氧化乐果和乐果对爪蟾胚胎培养神经肌肉细胞突触传递的影响
作者：徐海滨 贺锡雯 谢佐平 何凤生
单位：徐海滨 贺锡雯 何凤生 100050 北京，中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所；谢佐平 清华大学生命科学与技术系
关键词：有机磷杀虫剂；神经肌肉接头；膜片钳；非洲爪蟾
中华劳动卫生职业病杂志980603 【摘要】 目的 研究有机磷杀虫剂氧化乐果、乐果对非洲爪蟾胚胎神经肌肉细胞突触传递的影响。方法 使用膜片钳技术。结果 较高剂量氧化乐果(30.2 μmol/L)、乐果(237 μmol/L)均降低自发微终板电流(MEPC)的幅度和频率，并以高幅度(300～600 pA)电流下降为主。MEPC的幅度分布左移。结论 氧化乐果、乐果的作用部位在突触后,从分子水平上为有机磷杀虫剂对神经肌肉接头的直接作用提供了依据。
The effects of omethoate and dimethoate on neuro-muscular synapse transmission in cultured Xenopus embryo
, 百拇医药
Xu Haibin*,He Xiwen,Xie Zuoping,et al.*
Institute of Occupational Medicine,Chinese Acadamy of Preventive Medicine,100050
【Abstract】 Objective To study the transmission effects of omethoate and dimethoate,both organophosphrous pesticides,on the membrane of embryonic Xenopus muscle cell in culture. Method Patch-clamp technique was used in the study. Results Omethoate at a higher concentration (30.2 μmol/L) and dimethoate (237 μmol/L) obviously decreased the amplitude and frequency of miniature endplate currents(MEPC),particularly,the higher amplitude MEPC (300～600 pA) decreased more than the lower one with a left shift in the distribution of MEPC. Conclusion Omethoate and dimethoate were confirmed to have postsynaptic effects on neuromuscular junction.
, 百拇医药
【Key words】 Organophosphorus pesticide Neuromuscular junction Patch-clamp Xenopus laevis
传统上认为杀虫剂是通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而产生毒性作用。随着乙酰胆碱受体(AChR)的分子生物学和受体毒理学研究的迅速发展，有机磷杀虫剂对AChR的直接作用引起毒理学家们的极大兴趣[1～3]。烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)是神经肌肉接头(NMJ)处的主要受体蛋白。有机磷杀虫剂对nAChR的直接作用势必要影响NMJ的正常功能。近年发展起来的膜片钳技术能直接观察到可兴奋细胞生物电活动，我们首次利用这一技术观察了有机磷杀虫剂氧化乐果、乐果对非洲爪蟾胚胎NMJ突触传递的影响并探讨其作用位点。
材料与方法
1.材料：96%氧化乐果由上海农药研究所标准室提供。98%乐果由上海农药厂提供。30 mm塑料培养皿(Fluka公司)，胎牛血清(Sigma公司)，玻璃毛细管(VWR科学公司)。
, http://www.100md.com
2.细胞培养技术：(1)采卵：将分别注射过人绒毛膜促性腺激素(HCG)的雌、雄非洲爪蟾(Xenopus leavis)各1只放在暗处，每次注射剂量250 IU(0.5 mg),使其受精、排卵。第2天选择发育良好的胚胎保存待用。(2)细胞培养：取22期(受精24小时)蛙胚，无菌条件下培养。先用75%酒精消毒，在10%Ringer液中剥去卵膜，另用10%Ringer液轻洗4遍，在无Ca2+及Mg2+的Ringer液中剪下背部中段的神经管和少量中胚层细胞，放置消化约20～30分钟，细胞自然散开。用新拉制的毛细管吸取细胞，划线接种在塑料培养皿内事先固定好的干净盖玻片上，培养液总量2 ml，放入25℃培养箱中培养24小时后进行电生理学实验。培养基成分(pH7.2)：Leibovitzmedium (L15) 30%、胎牛血清2%、Ringer液68%。Ringer液(pH7.4,mmol/L)：NaCl 115.0、CaCl2 2.0、KCl 2.5、HEPES 10.0。
