锌金属硫蛋白拮抗甲基汞对红细胞膜损伤的作用
作者：徐乐焱 王毅 邱炳源 王振
单位：徐乐焱(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院核医学科，北京 100730)；王毅(白求恩医科大学预防医学院)；邱炳源(白求恩医科大学预防医学院)；王振(秦皇岛市卫生防疫站)
关键词：甲基汞；锌金属硫蛋白；巯基；膜流动性；膜通透性
摘 要摘 要：为了探讨锌金属硫蛋白(ZnMT)拮抗MeHg对细胞膜的损伤作用及其机理，为预防甲基汞(MeHg)中毒提供科学依据，研究了不同剂量的锌诱导产生的ZnMT对MeHg染毒小鼠红细胞膜构象、膜巯基含量、膜流动性和膜通透性等的影响，实验结果表明：不同剂量的Zn可以诱导小鼠肝脏产生ZnMT，随着实验组Zn剂量的增加，肝脏内ZnMT的含量也相应的增加，呈剂量-效应关系(r=0.996)。ZnMT具有保护膜构象及膜巯基、拮抗MeHg对膜流动性及膜通透性的损伤作用。实验结果同时显示了诱导ZnMT的锌的剂量要适当，过高则有毒性作用。
, 百拇医药
分类号：Q591.2 Q251 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0080-03
The protective effects of zinc metallothionein against erythrocyte
membrane damage induced by methylmercury
Xu Leya Wang Yi Qiu Bingyuan Wang Zhen
(Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical
Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100730，China)
, 百拇医药
Abstract：The influences of zinc metallothionein(ZnMT) induced by Zn on mice erythrocyte membrane configuration， membrane sulfhydryl content， membrane fluidity， membrane permeability and so on after methylmercury (MeHg) treatment were studied, the protection of ZnMT against the membrane damage of MeHg was studied. The results showed that Zn could induce the production of ZnMT in the liver of mice. With the increase of Zn content， the level of ZnMT increased and had dose-effect relationship between them(r=0.996). ZnMT could protect membrane configuration and -SH and prevent the damage of MeHg on the membrane fluidity and permeability. The results also showed that the dose of Zn administered to mice should be appropriate. High doses of Zn could cause damages.
, 百拇医药
Key words：methgl mercury，zinc metallothionein，sulfhydryl，membrane fluidity，membrane permeability
金属硫蛋白(metallothionein， MT)是一种可由金属诱导合成、具有丰富巯基的小分子量复合蛋白质。研究表明，锌金属硫蛋白(ZnMT)可拮抗许多重金属的毒作用[1]。至于ZnMT防治有机金属化合物中毒的机制，目前尚不清晰。MeHg是烷基化的有机重金属化合物，是一种剧毒物质，通过食物链进入人体后，几乎对机体的各个系统都可能产生损伤作用[2]。
MeHg对细胞膜损伤作用研究结果证实，生物膜系统受损是MeHg中毒机制的中心环节，其损害性质具有明显的原发意义[3]。为此，通过给与小鼠适量的锌诱导产生ZnMT，研究其拮抗MeHg对红细胞膜流动性、通透性、膜构象等损伤作用，探讨其对细胞膜的保护作用，为预防MeHg中毒提供新的途径和科学依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 由白求恩医科大学实验动物部提供的、体重为20～25g的昆明种雄性小鼠，自由摄食、饮水。
