol,1998，53∶9～19.
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8，Monia BP. First and second generation antisense inhibitors targeted to human c-raf kinase: in vitro and in vivo studies. Anticancer Drug Des， 1997， 12∶327～339.
9，Butler M,Strecker K,Bennett CF.Cellular distribution of phosphorothioate oligodeoxynucleotides in normal rodent tissues.Lab Invest,1997，77∶379.
10，Boado RJ, Tsukamoto H, Pardridge WM. Alzheimer's disease and cerebral AIDS. Drug delivery of antisense molecules to the brain for treatment of Alzheimer's disease and cerebral AIDS. J Pharm Sci， 1998， 87∶1308～1315.
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11，Monia BP, Johnston JF, Geiger T, et al. Antitumor activity of a phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide targeted against C-raf kinase. Nat Med， 1996， 2∶668～675.
12，ScienceScop. Green light for antisense drug. Science， 1998， 281∶625.
13，Perry CM， Balfour JA. Fomivirsen. Drugs， 1999， 57∶375～380.
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