介导心肌肥大的一条新的信号通路——Calcineurin通路
作者：符民桂 刘乃奎 唐朝枢
单位：符民桂(北京医科大学第一医院心血管研究所， 北京100034) ；刘乃奎(北京医科大学第一医院心血管研究所， 北京100034)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所， 北京100034)
关键词：钙信号；心肌肥大；钙调神经磷酸酶；信号通路
生理科学进展000212 摘要 心肌肥大是心肌细胞对外界刺激, 如工作负荷、神经体液因子及内在心肌蛋白遗传突变的一种基本应答。已知胞内Ca2+浓度升高在各种刺激诱导心肌肥大的信号传递中起重要作用，但对Ca2+信号下游的传递机制一直不甚清楚。新近研究证实，由Ca2+活化的钙调神经磷酸酶(CaN)在心肌肥大的信号传递中起重要作用，其可能是Ca2+信号致肥大基因活化的偶联环节。抑制CaN活性可阻滞各种因素诱导的心肌肥大的发生与发展，提示Ca2+-CaN依赖的信号通路可能是介导心肌肥大的一条新的、重要的信号通路。
, 百拇医药
学科分类号 Q42；R364.3
心肌肥大是指心肌细胞增大而无细胞分裂，是心肌细胞对高血压、瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心脏病等常见临床疾病的一种基本应答。由心肌肥大发展到心衰，由心衰而死亡是临床病人的主要死因之一。目前对心肌肥大的分子机制仍不清楚。很多研究表明(Hongo等.1995)，胞内Ca2+是致心肌肥大的最基本信号，但胞内Ca2+升高诱导核内肥大基因活化的信号传递机制一直不甚清楚。最近的研究表明[1]，心肌细胞内Ca2+升高可通过活化一种Ca2+/钙调素依赖的蛋白磷酸酶—钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)而启动一条向核内传递的信号通路，这条CaN依赖的信号通路可能在心肌肥大的发生、发展中起到至关重要的作用。这一重大发现受到国际学术界的广泛关注，因为它提示应用阻断信号传递的药物即可能达到防止或逆转肥厚的目的。这一发现也提出了许多有待深入研究的问题。现简要综述如下。
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一、发现经过
CaN在T淋巴细胞活化的信号传递中起重要作用已被广泛认识。尽管很早知道心肌中存在CaN，然而对其确切作用一直不清楚。1997年，Hasegawa等发现转录因子GATA4可调节多种肥大基因(如β-MHC)的转录活化，同时发现GATA4必须与另一种因子协同才能起作用。Molkentin等[1]应用酵母双杂交系统检测到GATA4的辅因子是活化T细胞的核因子(NFAT3)。已知在T细胞中，NFAT作为CaN的下游底物可介导Ca2+信号对基因表达的调节。在心肌中亦可能存在这样一种将细胞Ca2+信号与心脏基因转录活化偶联的潜在机制。
在体外培养心肌细胞中，发现CaN、GATA4和NT-AT均为活化形式存在的条件下，可使B型利钠多肽(BNP)启动子的活化增加100倍；应用CaN特异性抑制剂环孢素A(CsA)或FK506可有效地阻断血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和苯肾上腺素(PE)的致心肌细胞肥大作用。
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Molkentin等[1]构建了一种可表达CaN活化形式的转基因鼠，结果所有转基因鼠在生后18天无一例外地出现了与人类心肌肥大相似的病理变化；同样，带有活化NF-AT3突变体的转基因鼠亦出现与CaN转基因鼠相似的病理变化。如在CaN转基因鼠生后给予CsA注射则可阻止心肌肥大的发生。
Sussman等[2]发现由心肌收缩蛋白基因(如tropomodulin，fetal β-tropomyosin，myosin light chain-2v)突变而引起的小鼠心肌肥大，亦可通过抑制CaN活化而阻断。
以上研究结果表明，这条由Ca2+活化的、CaN依赖的信号通路可能在心肌肥大的发生发展中起到重要的作用。
二、新的证据
心脏工作负荷过高是引起心肌肥大的最常见原因。Sussman等[2]观察了CsA对腹主动脉缩窄引起的压力超荷性心肌肥大的作用，结果表明CsA在抑制肥大大鼠心肌CaN活性增高的同时可阻止心肌肥大的发生。Meguro等[3]亦观察到CsA可通过抑制CaN活化而减轻压力超荷引起的大鼠心肌肥大。我们应用异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥大模型，CsA处理可明显减轻心重，抑制心肌细胞的肥大[4]。但也有实验报道[5～8]，应用CsA并不能阻止压力超荷性心肌肥大。出现这种矛盾结果可能与几方面的原因有关[9]：(1)腹主动脉缩窄手术操作的差异；(2)给药剂量及时间差异；(3)所选大鼠种系的差异；(4)大鼠对CsA毒性作用的敏感性不同亦增加了干扰因素，因为CsA对肾功能有损伤，可由于肾性高血压而引起继发性心肌肥大。