1.1.2 试剂 氯化甲基汞(AR)为西德Merck公司生产；硫酸锌(AR)为北京化学试剂三厂生产；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(AR)为中国科学院生物物理研究所提供；1，6-二苯-1，3，5己三烯(DPH)(AR)为美国Sigma公司生产。
1.1.3 仪器 ABA-100型生化自动分析仪为美国生产；圆二色谱仪J-500C型为日本生产；电感耦合氩等离子体发射光谱仪JARRELL-ABH500系列Mark-2型为美国生产；荧光分光光度计日立F-3000为日本生产。
1.2 方法
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1.2.1 体内ZnMT的诱导 将小鼠连续腹腔注射ZnSO4 4天，每天Zn剂量分别为3.0(实验A组)、5.0(实验B组)、7.0(实验C组)、10.0(实验D组)mg/kg BW，空白对照组(NC)及染毒对照组(PC)同时注射生理盐水。第5天随机取空白对照组和实验组各10只小鼠，眼球采血，颈椎脱臼处死，取肝脏备用。
1.2.2 甲基汞染毒 于实验的第5天，除空白对照组继续给蒸馏水外，其余各组小鼠另用MeHg经口染毒3天，每天剂量为1.925mg/kg BW(相当于1/20LD50)，实验第8天采血样及肝脏备用。以上每次腹腔注射及经口染毒前全部动物都称重并观察生长状态。
1.2.3 测定方法 (1)血清Zn含量的测定：血样经过离心制备血清，采用火焰原子吸收法测定。(2)血样经过离心、溶血，高速离心制取红细胞膜[4]，调制成膜蛋白浓度200μg/ml的悬浮液，进行以下测定：(Ⅰ)巯基含量的测定：采用分光光度法，取制得的细胞膜1mg加入0.02molEDTA2Na到1ml，在37℃下按文献进行相应处理，于550nm处测定OD值[5]。(Ⅱ)细胞膜流动性的测定：采用荧光偏振法按照文献加入DPH，测定并计算偏振度[6]。(Ⅲ)细胞膜通透性的测定[7]：利用生化自动分析仪测定血中LDH活性，根据膜外LDH活性的变化来表示膜的通透性。(Ⅳ)细胞膜构象的测定：采用圆二色谱法，采用Cheng and Yang的方法，按照文献[8]处理、测定，计算α螺旋含量。(Ⅴ)肝脏中ZnMT含量的测定：采用Cd-Hem法，按照文献处理[9]，再用电感耦合氩等离子体发射光谱仪测定Cd浓度，利用Cd的浓度换算成ZnMT的量。
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1.2.4 统计学方法 除ZnMT含量测定利用直线相关分析外，其余为t检验
2 结果
2.1 小鼠体内ZnMT含量测定结果
从表1可以看出，小鼠腹腔注射一定量的锌后，可以在体内诱导产生ZnMT，其含量随着给予锌的剂量的增加而增加，呈剂量-效应关系(r=0.996)，回归方程为Y=0.00508+0.00172X。染毒后小鼠肝ZnMT显著下降。
表1 小鼠体内锌金属硫蛋白(ZnMT)含量测定结果(
±s)
μmol/g
, 百拇医药
组 别
给Zn剂量
(mg/kgBW)
n
染毒前肝ZnMT含量
(μmol/g)
染毒后肝ZnMT含量
(μmol/g)
NC
0
10
-
-
, 百拇医药
实验A组
3
10
0.009 8±0.003 0
0.006 1±0.002 4
实验B组
5
10
0.014 0±0.003 1
0.006 7±0.002 3
实验C组
7
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10
0.017 6±0.003 4
0.007 2±0.002 9
实验D组
10
9(1)
0.021 9±0.007 0
0.007 4±0.003 0
注：r=0.996 (1)死亡一只2.2 诱导ZnMT一天后血清Zn含量
腹腔注射Zn诱导ZnMT后一天，血清中Zn的含量在NC及实验A～D组分别为(32.0±6.8)、(34.1±7.2)、(35.2±7.3)、(33.3±4.4)、(34.5±4.6)μmol/L，各组之间并没有明显的区别，证明Zn离子很快从体内排出，体内起保护作用的主要是ZnMT。
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2.3 ZnMT对MeHg染毒前后细胞膜α螺旋含量的影响
表2中提示低于5mg/kg BW的锌诱导产生的ZnMT能够提高膜蛋白α螺旋含量，改善细胞膜功能，而超过7mg/kg BW即对膜蛋白构象产生不利影响。
表2 锌金属硫蛋白对细胞膜α螺旋
含量的影响 (x±s)
组 别
给Zn剂量
(mg
/kgBW)
n
染毒前α
, 百拇医药
螺旋含量
(%)
染毒后α
螺旋含量
(%)
NC
0
10
32.6±4.2
32.4±3.5
PC
0
10
, 百拇医药
—
24.4±2.9(1)
实验A组
3
10
33.8±4.1
30.1±5.0(2)
实验B组
5
10
34.7±2.7
30.8±4.3(2)
, 百拇医药
实验C组
7
10
30.0±3.3
26.2±3.0(1，3)
实验D组
10
9(4)
24.2±3.8
24.0±3.6(1)
