中枢神经系统钙稳态失调和老龄脑功能
作者：冯征 张均田
单位：冯征(中国医学科学院，中国协和医科大学药物研究所，北京 100050)；均田(中国医学科学院，中国协和医科大学药物研究所，北京 100050)
关键词：脑老化；钙稳态；迟后超级化；Ca2+结合蛋白；蛋白激酶C
生理科学进展000203 摘要 脑的老化表现为记忆力的减退。脑老化的钙假说认为脑的老化与中枢神经系统[Ca2+]i的调节机制紊乱有关，衰老可以通过多种因素导致[Ca2+]i升高，影响突触传导，神经递质释放，信号转导等导致记忆障碍，本文综述了近年来的进展。
学科分类号 R97; R977.9
Central Nervous System Calcium Homeostasis Imbalance and Brain Aging
, http://www.100md.com
FENG Zheng，ZHANG Jun-Tian
(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College (PUMC), Beijing 100050)
Abstract Brain aging is associated with a marked decline of memory. The calcium homeostasis imbalance hypothesis postulated that sustained changes in the regulation of intracellular Ca2+ concentration, [Ca2+]i are the major cause of brain aging .Aging may cause the increase of the [Ca2+]i through many mechanisms. These alterations would in turn affect the synaptic transduction, neurotransmitter release and signal transduction, cause memory deficit. This article reviewed the progress about this hypothesis in recent years.
, 百拇医药
Key words Brain aging; [Ca2+]i homeostasis; After hyperpolarization; Ca2+-binding protein; Protein kinase C
脑老化表现为增龄性的记忆力减退和缺失；脑老化的钙失衡假说认为，老化可引起中枢神经系统的[Ca2+]i稳同调节机制的失调，神经元变性。其理论依据是老化时[Ca2+]i稳态的失调和神经元的丧失。
传统的观点认为脑老化表现的认知障碍是由于神经元的丧失所致，对于一些神经变性疾病的研究，如Alzheimer's 病(AD)，有力地支持这一观点，即使只有轻微的症状，AD患者脑中就有大量的神经元丧失(Gomez-Isla. 1996)。
, 百拇医药 但是，病理条件和生理的衰老显然是不同的，多年来人们一直认为海马神经元的丧失与认知障碍密切相关，但 West (1994)等发现人海马CA1～CA3区的神经元在老年时并未丧失。在表现为空间学习障碍的老龄鼠中也发现了这一现象(Rapp等.1996)。
由此推论突触传递效能和神经元可塑性的变化可能与衰老密切相关，老龄可引起海马的神经回路和可塑性的变化。几种海马的突触可塑性是 Ca2+依赖性的，增龄引起的[Ca2+]i稳态的失调，可以改变突触传递的阈值，易化突触的抑制，推测[Ca2+]i稳态的变化与衰老和记忆障碍密切相关[1]。
研究认为脑的老化与下列几个因素密切相关：(1)静息状态下突触体内[Ca2+]i增加；(2)去极化引起的突触体内[Ca2+]i大量增加；(3)去极化后Ca2+清除速度降低；(4)Ca2+转运机制障碍。
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一、衰老对[Ca2+]i稳态的影响
神经细胞内Ca2+的水平受到多种钙通道、钙泵、钙结合蛋白、线粒体和内质网钙库以及Na+/Ca2+交换系统的调节。[Ca2+]i通过多种反馈机制受到调节。
(一)细胞膜Ca2+通道 细胞膜上Ca2+通道可分为电压依赖型Ca2+通道(VOCs)，配体门控型Ca2+通道(ROC)和内Ca2+释放通道(CRC)，老化可以不同程度地影响这些通道。
1.VOCs：早期研究发现，老龄鼠脑组织尼群地平结合位点的数目明显增加，亲和力却下降了大约50%(Govoni.1985)。在表现为学习和记忆障碍的衰老加速小鼠(SAM)中却发现L-型VOCs拮抗剂PN-200-110和N型Ca2+通道拮抗剂海贝毒素(ω-conotoxin)结合位点显著减少(Yamada.1988)。Bangalore(1995)报道大鼠(30月龄)皮层、海马、纹状体二氢吡啶(DHP)结合位点减少，亲和力降低，但海马，纹状体的海贝毒素的结合位点减少，亲和力却增高(Bangalore.1995)。但也有报道老龄鼠纹状体和海马CA3区尼莫地平的结合位点明显增多(Araki.1997)。
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近年来随着电生理技术和分子生物学技术的发展，在多种老化的神经元中发现Ca2+的电流可以升高，不变或降低，这种变化与单通道的电导和电压的依赖无关，却与通道分布密度的差异有关。
隔区/斜角带(MS/nDB)神经元有大量的低电压激活Ca2+电流(LVA )，LVA电流具有低阈值(小于-50mV)激活和迅速的电压依赖性失活的特点，如T型VOCs, 在神经元起步点活动与重复发放中起重要作用；老龄鼠LVA电流的密度增加，使得老龄神经元保持或增加对节律性的发放(rhythmical fire)和爆发冲动的反应能力，导致[Ca2+]i增加，扰乱[Ca2+]i稳态(Murchison.1995)。MS/nDB神经元还存在高电压激活Ca2+通道电流(HVA)，其特点为高阈值(小于-20mV)激活，缓慢失活，其失活密切依赖于[Ca2+]i浓度，包括L型和N型VOCs，老化神经元HVA增加，电流失活减慢，特别是除极末期的慢失活晚电流(slowly inactivating (late) current )(Murchison 1996)。老龄可导致Ca2+通道活性增加，Ca2+内流增加(Campbell.1996)。