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当然，压力负荷作为一种最强的肥大刺激可能活化多条信号转导通路。除了CaN通路外，可能还可通过其它信号途径而引起肥大。Mende等[10]发现高表达活化Gaq蛋白的转基因鼠即可通过CaN依赖和CaN不依赖的途径而引起心肌肥大，应用CsA可减轻但不能阻止这种肥大的发生。Gaq蛋白活化是多种肥大刺激如α1肾上腺素受体激动剂、AngⅡ、ET1等引起心肌肥大的重要环节。
CaN通路在人类心脏疾病中的作用目前仍难以确定。最近，Lim等(1999)，报告来自心衰病人的心肌样本CaN活性较对照组增加4倍，提示CaN可能在心衰中亦起重要作用。CsA和FK506在临床已应用多年了，但单独观察CsA及FK506对心功能及心肌肥大影响的报告甚少。有报道5例给予FK506治疗的病人中有2例出现了心肌病；另有一报道2例肝移植患者长期应用FK506证明出现了心脏肥大。与之相反的报道是107例心脏移植病人应用CsA治疗后，左室射血分数明显提高，并明显减少了缺血事件的发生。
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三、问题及展望
CaN能否成为阻止心肌肥厚的作用靶，一个最主要的问题是CaN依赖的信号通路是否在各种形式的心肌肥大中均起主要作用，要回答这一问题必须检测CaN抑制对其它多种肥大模型的作用，如运动引起的生理性心肌肥大，容量负荷引起的心肌肥大等。但体外实验及动物实验证实的结论并不代表在人体中一定存在。在获得足够的证据以前，仍然无法在临床病人上进行观察。
CsA和FK506是已在临床上广泛应用的免疫抑制剂，但由于CsA对各器官组织的CaN没有选择性，因而可引起多种副作用，如CsA抑制肾小球及肾小管细胞中的CaN可引起肾功能损害，由之引起的高血压还可促进心肌肥大；CsA和FK506的免疫抑制作用也使其不可能成为肥大的常规抑制剂。如果能将CsA或FK506靶向投递到心脏或者开发出选择性抑制心脏CaN活性的药物，则可避免对免疫系统及肾脏的不良影响，这是今后研究的重大方向。
另外，在CaN依赖的信号传导途径中，NF-AT3是其最重要的下游步骤，NF-AT3经CaN去磷酸化后转位入核，发挥信号传递作用，NF-AT3被磷酸化后即可从核内转出，从而终止肥大信号的作用，因此NF-AT3的磷酸化亦是抑制CaN信号途径的手段之一。已有研究表明(Beals等.1998)，蛋白激酶A(PKA)可使胞质中的NFAT磷酸化，阻止其核转位；而糖原合酶激酶(GSK3)可使核中的NFAT磷酸化，导致其外出核。因此NF-AT3也可能成为阻止心肌肥厚的作用靶，其优越处是可提供心脏特异性抑制药物，避免免疫抑制等并发症。
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在基础研究方面有一个重要的问题是CaN通路与已确认的其它肥大信号途径的关系。已有资料表明(Bogoyevitch等.1996)，PKC、PKA、CaM激酶及NAPK家族成员均在肥大反应中起作用。在T细胞中发现MAPK与CaN途径是交互联系的(Rao等.1997)，如ERK2可与NF-AT4协同促进T细胞即早基因的转录活化；CaN可与PKCθ协同活化JNK，促进IL-2的表达；CaN可与Ras和CaMPKIV协同诱导AP-1依赖的T细胞的基因表达。在心肌细胞中，CaN与其它信号途径的关系仍有待研究。
最近的研究证实(Guerini等.1997)，CaN作为一种多功能信号酶参与多种细胞功能的调节，除了在免疫系统及心肌的作用外，在神经细胞的生长发育，突触可塑性的调节中起重要作用；在骨骼肌中，可参与肌纤维型转化的调节(Chin等.1998)。CaN在平滑肌细胞中是否亦起作用？已有研究表明，CaN可能参与血管平滑肌细胞(VSMC)中Ca2+的调节，其在VSMC增殖中的作用亦是一个有待研究的问题。
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CaN依赖的信号通路参与心肌肥大的发现，为防治心血管疾病开拓了一个全新的思路，即通过阻断肥大信号的传递可能达到阻止心肌肥大及心衰发生发展的目的，阐明心血管疾病的信号传递机制，对革新心血管疾病的防治手段具有重大意义。
国家自然科学基金重点项目(39730220)资助课题
参考文献
1，Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy. Cell, 1998, 93∶215～228.