注：(1)与NC比较P<0.01 (2)与PC比较P<0.01
, 百拇医药
(3)与PC比较P<0.05 (4)死亡一只2.4 ZnMT对MeHg染毒后红细胞膜通透性、流动性及巯基的影响
对于红细胞膜来说，膜的通透性越高，渗漏到膜外的LDH越多，相应的血清中LDH的活性就越高，由此可得知膜的通透性的变化。从表3中可以看出3～7mg/kg BW Zn诱导产生的ZnMT可以拮抗MeHg对膜通透性的影响。
由荧光偏振度的大小来表示膜的流动性。DPH的荧光偏振度越大，膜流动性越小，反之亦然。表3中结果提示3～7mg/kg BWZn诱导产生的ZnMT能够拮抗MeHg对膜流动性改变的影响。
表3 锌金属硫蛋白对甲基汞染毒小鼠红细胞膜通透性、流动性及巯基含量的影响 (x±s)
组别
给Zn剂量
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(mg/kgBW)
n
LDH活性
(IU/L)
荧光偏振度
硫基含量
(mg/g)
NC
0
10
1 081.5± 98.0
0.21±0.03
2.44±0.07(3)
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PC
0
10
1 404.0±122.9(1)
0.43±0.05(1)
1.71±0.10
实验A组
3
10
1 100.9±110.3(2)
0.24±0.04(2)
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2.36±0.15(3)
实验B组
5
10
1 100.9±137.8(2)
0.23±0.05(2)
2.41±0.14(3)
实验C组
7
10
1 293.7±139.1(3，4)
, 百拇医药
0.33±0.05(1，3)
2.31±0.23(3)
实验D组
10
9(5)
1 396.6±207.0(1)
0.33±0.05(1，3)
2.36±0.21(3)
注：(1)与NC比较P<0.01 (2)与PC比较P<0.01 (3)与PC比较P<0.05 (4)与NC比较P<0.05 (5)死亡一只 由表3可见正常对照组及各实验组膜SH基含量均比染毒对照组高(P<0.01)，但各实验组及正常对照组之间膜硫基含量无差异，证明ZnMT能够提供并保护膜硫基。
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3 讨论
在利用MT解毒作用时，诱导金属主要为Zn[10]，因为Zn本身是机体所必需的微量元素之一，是许多金属酶的必要组成成分，具有多种重要的生理功能，有着不可替代的作用；同时过量的ZnMT对机体无害[11]。Zn同MT结合的稳定常数是较低的，易被许多其它的有害重金属所置换，这也是其拮抗重金属毒性的一个重要原因。从本实验的结果可以看出Zn确实可以诱导产生ZnMT，产量同给锌的剂量呈正相关关系，这同杨森等人的研究结果一致[12]。从血清学的结果中可见，锌代谢的速度较快，因此对重金属的拮抗作用主要为ZnMT。在体内给予Zn诱导时可发现血浆和红细胞中都存在着ZnMT，在成熟红细胞中缓慢的消失。血液中的ZnMT主要来自肝脏[13]。ZnMT主要吸附在血细胞表面，并和存在于血浆中的少量ZnMT建立起一个动态平衡，形成细胞表面吸附层，对各种异物(重金属、自由基等)的进攻起到保护作用。
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α螺旋度是细胞膜蛋白的序参量，是生命的一种标志，随着细胞膜的损伤和细胞的老化，膜蛋白α螺旋含量降低，直至无序死亡。MeHg在血清和组织内能与血浆蛋白、血红蛋白以及膜蛋白的硫基结合而形成结合型汞，并在代谢中产生了自由基，破坏蛋白质的立体结构，造成功能丧失，在实验结果中可见染毒对照组中膜蛋白α螺旋度下降，证实了这一点。适量的锌诱导产生的ZnMT，可使膜蛋白α螺旋含量有所升高，改善了细胞膜的功能，证明ZnMT具有拮抗MeHg对细胞膜蛋白构象的影响。
细胞膜通透性是与其细胞功能相适应的，通透性改变是毒物作用于细胞膜的早期反应。本实验中MeHg染毒对照组血清中LDH的活性显著增加，证明MeHg增加了膜的通透性。3～7mg/kgBW的锌诱导产生的ZnMT能够拮抗MeHg对细胞膜通透性影响，主要原因是由于MT能够提供硫基而保护膜蛋白的构象[14]以及抑制MeHg产生自由基造成的过氧化作用。
利用荧光偏振技术研究细胞膜的流动性是较常用的有效方法，从实验结果看，MeHg及高锌(10mg/kgBW)具有损伤细胞膜流动性的作用。这主要是由于高锌情况下锌将取代或阻止Ca2+的吸收，使细胞膜结构受损，引起细胞膜流动性降低[15]。3～7mg/kgBW的锌诱导产生的ZnMT具有拮抗MeHg对细胞膜流动性的损伤作用，其原因可能是ZnMT具有丰富的活性巯基，能够保护Na+、K+-ATP酶的活性，维持膜蛋白的构象，拮抗自由基过氧化产物MDA的形成，而使膜的流动性在外来毒物作用下保持正常。