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海马L-型VOCs活性呈增龄性增加，这与其功能性通道密度增加有关,老龄动物学习能力与通道的密度成反比(Thibault. 1996)。体外培养超过28天的老化海马神经元，HVA和L-型VOCs的活性逐渐增加，这与L-型VOCs密度增加有关，同时L-型VOCs α1亚单位mRNA表达增加，应用尼莫地平可以延长神经元的存活(Porter.1997)。Herman等(1998)报道，老年F344 大鼠海马CA1区L-型VOCs的α1C和α1D 亚单位的mRNA表达增加。即老化过程中Ca2+通道亚单位的基因/mRNA表达上调。
迟后超级化(AHP)指阵发性放电后一种能持续较长时间(1s以上)的神经细胞膜的超级化状态，是动作电位爆发之后移行的超级化电位。当去极化激活VOCs ，Ca2+内流使[Ca2+]i浓度达到高水平时，激活外向Ca2+依赖性K+电流，这些外向电流使神经元超级化，抑制电压依赖性Ca2+电流，维持[Ca2+]i在正常水平。这一反馈机制可以防止神经元过度兴奋(Disterhoft.1996)。
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Landfiled 和Pitler(1984)最早在老龄鼠海马神经元中发现了AHP，老龄动物海马AHP的延长主要是由于Ca2+通过L-型Ca2+通道内流和/或神经元[Ca2+]i水平的持续增高；Ca2+动作电位去极化的慢平台期(slow plateau phase)时相的延长可能可以延长AHP，在老化神经元中慢平台期延长与AHP延长在时程上一致。AHP延长可以使神经元的兴奋性降低和海马中信号转导障碍；尼莫地平可以缩短老龄所引起AHP延长，促进学习记忆。
长时程增强(LTP)是中枢神经系统可塑性的典型表现，是一种细胞和突触水平的学习模式；LTP与NMDA受体和VOCs密切相关；由于海马CA1区的L-型Ca2+电流增加，NMDA受体的数目减少,老龄引起突触可塑性由NMDA依赖的机制向VOCs依赖的机制的移行，表现为NMDA依赖性的LTP的振幅降低，VOCs依赖性LTP的振幅却增大。衰老过程中，L-型Ca2+通道活化，通过AHP抑制LTP产生，易化长时程抑制(LTD)(Norris. 1998)。L-型Ca2+通道阻滞剂nifedipine可以易化老龄鼠海马脑片的LTP，NMDA受体拮抗剂AP5则可阻断之。由于K+通道阻滞剂apamin同样可以缩短AHP，增加突触传导，推测nifedipine可能也是通过缩短AHP起作用。Ca2+螯合剂EGTA-AM也有增加老龄鼠场兴奋性突触后电位(fEPSPs)的作用。
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2.ROCs： 离子通透型谷氨酸受体(iGluRs)介导的Ca2+内流与衰老密切相关；iGluRs可分为对Ca2+高通透性的NMDA受体和非通透性的AMPA受体。
老年人的海马和内嗅皮层NMDA受体的表达无变化，但在衰老小鼠 海马和皮层的NMDA受体和AMPA受体的表达都明显降低。老龄鼠MS/nDB神经元中AMPA诱发的锋电流增高，AMPA受体的亲和力降低，推测老龄鼠AMPA受体可能对Ca2+的通透性增高。这可能与基底前脑与衰老相关的神经元可塑性和兴奋性的改变有关[2]。
3. CRC： CRC是Ca2+储池释放Ca2+进入胞质的重要环节。CRC可分为两大类，Ryanodine敏感CRC，促进Ca2+内流；IP3受体通道,一些与磷脂酶(PLC)和IP3偶联的代谢性受体的激活可导致其开放。
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老龄鼠中脑和皮层Ryanodine结合位点的密度和解离常数(Kd)没有变化；但皮层的IP3受体的密度却降低了50%(Martini1994)。老龄小鼠小脑颗粒细胞层IP3受体密度降低，但亲和力无变化[3]。在老龄鼠脊髓中发现，IP3受体密度降低，但亲和力增高；IP3受体mRNA表达增加；在纹状体也发现了类似现象(Igwe.1995)。说明增龄不仅影响IP3受体的活性，而且影响IP3受体的转录、加工和剪切。
(二)胞内钙结合蛋白 多数Ca2+与蛋白结合，包括钙调蛋白(CaM)以及其他高亲和力Ca2+结合蛋白(CaBP),如小清蛋白(parvalbumin)，calbindin D-28k，calretinin等，除CaM将信号传递给许多靶蛋白外，其余的蛋白主要起缓冲的作用，使[Ca2+]i 处于稳态水平(Krzywkowski.1996)。
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增龄可引起区域特异性Ca2+缓冲能力下降。 老年动物某些脑区CaBP的活性明显下调。小清蛋白免疫阳性神经元在扣带回、内嗅皮层、皮层运动区和隔区-斜角带复合体明显减少(Duckles.1996)。老龄鼠海马中胞质calbindin-D28k和calretinin活性明显降低，海马中calbindin-D28k-免疫阳性的神经元也明显减少，但皮层、小脑、纹状体、隔区却无明显变化(Krzywkowski.1996)。老龄Fischer 344 大鼠海马CA1和CA3区小清蛋白, calbindin和calretinin 免疫阳性神经元也明显减少[4]。
基底前脑神经元胆碱能神经元(BFCN)的丧失与多种老年相关疾病有关。老龄鼠BFCN calbindin-D28k 免疫阳性的神经元明显减少。Ca2+缓冲减少使得BFCN 在神经变性病变中易于受到损伤(Kishimoto. 1998)。老龄仓鼠皮层、纹状体calbindin-D28k mRNA表达降低，而calretinin和小清蛋白mRNA表达无明显变化，说明calbindin-D28k mRNA在正常衰老过程中的表达特异性下调，表明其在神经退行性疾病中有重要作用(Batuecas.1998)。长期应用尼莫地平(自12个月至23个月)可改善老龄鼠空间记忆障碍，增加皮层突触体calbindin-D28K 和calreticulin的含量。这些蛋白的表达上调可能与尼莫地平对老龄鼠的基因表达和学习能力的影响有关。
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(三)钙转运 Ca2+转运体主要包括Ca2+ATP酶和Na+-Ca2+交换蛋白，它们可以及时维持神经元内外的Ca2+浓度梯度。
1.Ca2+ATP酶：Ca2+ATP酶主要包括内质网Ca2+ATP酶(SERCA)和质膜Ca2+ATP酶(PMCA)；突触体膜(SPMs)上的PMCA在维持[Ca2+]i的低稳态水平中有重要作用。如其功能发生改变,则可影响神经的兴奋、传导和递质释放。