2，Sussman MA, Lim HW, Gude N, et al. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science, 1998, 281∶ 1690～1693.
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3，Meguro T, Hong C, AsaiK, et al. Cyclosporin attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res, 1999, 84∶ 735～740.
4，符民桂, 王晓红, 姜志胜,等. 钙调神经磷酸酶依赖的信号通路参与血管紧张素II刺激的心肌细胞肥大. 生理学报, 1999,51∶597～601.
5，Muller JG, Neinoto S, Laser M, et al. Calcineurin inhibiton and cardiac hypertrophy. Science, 1998, 282, 1007.
6，Luo Z, shyu KG, Gualberto A, et al. Calcineurin inhibitors and cardiac hypertrophy. Nat Med, 1998, 4∶1092～1093.
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7，Zhang W, Kowal RC, Rusmak FR, et al. Failure of calcineurin inhibitors to prevent pressure-overload left ventricular hypertrophy in rats. Circ Res, 1999, 84∶722～728.
8，Ding B, Price RL, Borg TK, et al. Pressure overload induces severe hypertrophy in mice treated with cyclosporin, an inhibitor of calcineurin. Circ Res, 1999, 84∶729～734.
9，Olson EN, Molkentin JD. Prevention of cardiac hypertrophy by calcineurin inhibition: hope or hype? Circ Res, 1999, 84∶ 623～632.
10，Mende U, kagn A, Cohen A, et al. Transient cardiac expression of constitutively active Gaq leads to hypertrophy and dilated cardionmyopathy by calcineurin-dependent and independent pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95∶ 13893～13898., 百拇医药
单位：符民桂(北京医科大学第一医院心血管研究所， 北京100034) ；刘乃奎(北京医科大学第一医院心血管研究所， 北京100034)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所， 北京100034)
关键词：钙信号；心肌肥大；钙调神经磷酸酶；信号通路
生理科学进展000212 摘要 心肌肥大是心肌细胞对外界刺激, 如工作负荷、神经体液因子及内在心肌蛋白遗传突变的一种基本应答。已知胞内Ca2+浓度升高在各种刺激诱导心肌肥大的信号传递中起重要作用，但对Ca2+信号下游的传递机制一直不甚清楚。新近研究证实，由Ca2+活化的钙调神经磷酸酶(CaN)在心肌肥大的信号传递中起重要作用，其可能是Ca2+信号致肥大基因活化的偶联环节。抑制CaN活性可阻滞各种因素诱导的心肌肥大的发生与发展，提示Ca2+-CaN依赖的信号通路可能是介导心肌肥大的一条新的、重要的信号通路。
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学科分类号 Q42；R364.3
心肌肥大是指心肌细胞增大而无细胞分裂，是心肌细胞对高血压、瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心脏病等常见临床疾病的一种基本应答。由心肌肥大发展到心衰，由心衰而死亡是临床病人的主要死因之一。目前对心肌肥大的分子机制仍不清楚。很多研究表明(Hongo等.1995)，胞内Ca2+是致心肌肥大的最基本信号，但胞内Ca2+升高诱导核内肥大基因活化的信号传递机制一直不甚清楚。最近的研究表明[1]，心肌细胞内Ca2+升高可通过活化一种Ca2+/钙调素依赖的蛋白磷酸酶—钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)而启动一条向核内传递的信号通路，这条CaN依赖的信号通路可能在心肌肥大的发生、发展中起到至关重要的作用。这一重大发现受到国际学术界的广泛关注，因为它提示应用阻断信号传递的药物即可能达到防止或逆转肥厚的目的。这一发现也提出了许多有待深入研究的问题。现简要综述如下。