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诱导ZnMT的Zn的量要加以注意：Zn虽是有益金属，但超过一定剂量，反而对机体产生有害作用[16]。在一些实验中，高Zn产生大量的MT，造成了实验动物的死亡[12]。这同本实验的结果较为相似。故而无论补Zn还是诱导ZnMT的Zn剂量都应在一定的范围内。从本实验中可以看到，小鼠Zn的摄入量在3和5mg/kgBW能够产生较好的保护效果；当超过7mg/kgBW时则对细胞膜不但不起保护，反而会产生损伤作用。所以Zn的剂量要根据摄入的方式、频率、动物种类等因素，在安全的剂量范围内选择合适的剂量，才能达到预期的效果。
作者简介：徐乐焱，男，博士研究生
参考文献：
[1]Zalaps RK. Renal MT metabolism after a reduction of renal mass. Toxicology，1992，71(1—2)：83—86
, 百拇医药
[2]山根靖弘(日)编著.环境污染物质与毒性.贺振东，林绍韩译.成都：四川人民出版社，1982，77—80
[3]林秀武，李艳华，牟颖，等.甲基汞对细胞膜损伤作用.中华预防医学杂志，1995，29(1)：9—12
[4]Dodge JT. The Preparation and chemical characteristic of hemoglobin of the ghost of human erythrocytes. Arch Biochem Biophys，1963，100：119—122
[5]周恒铎主编.职业中毒检验.北京：人民出版社，1976，505—507
[6]林克椿.腹水癌细胞膜胆固醇含量对膜流动性的影响.生物化学与生物物理进展，1982，1：31—32
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[7]付平平.人参皂甙对红细胞膜蛋白的作用.白求恩医科大学学报，1994，20(4)：362—364
[8]鲁子贤，崔涛，施庆洛编著.圆二色性和旋光色散在分子生物学中的应用.北京：科学出版社，1987，84—85
[9]Eatow DL， Toal BF. Evaluation of cd/hemoglobioaffinity assay for the rapid determination of MT in biological tissues. Toxicol Appl Pharmacol，1982，66：134—138
[10]潘爱华.锌诱导兔肝脏MT的纯化及鉴定.生物化学与生物物理学报，1992，24(6)：88—90
[11]Dorian C， Klaassen CD. Protection by zinc-metallothionein(ZnMT)against cadmium，metallothionein induced nephrotoxicity. Fundam Appl Toxicol，1995，26(1)：99—103
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[12]杨森.锌对小鼠肝MT合成的影响.营养学报，1995，7：298—301
[13]张保林，王文清，任宏伟，等.MT在金属离子运输中的作用.科学通报，1994，39(3)：227—232
[14]徐乐焱，邱炳源，袁兰.锌金属硫蛋白拮抗甲基汞对细胞膜构象的影响.中国公共卫生学报，1997，16(2)：117—119
[15]Milos CMD. Effect of zinc on cells and biomembranes. Med Clin North Amer，1996，60(4)：156—160
[16]吴嘉惠.锌对大白鼠生长发育及组织核酸蛋白代谢的影响.营养学报，1995，17(4)：363—366
收稿日期：1999-11-08, 百拇医药
单位：徐乐焱(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院核医学科，北京 100730)；王毅(白求恩医科大学预防医学院)；邱炳源(白求恩医科大学预防医学院)；王振(秦皇岛市卫生防疫站)
关键词：甲基汞；锌金属硫蛋白；巯基；膜流动性；膜通透性
摘 要摘 要：为了探讨锌金属硫蛋白(ZnMT)拮抗MeHg对细胞膜的损伤作用及其机理，为预防甲基汞(MeHg)中毒提供科学依据，研究了不同剂量的锌诱导产生的ZnMT对MeHg染毒小鼠红细胞膜构象、膜巯基含量、膜流动性和膜通透性等的影响，实验结果表明：不同剂量的Zn可以诱导小鼠肝脏产生ZnMT，随着实验组Zn剂量的增加，肝脏内ZnMT的含量也相应的增加，呈剂量-效应关系(r=0.996)。ZnMT具有保护膜构象及膜巯基、拮抗MeHg对膜流动性及膜通透性的损伤作用。实验结果同时显示了诱导ZnMT的锌的剂量要适当，过高则有毒性作用。
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分类号：Q591.2 Q251 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0080-03
