造血干细胞移植中低温冷冻保存技术规范化操作探讨
作者：邢献志 曹琼 李玲 阴继霞
单位：邢献志 曹琼 李玲 阴继霞(510515 广州市，第一军医大学外科中心实验室)
关键词：造血干细胞；低温冻存；操作；规范化
中华医院管理杂志990210 摘要 我们回顾性地分析了本室自1989～1997年以来，经过系列实验研究与临床应用，较好地建立了骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞在深低温下安全、长久地保存以及复温、回输等一系列的实验规范化操作方法。此方法从实验用物准备到实验操作技巧，从试剂的配制到细胞的保存，从仪器的使用保养到实验数据的测试报告，均做到了制度化、规范化，杜绝了因实验操作不当而造成的移植物污染，保证了低温冻存物的质量，为临床进行造血干细胞移植提供了可靠的保证。
A discussion on the standard procedures of low temperature conservation technology in hematopoietic stem cell transplantation
, http://www.100md.com
Xing Xianzhi, Cao Qiong, Li Ling, et al.
The surgical central lab of No.1 medical university of PLA, Guangzhou 510515
Abstract The authors retrospectively analyzed a series of lab procedure protocols during 1989 through 1997 in extablishing methodology of conserving, rewarming, re-infusing bone marrow stem cell (or cord blood and peripheral blood) safely at low temperature based on a series of experiments and clinical applications. In large scopes from materials preparation to experiment skills, from reagent preparation to cell conservation, and from equipment maintenance to data report, this methodology has been systematized and standardized to prevent implants contamination from incorrect performance and assure quality of frozen materials and has provided reliable gurantee for hematopoietic stem cell transplantation.
, 百拇医药
Key Words Hematopoietic stem cell Frozen storage Standard procedures
骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞深低温下保存、复温、回输是骨髓移植中不可缺少的重要环节。1989年以来，我室较早地开展了骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞的低温保存的实验技术与临床应用研究，从骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞的采集、分离、冻存、复温、回输等几个方面进行了较细致的研究与探索，建立了骨髓(大容量分离冻存)，脐带血(小容量分离冻存)，外周血(血细胞分离机分离悬液冻存)造血干细胞在深低温下安全、长久保存及复温的一系列实验规范化操作方法及严格的规章制度，杜绝了因实验操作不当而导致的样品污染。现报告如下：
对象与方法
(一)样品来源：实验室冻存处理的骨髓、脐带血、外周血造血干细胞均为本院1989年12月至1997年12月住院的病人，男性39例，女性28例，年龄1天至63天，其中非何杰金氏淋巴瘤16例，急性淋巴细胞性白血病22例，慢性粒细胞性白血病10例，其它恶性白血病10例，正常顺产脐带血9份。
, http://www.100md.com
(二)实验用物及场所：
1.实验所用物品：血液保存袋(上海中心血站)，低温冷冻袋，注射器均采用一次性物品，二甲基亚砜所用RPMI 1640培养基经正压抽滤除菌后培养，热源试验均为阴性后方可使用。
2.洁净层流室处理：①由专人定期进行清洁消毒，每周2次用1∶200洗必泰擦洗地面及物品，紫外线照射1小时，并于每次实验前再用1∶2000洗必泰与75%酒精交替擦拭工作台及紫外线照射30分钟。在使用紫外线灯管照射时，必须保持层流室清洁、干燥，温度在20℃～28℃为宜，相对湿度不超过45%。②开启层流室内压缩机30分钟后方可使用，以保证过滤效果。每月进行室内空气培养1次，常规行落下菌及浮游菌测定。空气细菌菌落培养总数CFU/m2≤10个。③定期对紫外线灯进行检测，切实保证消毒灭菌的效果。我们应用紫外辐照计-254(中国建材院石英玻璃科学研究所)每3～6个月检测一次紫外线灯，还采用紫外线强度指示卡不定期地对紫外线灯管进行检测，对于辐射强度<70uw/cm2的紫外线灯全部予以更换。
, 百拇医药
(三)实验操作：
1.入室要求：操作人员在进入层流室之前先在缓冲间内更换拖鞋，用1∶2000洗必泰泡手3～5分钟，戴好口罩帽子，着无菌隔离衣在垂直层流器下站立2～3分钟后方可进入层流室。