, 百拇医药
3.单通道技术：(1)电极的拉制：利用微电极拉制仪(Nauishige Japan PP-83)，拉制出尖端约1 μm的玻璃毛细管电极。在微电极尖端涂上树脂(sylgard)并烤干，然后用微电极抛光仪(Nauishige MF-83)抛光，使尖端光滑并且开口在0.65±0.15 μm之间，拉制过程中避免电极的污染。(2)离子单通道仪器及膜片钳技术：用单通道放大(List EPC-7)记录仪记录信号于示波器(TEAC-XR-30C)并存入微机或磁带记录仪(TEAC-30C)。实验结果用双道记录仪(GOULD-2200)绘制。利用全细胞式膜片钳技术进行本实验。记录工作在上述培养基中进行。电极内液组成(pH 7.2,mmol/L)：KCl 82、KOH 35、CaCl2 1、EGTA 11、HEPE 5，培养和记录都在室温20～25℃下进行。
结果
1.氧化乐果、乐果对肌细胞膜静息电位的影响：在全细胞电流钳制方式下可记录到非洲爪蟾肌细胞膜的静息电位为-78.03 mV (n=13)，此结果与汤云贵等[4]报道的-77.5 mV基本一致。氧化乐果162 μmol/L作用10分钟，静息电位为-77.5±2.06 mV，加药前、后差异无显著性；乐果108 μmol/L在相同条件下也观察到同样的结果,提示该浓度对肌细胞膜功能无影响。
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2.氧化乐果和乐果对NMJ传递的影响：在培养的细胞中可见形态各异的神经元和肌细胞。有些神经元和肌细胞形成接点联系。以前的工作证明这种联系是胆碱能性的[5]，对这类肌细胞进行全细胞电流钳制可以观察到NMJ处的自发微终板电位(MEPP)以及由MEPP引发的肌细胞动作电位(AP)。从图1可见:162 μmol/L氧化乐果作用5分钟后AP(B)的发放比加药前(A)明显减少，10分钟后完全消失(C)，而MEPP在AP消失后仍然存在。按同样的方法观察了乐果(108 μmol/L)对MEPP和AP的影响，结果相同。
图1 氧化乐果(162 μmol/L)对神经-肌肉接头MEPP和AP影响的扫描记录,(A)加药前;(B)加药5 min后;(C)加药10 min后(记录时间60 s,乐果对神经-肌肉接头MEPP和AP的影响同氧化乐果)
Fig 1 Multiple sweep recordings of MEPP and AP of a neurite-muscle junction before(A) and 5 min(B) and 10 min(C),after adding omethoate(162 μmol/L),recording for 60 s(Effects of dimethoate on MEPP and AP of a neurite-muscle junction were the same as omethoate)
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3.氧化乐果、乐果对自发微终板电流(MEPC)的影响：电压钳方式下记录的是微终板样电流活动，不同肌细胞上的MEPC频率和幅度相差很大，同一细胞MEPC的频率也随时间而波动，但MEPC的幅度基本围绕一固定值波动,见图2。
以前的研究证实：氧化乐果、乐果对MEPC的影响具有浓度依赖性[6，7]。30.2 μmol/L氧化乐果使MEPC的幅度变小，加药前及加药后的结果见图3;237 μmol/L乐果的作用趋势与氧化乐果类似，见图4。从图3、图4可见:加药10分钟后MEPC幅度分布左移，即向小幅度方向移动(与图2比较)。提示氧化乐果、乐果的作用部位在突触后。
1：～100 pA, 2:～200 pA, 3:～300 pA, 4:～400 pA,5:～500 pA,6:～600 pA, 7:～700 pA, 8:～800 pA, 9:>800 pA
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图2 培养非洲爪蟾胚胎神经-肌肉接头MEPC的正常幅度-时间直方图(全细胞电压钳制,记录时间5 min),0 min: 阻封接后立即记录,20 min:加药20 min后记录