The protective effects of zinc metallothionein against erythrocyte
membrane damage induced by methylmercury
Xu Leya Wang Yi Qiu Bingyuan Wang Zhen
(Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical
Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100730，China)
, 百拇医药
Abstract：The influences of zinc metallothionein(ZnMT) induced by Zn on mice erythrocyte membrane configuration， membrane sulfhydryl content， membrane fluidity， membrane permeability and so on after methylmercury (MeHg) treatment were studied, the protection of ZnMT against the membrane damage of MeHg was studied. The results showed that Zn could induce the production of ZnMT in the liver of mice. With the increase of Zn content， the level of ZnMT increased and had dose-effect relationship between them(r=0.996). ZnMT could protect membrane configuration and -SH and prevent the damage of MeHg on the membrane fluidity and permeability. The results also showed that the dose of Zn administered to mice should be appropriate. High doses of Zn could cause damages.
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Key words：methgl mercury，zinc metallothionein，sulfhydryl，membrane fluidity，membrane permeability
金属硫蛋白(metallothionein， MT)是一种可由金属诱导合成、具有丰富巯基的小分子量复合蛋白质。研究表明，锌金属硫蛋白(ZnMT)可拮抗许多重金属的毒作用[1]。至于ZnMT防治有机金属化合物中毒的机制，目前尚不清晰。MeHg是烷基化的有机重金属化合物，是一种剧毒物质，通过食物链进入人体后，几乎对机体的各个系统都可能产生损伤作用[2]。
MeHg对细胞膜损伤作用研究结果证实，生物膜系统受损是MeHg中毒机制的中心环节，其损害性质具有明显的原发意义[3]。为此，通过给与小鼠适量的锌诱导产生ZnMT，研究其拮抗MeHg对红细胞膜流动性、通透性、膜构象等损伤作用，探讨其对细胞膜的保护作用，为预防MeHg中毒提供新的途径和科学依据。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 由白求恩医科大学实验动物部提供的、体重为20～25g的昆明种雄性小鼠，自由摄食、饮水。
1.1.2 试剂 氯化甲基汞(AR)为西德Merck公司生产；硫酸锌(AR)为北京化学试剂三厂生产；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(AR)为中国科学院生物物理研究所提供；1，6-二苯-1，3，5己三烯(DPH)(AR)为美国Sigma公司生产。
1.1.3 仪器 ABA-100型生化自动分析仪为美国生产；圆二色谱仪J-500C型为日本生产；电感耦合氩等离子体发射光谱仪JARRELL-ABH500系列Mark-2型为美国生产；荧光分光光度计日立F-3000为日本生产。
1.2 方法
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1.2.1 体内ZnMT的诱导 将小鼠连续腹腔注射ZnSO4 4天，每天Zn剂量分别为3.0(实验A组)、5.0(实验B组)、7.0(实验C组)、10.0(实验D组)mg/kg BW，空白对照组(NC)及染毒对照组(PC)同时注射生理盐水。第5天随机取空白对照组和实验组各10只小鼠，眼球采血，颈椎脱臼处死，取肝脏备用。