在老龄的F344/BNF1大鼠中发现：(1)SPMs 的PMCA活性呈增龄性降低，表现为Vmax呈渐进性增龄相关的降低；(2)老龄鼠(34月龄)PMCA的表达降低约20%，推论PMCA活性降低的部分原因是质膜上PMCA的丢失；(3) 增龄相关的CaM与膜的结合能力和CaM对PMCA的激活能力均下降[5]。Ca2+与CaM结合形成Ca2+-CaM复合体，与PMCA的自身抑制片段相互作用，发生变构，释放自身抑制片段，激活PMCA。在对不同年龄的Fischer 344 大鼠脑中的CaM的二级结构和四级结构的研究发现，有增龄相关的渐进性的CaM 激活PMCA的能力下降，但未发现老龄化对CaM结构的翻译后修饰有影响。CaM上的9个甲硫氨酸残基与CaM 和靶蛋白的结合密切相关，甲硫氨酸可以被氧化成亚砜，易于被氧化剂H2O2和过氧化亚硝基(OONO-)所氧化修饰；老化可以导致CaM的氧化修饰，降低PMCA 对CaM的亲和力。因此，CaM对PMCA激活能力的下降可能主要是由于其一级结构上的甲硫氨酸被氧化修饰产生—氧硫基甲硫氨酸，从而引起增龄相关的二级和四级结构的变化,最终引起[Ca2+]i 稳态的失调[6]。
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2.Na+-Ca2+交换体：Na+-Ca2+交换体可以快速的排出大量的Ca2+，调节Ca2+内储，脑中Na+-Ca2+交换体的活性呈增龄性的降低(Michaelis. 1989)，但是增龄对于小脑和皮层Na+-Ca2+交换体mRNA的表达无明显影响。因此Na+-Ca2+交换体活性的变化可能与蛋白翻译后修饰密切相关(Colvin.1996)。
(四)内质网和线粒体的Ca2+库 Ca2+内储主要包括内质网和线粒体Ca2+库，神经元Ca2+内储可以动态调节胞内Ca2+释放的程度和幅度。
, 百拇医药 老化的中枢和外周的神经元Ca2+的外排和缓冲受到了损害，表现为Ca2+瞬流([Ca2+]i transient) 引起的去极化的衰减显著延长。突触体的线粒体Ca2+摄取降低，线粒体[Ca2+]i增龄相关的降低，这主要是由于线粒体Ca2+转运体(calcium uniporter)活性的损害, Ca2+对转运体亲和力和协同性降低，线粒体Na+/Ca2+反向转运体(Na+/Ca2+ antiporter)以及线粒体内膜的流动性发生变化所致。线粒体[Ca2+]i降低可导致Ca2+依赖性脱磷酸化和突触体K+去极化活化的丙酮酸脱氢酶的活性降低，线粒体能量代谢障碍。SERCAs依赖的Ca2+转运也有损害，但也有报道MS/nDB中滑面内质网无变化(Murchison 等.1998)。
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(五)与Ca2+信号转导系统相关的蛋白激酶 衰老可以影响中枢神经系统的多种蛋白激酶的活性，影响其磷酸化，与钙信号转导系统相关的蛋白激酶包括磷脂酶C (PLC)，蛋白激酶(PKC)，Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶II(PKII)，酪氨酸蛋白激酶(RTK)。
1.PLC: PLC激活后通过两个途径偶联4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解，与神经递质信号传导密切相关的是与G-蛋白偶联的PLC-β，可以产生IP3和IP4；另一途径是直接激活所有的PLC的异构酶，刺激Ca2+内流。脑中至少有PLC-A (α)、 PLC-Ⅰ (β) 和 PLC-Ⅱ (γ)三种异构酶，分布于不同脑区。脑中M-胆碱能信号转导部分通过了PIP2-PLC通路，老龄鼠皮层氨甲酰胆碱(carbachol)诱导的PLC的活性明显降低，但额叶的PLC-β mRNA表达增加，海马PLC-α mRNA的表达降低(Narang.1996)。推测老龄存在M-胆碱能与磷脂酰肌醇通路的脱偶联，主要是由于受体-G蛋白和/或G蛋白-PLC脱偶联所致。而PLC异构酶的不同表达则是一种代偿方式(Ayyagar.1996)。
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2.PKC: PKC广泛分布于脑组织，它与神经递质的释放，LTP的产生和维持，Ca2+通道，K+通道的活性调节以及记忆和认知功能密切相关。
PKC转位是PKC激活的必要步骤，老龄伴有PKC磷酸化能力的改变和皮层、海马PKC转位的障碍(Pascale.1996)。PKC的转位与表达与一族PKC结合蛋白RACKs (receptors for activated C kinase)相关，其中RACK1是最具有代表性的，老龄鼠RACK1的活性下降了50%，RACK1 的损害可能与PKC的活性降低有关。老龄鼠皮层PKCδ和PKCε的活性虽无明显变化，但佛波酯激活的PKCδ和PKCε的转位引起的活性增加却明显缺如(Wetsel.1996 )。 PKC的转位还与多种锚定蛋白有关，在衰老过程中脑中PKC的磷酸化的活性降低，虽然其多种亚型无变化，但在佛波酯引起的转位明显损害；锚定蛋白则可能与这种现象有关。对于影响脑PKC活性的多种因子的研究，不仅可以阐明神经传导的分子机制，而且可能为防治老年相关的脑功能障碍开辟新的途径(Pascale.1998)。
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早期研究认为老化可以降低PKC的活性，在脊髓PKCα， β和γ的活性呈增龄性的降低。但近年来的研究表明某些PKC亚型在衰老过程中是增加的；在人额叶Brodmann 9区，PKCα, β免疫反应性和活性与年龄呈正相关;老龄鼠海马颗粒型和可溶型的PKCγ浓度均增高,而且其空间学习障碍与可溶型的PKCγ浓度密切相关，呈亚型特异性(Busquets. 1996)。因此对于PKC不同亚型在衰老中的评价也是今后的研究方向。此外，老龄鼠RTK和PKII的活性也是明显下降的(Mullany. 1996)。
关于脑老化与[Ca2+]i的关系见附图。
附图 衰老对[Ca2+]i稳态的影响
CRC：内Ca2+释放通道， SERCA：内质网Ca2+ATP酶， PMCA：质膜Ca2+-ATP酶，CaBP：Ca2+结合蛋白，AHP：迟后超级化
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二、关于脑老化钙假说的问题与展望
许多实验提示存在增龄相关的中枢神经[Ca2+]i调节机制障碍，但目前尚有许多问题有待探讨。
(一)脑老化的Ca2+假说的进一步证实 目前认为老化神经元静息[Ca2+]i浓度增加，在兴奋后，[Ca2+]i恢复至静息浓度的时间延长，虽有一些证据，但目前尚不具备在活体上测定[Ca2+]i的技术，且目前为止的研究发现老龄对神经元的[Ca2+]i调节机制损害并不明显，这可能是由于机体存在多种反馈的机制，可以通过长期的协调以克服微小的[Ca2+]i稳态失调。