Fig 2 Normal amplitude-time histograph of MEPC of a neurite-muscle junction under whole-cell voltage clamp on an embryo of Xenopus(recording time,5 min),0 min:immediately after sealing;20 min:20 min after sealing
1：～100 pA, 2:～200 pA, 3:～300 pA, 4:～400 pA,5:～500 pA, 6:～600 pA, 7:～700 pA, 8:～800 pA, 9:>800 pA
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图3 30.2 μmol/L乐果对神经-肌肉接头MEPC的影响
Fig 3 Effect of omethoate(30.2 μmol/L) on the amplitude of MEPC
1：～100 pA, 2:～200 pA, 3:～300 pA, 4:～400 pA,5:～500 pA, 6:～600 pA, 7:～700 pA, 8:～800 pA, 9:>800 pA
图4 237 μmol/L乐果对神经-肌肉接头MEPC的影响
Fig 4 Effect of dimethoate(237 μmol/L) on the amplitude of MEPC
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讨论
非洲爪蟾胚胎期神经末梢自发释放乙酰胆碱，造成胚胎肌细胞膜的去极化，引起MEPP样活动。与成熟的神经肌肉接点相比，这些去极化在幅度上较大，其中一些能在突触后膜大幅度去极化时引发动作电位，从而导致肌细胞收缩。氧化乐果和乐果在较高的浓度下明显减少乃至阻断动作电位的发放，提示氧化乐果和乐果对突触传递有阻断作用。由于MEPC的幅度反映突触后的性质[8]，故可用其幅度的变化来反映药物或毒物对突触后膜作用的存在。在电压钳制条件下，氧化乐果和乐果减少MEPC的频率和幅度，并且以减少高幅值的MEPC为主,直接证实了氧化乐果和乐果对突触后膜的阻断作用。突触后膜的去极化与肌细胞膜的钠、钾离子电流密切相关，有关实验证实：在高浓度下，氧化乐果和乐果对肌细胞膜的钠、钾离子电流无明显影响[6，7],从而排除了有机磷杀虫剂对NMJ传递的作用发生在肌细胞钠、钾通道上的可能性。
有机磷杀虫剂是一种经典的神经毒物，它对AChE的抑制机理不能完全解释其中毒的所有现象，它对NMJ传递的影响，以及对突触后乙酰胆碱受体的直接阻断作用，都有助于更完善地解释其中毒机制，并为临床有机磷中毒病人的诊断和治疗提供新的思路和方法。
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本课题受卫生部科研基金资助
参考文献
1.Albuquerque EX,Aracava Y.The interaction of antichlolinesterase agents with the acetylcholine receptor-ionic channel complex.J Appl Toxicol,1984,4:28～33.
2.Tattersall JEH.Effects of organophosphorus anticholinesterases on nicotinic receptor ion channel at adult mouse muscle endplate.Br J Pharmacol,1990,101:345～357.
3.徐海滨，贺锡雯，谢佐平，等.有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体通道的阻断作用.卫生研究，1997，26：154～158.
, http://www.100md.com
4.汤云贵，谢佐平.突触后细胞电活动对神经肌肉接头发育的作用.中国科学(B辑)，1993，8：855～860.
5.Xie ZP,Wabg T,Zhu YT.Whole-cell clamp study of Xenopus embryonic cholinergic neurons.Sci Sin(B),1989,32:148～154.
6.徐海滨，贺锡雯，谢佐平，等.氧化乐果对烟碱样乙酰胆碱受体离子通道的阻断作用.中国药理学与毒理学杂志，1997，(4):286～290.
7.Xie ZP,Poo MM.Initial events in the formation of neuromuscular synapse:Rapid induction of acetylcholine release from embryonic neuron.Proc Natl Sci USA,1986,83:7069～7073.