2.操作原则：操作人员在操作过程中严格按照无菌技术的要求进行，从细胞的采集到分离，样本的分袋到封口，试剂的配制到程序降温，最后于液氮中的保存均按规范化操作细则执行。操作过程中重点注意“四防”，①样品分袋时防污染，由于分袋时操作繁琐，因此，应该重点注意避免此环节的污染；②配制冷冻防护液时防产热，在配液时应在0℃～4℃下进行，防止温度过高时二甲基亚砜对细胞产生毒性作用，从而影响保存效果；③封口时注意排尽冷冻袋内空气，防止因袋内空气过多而导致复温时冷冻袋破裂；④复温后回输要快，避免样品在室温过久产热而出现絮状或凝块。
结 果
自1989年9月至1997年12月以来，已为本院67例骨髓移植病人进行造血干细胞低温冻存109人次，其中骨髓的采集、分离、冻存15人次，外周血的采集、分离、冻存85人次，脐带血的收集冻存9人次。有核细胞、单个核细胞及台盼兰拒染回收率分别为103.7%、98.7%和96.2%。用于临床移植或输注的病人，无1例因实验操作处理不当而出现样品污染，复温中无1例发生冷冻袋破裂。
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讨 论
医院感染管理是当前医院管理工作中的一项重大课题，是医院管理的重要组成部分，随着临床造血干细胞移植工作的深入和广泛开展，移植实验技术规范化操作也日趋重要，严格管理措施，开展必要监测，院内组织落实已列入我院工作重点。由于我室注意提高实验人员的业务素质，开展在职人员的岗位培训，建立了一系列相应的规章制度，设立专人专项管理，做到实验用物标准化，技术操作规范化，实验数据科学化，保证了临床移植工作的正常顺利进行，同时使实验室的规范化操作管理得以落实。医院感染管理是当前医院管理工作中的一项重大课题，是医院管理的重要组成部分，随着临床造血干细胞移植工作的深入和广泛开展，移植实验技术规范化操作也日趋重要，严格管理措施，开展必要监测，院内组织落实已列入我院工作重点。由于我室注意提高实验人员的业务素质，开展在职人员的岗位培训，建立了一系列相应的规章制度，设立专人专项管理，做到实验用物标准化，技术操作规范化，实验数据科学化，保证了临床移植工作的正常顺利进行，同时使实验室的规范化操作管理得以落实。
参考文献
[1]杨云海，陈薇，等.紫外线间接照射空气消毒效果研究.中华医院感染学杂志，1997，7：226.
[2]邓晓.对影响紫外线照射强度因素调查分析.第一军医大学学报，1997，17(增刊)：442.
[3]顾春英，薛广波.细菌对消毒剂的研究进展.中华医院感染学杂志，1997，7：252.
(收稿：1998-03-23), http://www.100md.com
单位：邢献志 曹琼 李玲 阴继霞(510515 广州市，第一军医大学外科中心实验室)
关键词：造血干细胞；低温冻存；操作；规范化
中华医院管理杂志990210 摘要 我们回顾性地分析了本室自1989～1997年以来，经过系列实验研究与临床应用，较好地建立了骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞在深低温下安全、长久地保存以及复温、回输等一系列的实验规范化操作方法。此方法从实验用物准备到实验操作技巧，从试剂的配制到细胞的保存，从仪器的使用保养到实验数据的测试报告，均做到了制度化、规范化，杜绝了因实验操作不当而造成的移植物污染，保证了低温冻存物的质量，为临床进行造血干细胞移植提供了可靠的保证。
A discussion on the standard procedures of low temperature conservation technology in hematopoietic stem cell transplantation
, http://www.100md.com
Xing Xianzhi, Cao Qiong, Li Ling, et al.
The surgical central lab of No.1 medical university of PLA, Guangzhou 510515
Abstract The authors retrospectively analyzed a series of lab procedure protocols during 1989 through 1997 in extablishing methodology of conserving, rewarming, re-infusing bone marrow stem cell (or cord blood and peripheral blood) safely at low temperature based on a series of experiments and clinical applications. In large scopes from materials preparation to experiment skills, from reagent preparation to cell conservation, and from equipment maintenance to data report, this methodology has been systematized and standardized to prevent implants contamination from incorrect performance and assure quality of frozen materials and has provided reliable gurantee for hematopoietic stem cell transplantation.