有观点认为老龄动物和人脑的[Ca2+]i是降低而不是升高的，作为一种代偿机制脑对[Ca2+]i变化的敏感性增加，在正常状态下这两种机制可以相互代偿。但在病理情况(如低氧，低血糖)所引起的[Ca2+]i升高时，由于老化的神经元对于[Ca2+]i下调的能力的减弱，使其易于受到损伤(Muller.1996)。事实上，在衰老过程中机体多种Ca2+信号转导，如细胞分裂，生长分化，神经递质释放等都是明显减弱的[7]。因此目前首要的是应用更符合生理条件下的实验技术进一步的研究老化神经元的[Ca2+]i稳态，尤其是静息[Ca2+]i的变化。
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(二)[Ca2+]i在脑老化中真正的作用 即使假设在老化脑中存在长期[Ca2+]i的轻度增高，可以产生类似于短时[Ca2+]i超载的神经损伤。仍有一个重要的问题，即神经系统是否就会象“脑老化的Ca2+假说”所描述的表现为功能障碍，功能的障碍还可能是继发于其他因素而不是[Ca2+]i的变化，神经元的[Ca2+]i调节系统的失衡可能是神经元适应反应的部分表现。
从神经生物学的角度来看，适度的[Ca2+]i升高是有益于一些神经系统的成熟和发育的，例如小脑的颗粒细胞和交感神经元在缺乏神经生长因子的情况下，需要去极化浓度的K+的刺激以促进其生存和成熟。这种K+的浓度与静息的[Ca2+]i的增加密切相关，而且在[Ca2+]i为250nmol/L时，神经元的生存达到最佳状态(Koike.1991)。我们的研究证明左旋黄皮酰胺是钾通道阻滞剂，轻度升高神经细胞内钙水平，它易化学习记忆和LTP的作用明显强于现有的促智药[8]。由此，Franklin等(1992)提出了神经元生存的Ca2+调定点假说(Ca2+ set-points hypothesis)，这一假说认为当[Ca2+]i大于调定点的高限或小于调定点的低限时均可导致神经元的死亡，在这两个界限之间，静息[Ca2+]i的浓度是与细胞外间隙的生长因子的浓度成反比的。在这一情况下Ca2+主要是通过其对细胞核基因表达的影响而起重要作用的 (Ghosh.1995) 。因此老化的神经元静息[Ca2+]i增加，早期可能是对某些老化因子的“生存反应”。[Ca2+]i在神经元老化的早期作用目前尚未见报道，最近研究表明[Ca2+]i 稳态的调节机制在神经元老化的早期就开始受到调制，可能发生过度的代偿，从而导致[Ca2+]i升高至有害的水平。
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(三)Ca2+在病理情况和生理衰老的不同作用 在AD和其他相关的疾病中均存在急性[Ca2+]i稳态调节机制的破坏。易于受到多种因子的损害是老化神经元的共同特征，但在老化神经元中的[Ca2+]i稳态调节机制的破坏是否与老年的认知障碍有关尚不明确。脑老化导致的[Ca2+]i稳态的紊乱可以导致突触传递和可塑性的变化，Ca2+外排机制下调导致[Ca2+]i超载，神经元易于受到兴奋毒的损害，即生理状态下的神经元的激活过程变得呈兴奋毒，这对于依赖于[Ca2+]i波动的突触传递尤为显著，在老化的脑中大量的功能性的突触丧失，导致包括LTP在内的多种突触传递功能障碍。这可能是由于[Ca2+]i的清除能力的降低，局部的兴奋可致兴奋毒性，活性突触丧失。
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(四)神经胶质细胞的地位和作用 胶质细胞与调节大脑微环境有关，它们也可以通过神经递质和神经调质影响突触传导从而影响脑高级整合功能。在[Ca2+]i升高的情况下，神经胶质细胞可对由神经递质，神经调质和激素引起的电，机械和化学的刺激产生反应，这种[Ca2+]i升高表现可为多种时间和空间形式，胶质细胞除了存在电压和受体依赖性Ca2+通道外，还存在多种通过IP3与胞内Ca2+库偶联的代谢性受体。
胶质细胞尤其是星形胶质细胞与[Ca2+]i的信号密切相关，Ca2+信号在神经胶质细胞之间可以通过缝隙连接以无衰减的方式传导，从而使胶质细胞的活性发生整合。通过控制缝隙连接的传导，可以确定功能性胶质细胞神经网络的界限。神经元的活动可触发特定的胶质细胞的[Ca2+]i信号，而且研究发现胶质细胞的[Ca2+]i波动可以影响神经元的兴奋性。胶质细胞的[Ca2+]i信号可以认为是其兴奋的一种方式。事实上细胞内Ca2+的波动的扩散对于胶质细胞间和胶质细胞-神经元之间的相互作用非常重要。目前为止胶质细胞在脑老化中的作用和机制尚未完全阐明。
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显然任何一种假说都不可能解释所有的现象，但迄今为止，神经元“老化Ca2+假说”仍是极有吸引力的假说，对于上述问题的进一步研究将有助于全面阐明Ca2+在脑老化中的作用。
国家重点基础研究发展规划项目(973)资助课题
参考文献
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单位：冯征(中国医学科学院，中国协和医科大学药物研究所，北京 100050)；均田(中国医学科学院，中国协和医科大学药物研究所，北京 100050)
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Abstract Brain aging is associated with a marked decline of memory. The calcium homeostasis imbalance hypothesis postulated that sustained changes in the regulation of intracellular Ca2+ concentration, [Ca2+]i are the major cause of brain aging .Aging may cause the increase of the [Ca2+]i through many mechanisms. These alterations would in turn affect the synaptic transduction, neurotransmitter release and signal transduction, cause memory deficit. This article reviewed the progress about this hypothesis in recent years.