8.Senanayake N,Karallieddel.Neurotoxic effects of orgnophosphorus insecticide.An intermediate syndrome.N Engl J Med,1987,316:761～763.
收稿：1998-05-06, 百拇医药
单位：徐海滨 贺锡雯 何凤生 100050 北京，中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所；谢佐平 清华大学生命科学与技术系
关键词：有机磷杀虫剂；神经肌肉接头；膜片钳；非洲爪蟾
中华劳动卫生职业病杂志980603 【摘要】 目的 研究有机磷杀虫剂氧化乐果、乐果对非洲爪蟾胚胎神经肌肉细胞突触传递的影响。方法 使用膜片钳技术。结果 较高剂量氧化乐果(30.2 μmol/L)、乐果(237 μmol/L)均降低自发微终板电流(MEPC)的幅度和频率，并以高幅度(300～600 pA)电流下降为主。MEPC的幅度分布左移。结论 氧化乐果、乐果的作用部位在突触后,从分子水平上为有机磷杀虫剂对神经肌肉接头的直接作用提供了依据。
The effects of omethoate and dimethoate on neuro-muscular synapse transmission in cultured Xenopus embryo
, 百拇医药
Xu Haibin*,He Xiwen,Xie Zuoping,et al.*
Institute of Occupational Medicine,Chinese Acadamy of Preventive Medicine,100050
【Abstract】 Objective To study the transmission effects of omethoate and dimethoate,both organophosphrous pesticides,on the membrane of embryonic Xenopus muscle cell in culture. Method Patch-clamp technique was used in the study. Results Omethoate at a higher concentration (30.2 μmol/L) and dimethoate (237 μmol/L) obviously decreased the amplitude and frequency of miniature endplate currents(MEPC),particularly,the higher amplitude MEPC (300～600 pA) decreased more than the lower one with a left shift in the distribution of MEPC. Conclusion Omethoate and dimethoate were confirmed to have postsynaptic effects on neuromuscular junction.
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【Key words】 Organophosphorus pesticide Neuromuscular junction Patch-clamp Xenopus laevis
传统上认为杀虫剂是通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而产生毒性作用。随着乙酰胆碱受体(AChR)的分子生物学和受体毒理学研究的迅速发展，有机磷杀虫剂对AChR的直接作用引起毒理学家们的极大兴趣[1～3]。烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)是神经肌肉接头(NMJ)处的主要受体蛋白。有机磷杀虫剂对nAChR的直接作用势必要影响NMJ的正常功能。近年发展起来的膜片钳技术能直接观察到可兴奋细胞生物电活动，我们首次利用这一技术观察了有机磷杀虫剂氧化乐果、乐果对非洲爪蟾胚胎NMJ突触传递的影响并探讨其作用位点。
材料与方法
1.材料：96%氧化乐果由上海农药研究所标准室提供。98%乐果由上海农药厂提供。30 mm塑料培养皿(Fluka公司)，胎牛血清(Sigma公司)，玻璃毛细管(VWR科学公司)。
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2.细胞培养技术：(1)采卵：将分别注射过人绒毛膜促性腺激素(HCG)的雌、雄非洲爪蟾(Xenopus leavis)各1只放在暗处，每次注射剂量250 IU(0.5 mg),使其受精、排卵。第2天选择发育良好的胚胎保存待用。(2)细胞培养：取22期(受精24小时)蛙胚，无菌条件下培养。先用75%酒精消毒，在10%Ringer液中剥去卵膜，另用10%Ringer液轻洗4遍，在无Ca2+及Mg2+的Ringer液中剪下背部中段的神经管和少量中胚层细胞，放置消化约20～30分钟，细胞自然散开。用新拉制的毛细管吸取细胞，划线接种在塑料培养皿内事先固定好的干净盖玻片上，培养液总量2 ml，放入25℃培养箱中培养24小时后进行电生理学实验。培养基成分(pH7.2)：Leibovitzmedium (L15) 30%、胎牛血清2%、Ringer液68%。Ringer液(pH7.4,mmol/L)：NaCl 115.0、CaCl2 2.0、KCl 2.5、HEPES 10.0。