, 百拇医药
Key Words Hematopoietic stem cell Frozen storage Standard procedures
骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞深低温下保存、复温、回输是骨髓移植中不可缺少的重要环节。1989年以来，我室较早地开展了骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞的低温保存的实验技术与临床应用研究，从骨髓(脐带血、外周血)造血干细胞的采集、分离、冻存、复温、回输等几个方面进行了较细致的研究与探索，建立了骨髓(大容量分离冻存)，脐带血(小容量分离冻存)，外周血(血细胞分离机分离悬液冻存)造血干细胞在深低温下安全、长久保存及复温的一系列实验规范化操作方法及严格的规章制度，杜绝了因实验操作不当而导致的样品污染。现报告如下：
对象与方法
(一)样品来源：实验室冻存处理的骨髓、脐带血、外周血造血干细胞均为本院1989年12月至1997年12月住院的病人，男性39例，女性28例，年龄1天至63天，其中非何杰金氏淋巴瘤16例，急性淋巴细胞性白血病22例，慢性粒细胞性白血病10例，其它恶性白血病10例，正常顺产脐带血9份。
, http://www.100md.com
(二)实验用物及场所：
1.实验所用物品：血液保存袋(上海中心血站)，低温冷冻袋，注射器均采用一次性物品，二甲基亚砜所用RPMI 1640培养基经正压抽滤除菌后培养，热源试验均为阴性后方可使用。
2.洁净层流室处理：①由专人定期进行清洁消毒，每周2次用1∶200洗必泰擦洗地面及物品，紫外线照射1小时，并于每次实验前再用1∶2000洗必泰与75%酒精交替擦拭工作台及紫外线照射30分钟。在使用紫外线灯管照射时，必须保持层流室清洁、干燥，温度在20℃～28℃为宜，相对湿度不超过45%。②开启层流室内压缩机30分钟后方可使用，以保证过滤效果。每月进行室内空气培养1次，常规行落下菌及浮游菌测定。空气细菌菌落培养总数CFU/m2≤10个。③定期对紫外线灯进行检测，切实保证消毒灭菌的效果。我们应用紫外辐照计-254(中国建材院石英玻璃科学研究所)每3～6个月检测一次紫外线灯，还采用紫外线强度指示卡不定期地对紫外线灯管进行检测，对于辐射强度<70uw/cm2的紫外线灯全部予以更换。
, 百拇医药
(三)实验操作：
1.入室要求：操作人员在进入层流室之前先在缓冲间内更换拖鞋，用1∶2000洗必泰泡手3～5分钟，戴好口罩帽子，着无菌隔离衣在垂直层流器下站立2～3分钟后方可进入层流室。
2.操作原则：操作人员在操作过程中严格按照无菌技术的要求进行，从细胞的采集到分离，样本的分袋到封口，试剂的配制到程序降温，最后于液氮中的保存均按规范化操作细则执行。操作过程中重点注意“四防”，①样品分袋时防污染，由于分袋时操作繁琐，因此，应该重点注意避免此环节的污染；②配制冷冻防护液时防产热，在配液时应在0℃～4℃下进行，防止温度过高时二甲基亚砜对细胞产生毒性作用，从而影响保存效果；③封口时注意排尽冷冻袋内空气，防止因袋内空气过多而导致复温时冷冻袋破裂；④复温后回输要快，避免样品在室温过久产热而出现絮状或凝块。
结 果
自1989年9月至1997年12月以来，已为本院67例骨髓移植病人进行造血干细胞低温冻存109人次，其中骨髓的采集、分离、冻存15人次，外周血的采集、分离、冻存85人次，脐带血的收集冻存9人次。有核细胞、单个核细胞及台盼兰拒染回收率分别为103.7%、98.7%和96.2%。用于临床移植或输注的病人，无1例因实验操作处理不当而出现样品污染，复温中无1例发生冷冻袋破裂。
, http://www.100md.com
讨 论
医院感染管理是当前医院管理工作中的一项重大课题，是医院管理的重要组成部分，随着临床造血干细胞移植工作的深入和广泛开展，移植实验技术规范化操作也日趋重要，严格管理措施，开展必要监测，院内组织落实已列入我院工作重点。由于我室注意提高实验人员的业务素质，开展在职人员的岗位培训，建立了一系列相应的规章制度，设立专人专项管理，做到实验用物标准化，技术操作规范化，实验数据科学化，保证了临床移植工作的正常顺利进行，同时使实验室的规范化操作管理得以落实。医院感染管理是当前医院管理工作中的一项重大课题，是医院管理的重要组成部分，随着临床造血干细胞移植工作的深入和广泛开展，移植实验技术规范化操作也日趋重要，严格管理措施，开展必要监测，院内组织落实已列入我院工作重点。由于我室注意提高实验人员的业务素质，开展在职人员的岗位培训，建立了一系列相应的规章制度，设立专人专项管理，做到实验用物标准化，技术操作规范化，实验数据科学化，保证了临床移植工作的正常顺利进行，同时使实验室的规范化操作管理得以落实。
参考文献
[1]杨云海，陈薇，等.紫外线间接照射空气消毒效果研究.中华医院感染学杂志，1997，7：226.
[2]邓晓.对影响紫外线照射强度因素调查分析.第一军医大学学报，1997，17(增刊)：442.
[3]顾春英，薛广波.细菌对消毒剂的研究进展.中华医院感染学杂志，1997，7：252.
(收稿：1998-03-23), http://www.100md.com