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脑老化表现为增龄性的记忆力减退和缺失；脑老化的钙失衡假说认为，老化可引起中枢神经系统的[Ca2+]i稳同调节机制的失调，神经元变性。其理论依据是老化时[Ca2+]i稳态的失调和神经元的丧失。
传统的观点认为脑老化表现的认知障碍是由于神经元的丧失所致，对于一些神经变性疾病的研究，如Alzheimer's 病(AD)，有力地支持这一观点，即使只有轻微的症状，AD患者脑中就有大量的神经元丧失(Gomez-Isla. 1996)。
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由此推论突触传递效能和神经元可塑性的变化可能与衰老密切相关，老龄可引起海马的神经回路和可塑性的变化。几种海马的突触可塑性是 Ca2+依赖性的，增龄引起的[Ca2+]i稳态的失调，可以改变突触传递的阈值，易化突触的抑制，推测[Ca2+]i稳态的变化与衰老和记忆障碍密切相关[1]。
研究认为脑的老化与下列几个因素密切相关：(1)静息状态下突触体内[Ca2+]i增加；(2)去极化引起的突触体内[Ca2+]i大量增加；(3)去极化后Ca2+清除速度降低；(4)Ca2+转运机制障碍。
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一、衰老对[Ca2+]i稳态的影响
神经细胞内Ca2+的水平受到多种钙通道、钙泵、钙结合蛋白、线粒体和内质网钙库以及Na+/Ca2+交换系统的调节。[Ca2+]i通过多种反馈机制受到调节。
(一)细胞膜Ca2+通道 细胞膜上Ca2+通道可分为电压依赖型Ca2+通道(VOCs)，配体门控型Ca2+通道(ROC)和内Ca2+释放通道(CRC)，老化可以不同程度地影响这些通道。
1.VOCs：早期研究发现，老龄鼠脑组织尼群地平结合位点的数目明显增加，亲和力却下降了大约50%(Govoni.1985)。在表现为学习和记忆障碍的衰老加速小鼠(SAM)中却发现L-型VOCs拮抗剂PN-200-110和N型Ca2+通道拮抗剂海贝毒素(ω-conotoxin)结合位点显著减少(Yamada.1988)。Bangalore(1995)报道大鼠(30月龄)皮层、海马、纹状体二氢吡啶(DHP)结合位点减少，亲和力降低，但海马，纹状体的海贝毒素的结合位点减少，亲和力却增高(Bangalore.1995)。但也有报道老龄鼠纹状体和海马CA3区尼莫地平的结合位点明显增多(Araki.1997)。
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近年来随着电生理技术和分子生物学技术的发展，在多种老化的神经元中发现Ca2+的电流可以升高，不变或降低，这种变化与单通道的电导和电压的依赖无关，却与通道分布密度的差异有关。
隔区/斜角带(MS/nDB)神经元有大量的低电压激活Ca2+电流(LVA )，LVA电流具有低阈值(小于-50mV)激活和迅速的电压依赖性失活的特点，如T型VOCs, 在神经元起步点活动与重复发放中起重要作用；老龄鼠LVA电流的密度增加，使得老龄神经元保持或增加对节律性的发放(rhythmical fire)和爆发冲动的反应能力，导致[Ca2+]i增加，扰乱[Ca2+]i稳态(Murchison.1995)。MS/nDB神经元还存在高电压激活Ca2+通道电流(HVA)，其特点为高阈值(小于-20mV)激活，缓慢失活，其失活密切依赖于[Ca2+]i浓度，包括L型和N型VOCs，老化神经元HVA增加，电流失活减慢，特别是除极末期的慢失活晚电流(slowly inactivating (late) current )(Murchison 1996)。老龄可导致Ca2+通道活性增加，Ca2+内流增加(Campbell.1996)。
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海马L-型VOCs活性呈增龄性增加，这与其功能性通道密度增加有关,老龄动物学习能力与通道的密度成反比(Thibault. 1996)。体外培养超过28天的老化海马神经元，HVA和L-型VOCs的活性逐渐增加，这与L-型VOCs密度增加有关，同时L-型VOCs α1亚单位mRNA表达增加，应用尼莫地平可以延长神经元的存活(Porter.1997)。Herman等(1998)报道，老年F344 大鼠海马CA1区L-型VOCs的α1C和α1D 亚单位的mRNA表达增加。即老化过程中Ca2+通道亚单位的基因/mRNA表达上调。
迟后超级化(AHP)指阵发性放电后一种能持续较长时间(1s以上)的神经细胞膜的超级化状态，是动作电位爆发之后移行的超级化电位。当去极化激活VOCs ，Ca2+内流使[Ca2+]i浓度达到高水平时，激活外向Ca2+依赖性K+电流，这些外向电流使神经元超级化，抑制电压依赖性Ca2+电流，维持[Ca2+]i在正常水平。这一反馈机制可以防止神经元过度兴奋(Disterhoft.1996)。
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Landfiled 和Pitler(1984)最早在老龄鼠海马神经元中发现了AHP，老龄动物海马AHP的延长主要是由于Ca2+通过L-型Ca2+通道内流和/或神经元[Ca2+]i水平的持续增高；Ca2+动作电位去极化的慢平台期(slow plateau phase)时相的延长可能可以延长AHP，在老化神经元中慢平台期延长与AHP延长在时程上一致。AHP延长可以使神经元的兴奋性降低和海马中信号转导障碍；尼莫地平可以缩短老龄所引起AHP延长，促进学习记忆。