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3.单通道技术：(1)电极的拉制：利用微电极拉制仪(Nauishige Japan PP-83)，拉制出尖端约1 μm的玻璃毛细管电极。在微电极尖端涂上树脂(sylgard)并烤干，然后用微电极抛光仪(Nauishige MF-83)抛光，使尖端光滑并且开口在0.65±0.15 μm之间，拉制过程中避免电极的污染。(2)离子单通道仪器及膜片钳技术：用单通道放大(List EPC-7)记录仪记录信号于示波器(TEAC-XR-30C)并存入微机或磁带记录仪(TEAC-30C)。实验结果用双道记录仪(GOULD-2200)绘制。利用全细胞式膜片钳技术进行本实验。记录工作在上述培养基中进行。电极内液组成(pH 7.2,mmol/L)：KCl 82、KOH 35、CaCl2 1、EGTA 11、HEPE 5，培养和记录都在室温20～25℃下进行。
结果
1.氧化乐果、乐果对肌细胞膜静息电位的影响：在全细胞电流钳制方式下可记录到非洲爪蟾肌细胞膜的静息电位为-78.03 mV (n=13)，此结果与汤云贵等[4]报道的-77.5 mV基本一致。氧化乐果162 μmol/L作用10分钟，静息电位为-77.5±2.06 mV，加药前、后差异无显著性；乐果108 μmol/L在相同条件下也观察到同样的结果,提示该浓度对肌细胞膜功能无影响。
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2.氧化乐果和乐果对NMJ传递的影响：在培养的细胞中可见形态各异的神经元和肌细胞。有些神经元和肌细胞形成接点联系。以前的工作证明这种联系是胆碱能性的[5]，对这类肌细胞进行全细胞电流钳制可以观察到NMJ处的自发微终板电位(MEPP)以及由MEPP引发的肌细胞动作电位(AP)。从图1可见:162 μmol/L氧化乐果作用5分钟后AP(B)的发放比加药前(A)明显减少，10分钟后完全消失(C)，而MEPP在AP消失后仍然存在。按同样的方法观察了乐果(108 μmol/L)对MEPP和AP的影响，结果相同。
图1 氧化乐果(162 μmol/L)对神经-肌肉接头MEPP和AP影响的扫描记录,(A)加药前;(B)加药5 min后;(C)加药10 min后(记录时间60 s,乐果对神经-肌肉接头MEPP和AP的影响同氧化乐果)
Fig 1 Multiple sweep recordings of MEPP and AP of a neurite-muscle junction before(A) and 5 min(B) and 10 min(C),after adding omethoate(162 μmol/L),recording for 60 s(Effects of dimethoate on MEPP and AP of a neurite-muscle junction were the same as omethoate)
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3.氧化乐果、乐果对自发微终板电流(MEPC)的影响：电压钳方式下记录的是微终板样电流活动，不同肌细胞上的MEPC频率和幅度相差很大，同一细胞MEPC的频率也随时间而波动，但MEPC的幅度基本围绕一固定值波动,见图2。
以前的研究证实：氧化乐果、乐果对MEPC的影响具有浓度依赖性[6，7]。30.2 μmol/L氧化乐果使MEPC的幅度变小，加药前及加药后的结果见图3;237 μmol/L乐果的作用趋势与氧化乐果类似，见图4。从图3、图4可见:加药10分钟后MEPC幅度分布左移，即向小幅度方向移动(与图2比较)。提示氧化乐果、乐果的作用部位在突触后。
1：～100 pA, 2:～200 pA, 3:～300 pA, 4:～400 pA,5:～500 pA,6:～600 pA, 7:～700 pA, 8:～800 pA, 9:>800 pA
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图2 培养非洲爪蟾胚胎神经-肌肉接头MEPC的正常幅度-时间直方图(全细胞电压钳制,记录时间5 min),0 min: 阻封接后立即记录,20 min:加药20 min后记录