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一、发现经过
CaN在T淋巴细胞活化的信号传递中起重要作用已被广泛认识。尽管很早知道心肌中存在CaN，然而对其确切作用一直不清楚。1997年，Hasegawa等发现转录因子GATA4可调节多种肥大基因(如β-MHC)的转录活化，同时发现GATA4必须与另一种因子协同才能起作用。Molkentin等[1]应用酵母双杂交系统检测到GATA4的辅因子是活化T细胞的核因子(NFAT3)。已知在T细胞中，NFAT作为CaN的下游底物可介导Ca2+信号对基因表达的调节。在心肌中亦可能存在这样一种将细胞Ca2+信号与心脏基因转录活化偶联的潜在机制。
在体外培养心肌细胞中，发现CaN、GATA4和NT-AT均为活化形式存在的条件下，可使B型利钠多肽(BNP)启动子的活化增加100倍；应用CaN特异性抑制剂环孢素A(CsA)或FK506可有效地阻断血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和苯肾上腺素(PE)的致心肌细胞肥大作用。
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Molkentin等[1]构建了一种可表达CaN活化形式的转基因鼠，结果所有转基因鼠在生后18天无一例外地出现了与人类心肌肥大相似的病理变化；同样，带有活化NF-AT3突变体的转基因鼠亦出现与CaN转基因鼠相似的病理变化。如在CaN转基因鼠生后给予CsA注射则可阻止心肌肥大的发生。
Sussman等[2]发现由心肌收缩蛋白基因(如tropomodulin，fetal β-tropomyosin，myosin light chain-2v)突变而引起的小鼠心肌肥大，亦可通过抑制CaN活化而阻断。
以上研究结果表明，这条由Ca2+活化的、CaN依赖的信号通路可能在心肌肥大的发生发展中起到重要的作用。
二、新的证据
心脏工作负荷过高是引起心肌肥大的最常见原因。Sussman等[2]观察了CsA对腹主动脉缩窄引起的压力超荷性心肌肥大的作用，结果表明CsA在抑制肥大大鼠心肌CaN活性增高的同时可阻止心肌肥大的发生。Meguro等[3]亦观察到CsA可通过抑制CaN活化而减轻压力超荷引起的大鼠心肌肥大。我们应用异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥大模型，CsA处理可明显减轻心重，抑制心肌细胞的肥大[4]。但也有实验报道[5～8]，应用CsA并不能阻止压力超荷性心肌肥大。出现这种矛盾结果可能与几方面的原因有关[9]：(1)腹主动脉缩窄手术操作的差异；(2)给药剂量及时间差异；(3)所选大鼠种系的差异；(4)大鼠对CsA毒性作用的敏感性不同亦增加了干扰因素，因为CsA对肾功能有损伤，可由于肾性高血压而引起继发性心肌肥大。
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当然，压力负荷作为一种最强的肥大刺激可能活化多条信号转导通路。除了CaN通路外，可能还可通过其它信号途径而引起肥大。Mende等[10]发现高表达活化Gaq蛋白的转基因鼠即可通过CaN依赖和CaN不依赖的途径而引起心肌肥大，应用CsA可减轻但不能阻止这种肥大的发生。Gaq蛋白活化是多种肥大刺激如α1肾上腺素受体激动剂、AngⅡ、ET1等引起心肌肥大的重要环节。
CaN通路在人类心脏疾病中的作用目前仍难以确定。最近，Lim等(1999)，报告来自心衰病人的心肌样本CaN活性较对照组增加4倍，提示CaN可能在心衰中亦起重要作用。CsA和FK506在临床已应用多年了，但单独观察CsA及FK506对心功能及心肌肥大影响的报告甚少。有报道5例给予FK506治疗的病人中有2例出现了心肌病；另有一报道2例肝移植患者长期应用FK506证明出现了心脏肥大。与之相反的报道是107例心脏移植病人应用CsA治疗后，左室射血分数明显提高，并明显减少了缺血事件的发生。
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三、问题及展望
CaN能否成为阻止心肌肥厚的作用靶，一个最主要的问题是CaN依赖的信号通路是否在各种形式的心肌肥大中均起主要作用，要回答这一问题必须检测CaN抑制对其它多种肥大模型的作用，如运动引起的生理性心肌肥大，容量负荷引起的心肌肥大等。但体外实验及动物实验证实的结论并不代表在人体中一定存在。在获得足够的证据以前，仍然无法在临床病人上进行观察。
CsA和FK506是已在临床上广泛应用的免疫抑制剂，但由于CsA对各器官组织的CaN没有选择性，因而可引起多种副作用，如CsA抑制肾小球及肾小管细胞中的CaN可引起肾功能损害，由之引起的高血压还可促进心肌肥大；CsA和FK506的免疫抑制作用也使其不可能成为肥大的常规抑制剂。如果能将CsA或FK506靶向投递到心脏或者开发出选择性抑制心脏CaN活性的药物，则可避免对免疫系统及肾脏的不良影响，这是今后研究的重大方向。