长时程增强(LTP)是中枢神经系统可塑性的典型表现，是一种细胞和突触水平的学习模式；LTP与NMDA受体和VOCs密切相关；由于海马CA1区的L-型Ca2+电流增加，NMDA受体的数目减少,老龄引起突触可塑性由NMDA依赖的机制向VOCs依赖的机制的移行，表现为NMDA依赖性的LTP的振幅降低，VOCs依赖性LTP的振幅却增大。衰老过程中，L-型Ca2+通道活化，通过AHP抑制LTP产生，易化长时程抑制(LTD)(Norris. 1998)。L-型Ca2+通道阻滞剂nifedipine可以易化老龄鼠海马脑片的LTP，NMDA受体拮抗剂AP5则可阻断之。由于K+通道阻滞剂apamin同样可以缩短AHP，增加突触传导，推测nifedipine可能也是通过缩短AHP起作用。Ca2+螯合剂EGTA-AM也有增加老龄鼠场兴奋性突触后电位(fEPSPs)的作用。
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2.ROCs： 离子通透型谷氨酸受体(iGluRs)介导的Ca2+内流与衰老密切相关；iGluRs可分为对Ca2+高通透性的NMDA受体和非通透性的AMPA受体。
老年人的海马和内嗅皮层NMDA受体的表达无变化，但在衰老小鼠 海马和皮层的NMDA受体和AMPA受体的表达都明显降低。老龄鼠MS/nDB神经元中AMPA诱发的锋电流增高，AMPA受体的亲和力降低，推测老龄鼠AMPA受体可能对Ca2+的通透性增高。这可能与基底前脑与衰老相关的神经元可塑性和兴奋性的改变有关[2]。
3. CRC： CRC是Ca2+储池释放Ca2+进入胞质的重要环节。CRC可分为两大类，Ryanodine敏感CRC，促进Ca2+内流；IP3受体通道,一些与磷脂酶(PLC)和IP3偶联的代谢性受体的激活可导致其开放。
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老龄鼠中脑和皮层Ryanodine结合位点的密度和解离常数(Kd)没有变化；但皮层的IP3受体的密度却降低了50%(Martini1994)。老龄小鼠小脑颗粒细胞层IP3受体密度降低，但亲和力无变化[3]。在老龄鼠脊髓中发现，IP3受体密度降低，但亲和力增高；IP3受体mRNA表达增加；在纹状体也发现了类似现象(Igwe.1995)。说明增龄不仅影响IP3受体的活性，而且影响IP3受体的转录、加工和剪切。
(二)胞内钙结合蛋白 多数Ca2+与蛋白结合，包括钙调蛋白(CaM)以及其他高亲和力Ca2+结合蛋白(CaBP),如小清蛋白(parvalbumin)，calbindin D-28k，calretinin等，除CaM将信号传递给许多靶蛋白外，其余的蛋白主要起缓冲的作用，使[Ca2+]i 处于稳态水平(Krzywkowski.1996)。
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增龄可引起区域特异性Ca2+缓冲能力下降。 老年动物某些脑区CaBP的活性明显下调。小清蛋白免疫阳性神经元在扣带回、内嗅皮层、皮层运动区和隔区-斜角带复合体明显减少(Duckles.1996)。老龄鼠海马中胞质calbindin-D28k和calretinin活性明显降低，海马中calbindin-D28k-免疫阳性的神经元也明显减少，但皮层、小脑、纹状体、隔区却无明显变化(Krzywkowski.1996)。老龄Fischer 344 大鼠海马CA1和CA3区小清蛋白, calbindin和calretinin 免疫阳性神经元也明显减少[4]。
基底前脑神经元胆碱能神经元(BFCN)的丧失与多种老年相关疾病有关。老龄鼠BFCN calbindin-D28k 免疫阳性的神经元明显减少。Ca2+缓冲减少使得BFCN 在神经变性病变中易于受到损伤(Kishimoto. 1998)。老龄仓鼠皮层、纹状体calbindin-D28k mRNA表达降低，而calretinin和小清蛋白mRNA表达无明显变化，说明calbindin-D28k mRNA在正常衰老过程中的表达特异性下调，表明其在神经退行性疾病中有重要作用(Batuecas.1998)。长期应用尼莫地平(自12个月至23个月)可改善老龄鼠空间记忆障碍，增加皮层突触体calbindin-D28K 和calreticulin的含量。这些蛋白的表达上调可能与尼莫地平对老龄鼠的基因表达和学习能力的影响有关。
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(三)钙转运 Ca2+转运体主要包括Ca2+ATP酶和Na+-Ca2+交换蛋白，它们可以及时维持神经元内外的Ca2+浓度梯度。
1.Ca2+ATP酶：Ca2+ATP酶主要包括内质网Ca2+ATP酶(SERCA)和质膜Ca2+ATP酶(PMCA)；突触体膜(SPMs)上的PMCA在维持[Ca2+]i的低稳态水平中有重要作用。如其功能发生改变,则可影响神经的兴奋、传导和递质释放。
在老龄的F344/BNF1大鼠中发现：(1)SPMs 的PMCA活性呈增龄性降低，表现为Vmax呈渐进性增龄相关的降低；(2)老龄鼠(34月龄)PMCA的表达降低约20%，推论PMCA活性降低的部分原因是质膜上PMCA的丢失；(3) 增龄相关的CaM与膜的结合能力和CaM对PMCA的激活能力均下降[5]。Ca2+与CaM结合形成Ca2+-CaM复合体，与PMCA的自身抑制片段相互作用，发生变构，释放自身抑制片段，激活PMCA。在对不同年龄的Fischer 344 大鼠脑中的CaM的二级结构和四级结构的研究发现，有增龄相关的渐进性的CaM 激活PMCA的能力下降，但未发现老龄化对CaM结构的翻译后修饰有影响。CaM上的9个甲硫氨酸残基与CaM 和靶蛋白的结合密切相关，甲硫氨酸可以被氧化成亚砜，易于被氧化剂H2O2和过氧化亚硝基(OONO-)所氧化修饰；老化可以导致CaM的氧化修饰，降低PMCA 对CaM的亲和力。因此，CaM对PMCA激活能力的下降可能主要是由于其一级结构上的甲硫氨酸被氧化修饰产生—氧硫基甲硫氨酸，从而引起增龄相关的二级和四级结构的变化,最终引起[Ca2+]i 稳态的失调[6]。