Fig 2 Normal amplitude-time histograph of MEPC of a neurite-muscle junction under whole-cell voltage clamp on an embryo of Xenopus(recording time,5 min),0 min:immediately after sealing;20 min:20 min after sealing
1：～100 pA, 2:～200 pA, 3:～300 pA, 4:～400 pA,5:～500 pA, 6:～600 pA, 7:～700 pA, 8:～800 pA, 9:>800 pA
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图3 30.2 μmol/L乐果对神经-肌肉接头MEPC的影响
Fig 3 Effect of omethoate(30.2 μmol/L) on the amplitude of MEPC
1：～100 pA, 2:～200 pA, 3:～300 pA, 4:～400 pA,5:～500 pA, 6:～600 pA, 7:～700 pA, 8:～800 pA, 9:>800 pA
图4 237 μmol/L乐果对神经-肌肉接头MEPC的影响
Fig 4 Effect of dimethoate(237 μmol/L) on the amplitude of MEPC
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非洲爪蟾胚胎期神经末梢自发释放乙酰胆碱，造成胚胎肌细胞膜的去极化，引起MEPP样活动。与成熟的神经肌肉接点相比，这些去极化在幅度上较大，其中一些能在突触后膜大幅度去极化时引发动作电位，从而导致肌细胞收缩。氧化乐果和乐果在较高的浓度下明显减少乃至阻断动作电位的发放，提示氧化乐果和乐果对突触传递有阻断作用。由于MEPC的幅度反映突触后的性质[8]，故可用其幅度的变化来反映药物或毒物对突触后膜作用的存在。在电压钳制条件下，氧化乐果和乐果减少MEPC的频率和幅度，并且以减少高幅值的MEPC为主,直接证实了氧化乐果和乐果对突触后膜的阻断作用。突触后膜的去极化与肌细胞膜的钠、钾离子电流密切相关，有关实验证实：在高浓度下，氧化乐果和乐果对肌细胞膜的钠、钾离子电流无明显影响[6，7],从而排除了有机磷杀虫剂对NMJ传递的作用发生在肌细胞钠、钾通道上的可能性。
有机磷杀虫剂是一种经典的神经毒物，它对AChE的抑制机理不能完全解释其中毒的所有现象，它对NMJ传递的影响，以及对突触后乙酰胆碱受体的直接阻断作用，都有助于更完善地解释其中毒机制，并为临床有机磷中毒病人的诊断和治疗提供新的思路和方法。
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本课题受卫生部科研基金资助
参考文献
1.Albuquerque EX,Aracava Y.The interaction of antichlolinesterase agents with the acetylcholine receptor-ionic channel complex.J Appl Toxicol,1984,4:28～33.
2.Tattersall JEH.Effects of organophosphorus anticholinesterases on nicotinic receptor ion channel at adult mouse muscle endplate.Br J Pharmacol,1990,101:345～357.
3.徐海滨，贺锡雯，谢佐平，等.有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体通道的阻断作用.卫生研究，1997，26：154～158.
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4.汤云贵，谢佐平.突触后细胞电活动对神经肌肉接头发育的作用.中国科学(B辑)，1993，8：855～860.
5.Xie ZP,Wabg T,Zhu YT.Whole-cell clamp study of Xenopus embryonic cholinergic neurons.Sci Sin(B),1989,32:148～154.
6.徐海滨，贺锡雯，谢佐平，等.氧化乐果对烟碱样乙酰胆碱受体离子通道的阻断作用.中国药理学与毒理学杂志，1997，(4):286～290.
7.Xie ZP,Poo MM.Initial events in the formation of neuromuscular synapse:Rapid induction of acetylcholine release from embryonic neuron.Proc Natl Sci USA,1986,83:7069～7073.
8.Senanayake N,Karallieddel.Neurotoxic effects of orgnophosphorus insecticide.An intermediate syndrome.N Engl J Med,1987,316:761～763.
收稿：1998-05-06, 百拇医药