另外，在CaN依赖的信号传导途径中，NF-AT3是其最重要的下游步骤，NF-AT3经CaN去磷酸化后转位入核，发挥信号传递作用，NF-AT3被磷酸化后即可从核内转出，从而终止肥大信号的作用，因此NF-AT3的磷酸化亦是抑制CaN信号途径的手段之一。已有研究表明(Beals等.1998)，蛋白激酶A(PKA)可使胞质中的NFAT磷酸化，阻止其核转位；而糖原合酶激酶(GSK3)可使核中的NFAT磷酸化，导致其外出核。因此NF-AT3也可能成为阻止心肌肥厚的作用靶，其优越处是可提供心脏特异性抑制药物，避免免疫抑制等并发症。
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在基础研究方面有一个重要的问题是CaN通路与已确认的其它肥大信号途径的关系。已有资料表明(Bogoyevitch等.1996)，PKC、PKA、CaM激酶及NAPK家族成员均在肥大反应中起作用。在T细胞中发现MAPK与CaN途径是交互联系的(Rao等.1997)，如ERK2可与NF-AT4协同促进T细胞即早基因的转录活化；CaN可与PKCθ协同活化JNK，促进IL-2的表达；CaN可与Ras和CaMPKIV协同诱导AP-1依赖的T细胞的基因表达。在心肌细胞中，CaN与其它信号途径的关系仍有待研究。
最近的研究证实(Guerini等.1997)，CaN作为一种多功能信号酶参与多种细胞功能的调节，除了在免疫系统及心肌的作用外，在神经细胞的生长发育，突触可塑性的调节中起重要作用；在骨骼肌中，可参与肌纤维型转化的调节(Chin等.1998)。CaN在平滑肌细胞中是否亦起作用？已有研究表明，CaN可能参与血管平滑肌细胞(VSMC)中Ca2+的调节，其在VSMC增殖中的作用亦是一个有待研究的问题。
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CaN依赖的信号通路参与心肌肥大的发现，为防治心血管疾病开拓了一个全新的思路，即通过阻断肥大信号的传递可能达到阻止心肌肥大及心衰发生发展的目的，阐明心血管疾病的信号传递机制，对革新心血管疾病的防治手段具有重大意义。
国家自然科学基金重点项目(39730220)资助课题
参考文献
1，Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy. Cell, 1998, 93∶215～228.
2，Sussman MA, Lim HW, Gude N, et al. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science, 1998, 281∶ 1690～1693.
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3，Meguro T, Hong C, AsaiK, et al. Cyclosporin attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res, 1999, 84∶ 735～740.
4，符民桂, 王晓红, 姜志胜,等. 钙调神经磷酸酶依赖的信号通路参与血管紧张素II刺激的心肌细胞肥大. 生理学报, 1999,51∶597～601.
5，Muller JG, Neinoto S, Laser M, et al. Calcineurin inhibiton and cardiac hypertrophy. Science, 1998, 282, 1007.
6，Luo Z, shyu KG, Gualberto A, et al. Calcineurin inhibitors and cardiac hypertrophy. Nat Med, 1998, 4∶1092～1093.
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7，Zhang W, Kowal RC, Rusmak FR, et al. Failure of calcineurin inhibitors to prevent pressure-overload left ventricular hypertrophy in rats. Circ Res, 1999, 84∶722～728.
8，Ding B, Price RL, Borg TK, et al. Pressure overload induces severe hypertrophy in mice treated with cyclosporin, an inhibitor of calcineurin. Circ Res, 1999, 84∶729～734.
9，Olson EN, Molkentin JD. Prevention of cardiac hypertrophy by calcineurin inhibition: hope or hype? Circ Res, 1999, 84∶ 623～632.
10，Mende U, kagn A, Cohen A, et al. Transient cardiac expression of constitutively active Gaq leads to hypertrophy and dilated cardionmyopathy by calcineurin-dependent and independent pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95∶ 13893～13898., 百拇医药