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2.Na+-Ca2+交换体：Na+-Ca2+交换体可以快速的排出大量的Ca2+，调节Ca2+内储，脑中Na+-Ca2+交换体的活性呈增龄性的降低(Michaelis. 1989)，但是增龄对于小脑和皮层Na+-Ca2+交换体mRNA的表达无明显影响。因此Na+-Ca2+交换体活性的变化可能与蛋白翻译后修饰密切相关(Colvin.1996)。
(四)内质网和线粒体的Ca2+库 Ca2+内储主要包括内质网和线粒体Ca2+库，神经元Ca2+内储可以动态调节胞内Ca2+释放的程度和幅度。
, 百拇医药 老化的中枢和外周的神经元Ca2+的外排和缓冲受到了损害，表现为Ca2+瞬流([Ca2+]i transient) 引起的去极化的衰减显著延长。突触体的线粒体Ca2+摄取降低，线粒体[Ca2+]i增龄相关的降低，这主要是由于线粒体Ca2+转运体(calcium uniporter)活性的损害, Ca2+对转运体亲和力和协同性降低，线粒体Na+/Ca2+反向转运体(Na+/Ca2+ antiporter)以及线粒体内膜的流动性发生变化所致。线粒体[Ca2+]i降低可导致Ca2+依赖性脱磷酸化和突触体K+去极化活化的丙酮酸脱氢酶的活性降低，线粒体能量代谢障碍。SERCAs依赖的Ca2+转运也有损害，但也有报道MS/nDB中滑面内质网无变化(Murchison 等.1998)。
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(五)与Ca2+信号转导系统相关的蛋白激酶 衰老可以影响中枢神经系统的多种蛋白激酶的活性，影响其磷酸化，与钙信号转导系统相关的蛋白激酶包括磷脂酶C (PLC)，蛋白激酶(PKC)，Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶II(PKII)，酪氨酸蛋白激酶(RTK)。
1.PLC: PLC激活后通过两个途径偶联4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解，与神经递质信号传导密切相关的是与G-蛋白偶联的PLC-β，可以产生IP3和IP4；另一途径是直接激活所有的PLC的异构酶，刺激Ca2+内流。脑中至少有PLC-A (α)、 PLC-Ⅰ (β) 和 PLC-Ⅱ (γ)三种异构酶，分布于不同脑区。脑中M-胆碱能信号转导部分通过了PIP2-PLC通路，老龄鼠皮层氨甲酰胆碱(carbachol)诱导的PLC的活性明显降低，但额叶的PLC-β mRNA表达增加，海马PLC-α mRNA的表达降低(Narang.1996)。推测老龄存在M-胆碱能与磷脂酰肌醇通路的脱偶联，主要是由于受体-G蛋白和/或G蛋白-PLC脱偶联所致。而PLC异构酶的不同表达则是一种代偿方式(Ayyagar.1996)。
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2.PKC: PKC广泛分布于脑组织，它与神经递质的释放，LTP的产生和维持，Ca2+通道，K+通道的活性调节以及记忆和认知功能密切相关。
PKC转位是PKC激活的必要步骤，老龄伴有PKC磷酸化能力的改变和皮层、海马PKC转位的障碍(Pascale.1996)。PKC的转位与表达与一族PKC结合蛋白RACKs (receptors for activated C kinase)相关，其中RACK1是最具有代表性的，老龄鼠RACK1的活性下降了50%，RACK1 的损害可能与PKC的活性降低有关。老龄鼠皮层PKCδ和PKCε的活性虽无明显变化，但佛波酯激活的PKCδ和PKCε的转位引起的活性增加却明显缺如(Wetsel.1996 )。 PKC的转位还与多种锚定蛋白有关，在衰老过程中脑中PKC的磷酸化的活性降低，虽然其多种亚型无变化，但在佛波酯引起的转位明显损害；锚定蛋白则可能与这种现象有关。对于影响脑PKC活性的多种因子的研究，不仅可以阐明神经传导的分子机制，而且可能为防治老年相关的脑功能障碍开辟新的途径(Pascale.1998)。
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早期研究认为老化可以降低PKC的活性，在脊髓PKCα， β和γ的活性呈增龄性的降低。但近年来的研究表明某些PKC亚型在衰老过程中是增加的；在人额叶Brodmann 9区，PKCα, β免疫反应性和活性与年龄呈正相关;老龄鼠海马颗粒型和可溶型的PKCγ浓度均增高,而且其空间学习障碍与可溶型的PKCγ浓度密切相关，呈亚型特异性(Busquets. 1996)。因此对于PKC不同亚型在衰老中的评价也是今后的研究方向。此外，老龄鼠RTK和PKII的活性也是明显下降的(Mullany. 1996)。
关于脑老化与[Ca2+]i的关系见附图。
附图 衰老对[Ca2+]i稳态的影响
CRC：内Ca2+释放通道， SERCA：内质网Ca2+ATP酶， PMCA：质膜Ca2+-ATP酶，CaBP：Ca2+结合蛋白，AHP：迟后超级化
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二、关于脑老化钙假说的问题与展望
许多实验提示存在增龄相关的中枢神经[Ca2+]i调节机制障碍，但目前尚有许多问题有待探讨。
(一)脑老化的Ca2+假说的进一步证实 目前认为老化神经元静息[Ca2+]i浓度增加，在兴奋后，[Ca2+]i恢复至静息浓度的时间延长，虽有一些证据，但目前尚不具备在活体上测定[Ca2+]i的技术，且目前为止的研究发现老龄对神经元的[Ca2+]i调节机制损害并不明显，这可能是由于机体存在多种反馈的机制，可以通过长期的协调以克服微小的[Ca2+]i稳态失调。
有观点认为老龄动物和人脑的[Ca2+]i是降低而不是升高的，作为一种代偿机制脑对[Ca2+]i变化的敏感性增加，在正常状态下这两种机制可以相互代偿。但在病理情况(如低氧，低血糖)所引起的[Ca2+]i升高时，由于老化的神经元对于[Ca2+]i下调的能力的减弱，使其易于受到损伤(Muller.1996)。事实上，在衰老过程中机体多种Ca2+信号转导，如细胞分裂，生长分化，神经递质释放等都是明显减弱的[7]。因此目前首要的是应用更符合生理条件下的实验技术进一步的研究老化神经元的[Ca2+]i稳态，尤其是静息[Ca2+]i的变化。
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(二)[Ca2+]i在脑老化中真正的作用 即使假设在老化脑中存在长期[Ca2+]i的轻度增高，可以产生类似于短时[Ca2+]i超载的神经损伤。仍有一个重要的问题，即神经系统是否就会象“脑老化的Ca2+假说”所描述的表现为功能障碍，功能的障碍还可能是继发于其他因素而不是[Ca2+]i的变化，神经元的[Ca2+]i调节系统的失衡可能是神经元适应反应的部分表现。
从神经生物学的角度来看，适度的[Ca2+]i升高是有益于一些神经系统的成熟和发育的，例如小脑的颗粒细胞和交感神经元在缺乏神经生长因子的情况下，需要去极化浓度的K+的刺激以促进其生存和成熟。这种K+的浓度与静息的[Ca2+]i的增加密切相关，而且在[Ca2+]i为250nmol/L时，神经元的生存达到最佳状态(Koike.1991)。我们的研究证明左旋黄皮酰胺是钾通道阻滞剂，轻度升高神经细胞内钙水平，它易化学习记忆和LTP的作用明显强于现有的促智药[8]。由此，Franklin等(1992)提出了神经元生存的Ca2+调定点假说(Ca2+ set-points hypothesis)，这一假说认为当[Ca2+]i大于调定点的高限或小于调定点的低限时均可导致神经元的死亡，在这两个界限之间，静息[Ca2+]i的浓度是与细胞外间隙的生长因子的浓度成反比的。在这一情况下Ca2+主要是通过其对细胞核基因表达的影响而起重要作用的 (Ghosh.1995) 。因此老化的神经元静息[Ca2+]i增加，早期可能是对某些老化因子的“生存反应”。[Ca2+]i在神经元老化的早期作用目前尚未见报道，最近研究表明[Ca2+]i 稳态的调节机制在神经元老化的早期就开始受到调制，可能发生过度的代偿，从而导致[Ca2+]i升高至有害的水平。
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(三)Ca2+在病理情况和生理衰老的不同作用 在AD和其他相关的疾病中均存在急性[Ca2+]i稳态调节机制的破坏。易于受到多种因子的损害是老化神经元的共同特征，但在老化神经元中的[Ca2+]i稳态调节机制的破坏是否与老年的认知障碍有关尚不明确。脑老化导致的[Ca2+]i稳态的紊乱可以导致突触传递和可塑性的变化，Ca2+外排机制下调导致[Ca2+]i超载，神经元易于受到兴奋毒的损害，即生理状态下的神经元的激活过程变得呈兴奋毒，这对于依赖于[Ca2+]i波动的突触传递尤为显著，在老化的脑中大量的功能性的突触丧失，导致包括LTP在内的多种突触传递功能障碍。这可能是由于[Ca2+]i的清除能力的降低，局部的兴奋可致兴奋毒性，活性突触丧失。
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(四)神经胶质细胞的地位和作用 胶质细胞与调节大脑微环境有关，它们也可以通过神经递质和神经调质影响突触传导从而影响脑高级整合功能。在[Ca2+]i升高的情况下，神经胶质细胞可对由神经递质，神经调质和激素引起的电，机械和化学的刺激产生反应，这种[Ca2+]i升高表现可为多种时间和空间形式，胶质细胞除了存在电压和受体依赖性Ca2+通道外，还存在多种通过IP3与胞内Ca2+库偶联的代谢性受体。
胶质细胞尤其是星形胶质细胞与[Ca2+]i的信号密切相关，Ca2+信号在神经胶质细胞之间可以通过缝隙连接以无衰减的方式传导，从而使胶质细胞的活性发生整合。通过控制缝隙连接的传导，可以确定功能性胶质细胞神经网络的界限。神经元的活动可触发特定的胶质细胞的[Ca2+]i信号，而且研究发现胶质细胞的[Ca2+]i波动可以影响神经元的兴奋性。胶质细胞的[Ca2+]i信号可以认为是其兴奋的一种方式。事实上细胞内Ca2+的波动的扩散对于胶质细胞间和胶质细胞-神经元之间的相互作用非常重要。目前为止胶质细胞在脑老化中的作用和机制尚未完全阐明。
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显然任何一种假说都不可能解释所有的现象，但迄今为止，神经元“老化Ca2+假说”仍是极有吸引力的假说，对于上述问题的进一步研究将有助于全面阐明Ca2+在脑老化中的作用。
国家重点基础研究发展规划项目(973)资助课题
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