1.2.2 甲基汞染毒 于实验的第5天，除空白对照组继续给蒸馏水外，其余各组小鼠另用MeHg经口染毒3天，每天剂量为1.925mg/kg BW(相当于1/20LD50)，实验第8天采血样及肝脏备用。以上每次腹腔注射及经口染毒前全部动物都称重并观察生长状态。
1.2.3 测定方法 (1)血清Zn含量的测定：血样经过离心制备血清，采用火焰原子吸收法测定。(2)血样经过离心、溶血，高速离心制取红细胞膜[4]，调制成膜蛋白浓度200μg/ml的悬浮液，进行以下测定：(Ⅰ)巯基含量的测定：采用分光光度法，取制得的细胞膜1mg加入0.02molEDTA2Na到1ml，在37℃下按文献进行相应处理，于550nm处测定OD值[5]。(Ⅱ)细胞膜流动性的测定：采用荧光偏振法按照文献加入DPH，测定并计算偏振度[6]。(Ⅲ)细胞膜通透性的测定[7]：利用生化自动分析仪测定血中LDH活性，根据膜外LDH活性的变化来表示膜的通透性。(Ⅳ)细胞膜构象的测定：采用圆二色谱法，采用Cheng and Yang的方法，按照文献[8]处理、测定，计算α螺旋含量。(Ⅴ)肝脏中ZnMT含量的测定：采用Cd-Hem法，按照文献处理[9]，再用电感耦合氩等离子体发射光谱仪测定Cd浓度，利用Cd的浓度换算成ZnMT的量。
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1.2.4 统计学方法 除ZnMT含量测定利用直线相关分析外，其余为t检验
2 结果
2.1 小鼠体内ZnMT含量测定结果
从表1可以看出，小鼠腹腔注射一定量的锌后，可以在体内诱导产生ZnMT，其含量随着给予锌的剂量的增加而增加，呈剂量-效应关系(r=0.996)，回归方程为Y=0.00508+0.00172X。染毒后小鼠肝ZnMT显著下降。
表1 小鼠体内锌金属硫蛋白(ZnMT)含量测定结果(
±s)μmol/g
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组 别
给Zn剂量
(mg/kgBW)
n
染毒前肝ZnMT含量
(μmol/g)
染毒后肝ZnMT含量
(μmol/g)
NC
0
10
-
-
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实验A组
3
10
0.009 8±0.003 0
0.006 1±0.002 4
实验B组
5
10
0.014 0±0.003 1
0.006 7±0.002 3
实验C组
7
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10
0.017 6±0.003 4
0.007 2±0.002 9
实验D组
10
9(1)
0.021 9±0.007 0
0.007 4±0.003 0
注：r=0.996 (1)死亡一只2.2 诱导ZnMT一天后血清Zn含量
腹腔注射Zn诱导ZnMT后一天，血清中Zn的含量在NC及实验A～D组分别为(32.0±6.8)、(34.1±7.2)、(35.2±7.3)、(33.3±4.4)、(34.5±4.6)μmol/L，各组之间并没有明显的区别，证明Zn离子很快从体内排出，体内起保护作用的主要是ZnMT。
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2.3 ZnMT对MeHg染毒前后细胞膜α螺旋含量的影响
表2中提示低于5mg/kg BW的锌诱导产生的ZnMT能够提高膜蛋白α螺旋含量，改善细胞膜功能，而超过7mg/kg BW即对膜蛋白构象产生不利影响。
表2 锌金属硫蛋白对细胞膜α螺旋
含量的影响 (x±s)
组 别
给Zn剂量
(mg
/kgBW)
n
染毒前α
, 百拇医药
螺旋含量
(%)
染毒后α
螺旋含量
(%)
NC
0
10
32.6±4.2
32.4±3.5
PC
0
10
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—
24.4±2.9(1)
实验A组
3
10
33.8±4.1
30.1±5.0(2)
实验B组
5
10
34.7±2.7
30.8±4.3(2)
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实验C组
7
10
30.0±3.3
26.2±3.0(1，3)
实验D组
10
9(4)
24.2±3.8
24.0±3.6(1)
注：(1)与NC比较P<0.01 (2)与PC比较P<0.01
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(3)与PC比较P<0.05 (4)死亡一只2.4 ZnMT对MeHg染毒后红细胞膜通透性、流动性及巯基的影响
对于红细胞膜来说，膜的通透性越高，渗漏到膜外的LDH越多，相应的血清中LDH的活性就越高，由此可得知膜的通透性的变化。从表3中可以看出3～7mg/kg BW Zn诱导产生的ZnMT可以拮抗MeHg对膜通透性的影响。
由荧光偏振度的大小来表示膜的流动性。DPH的荧光偏振度越大，膜流动性越小，反之亦然。表3中结果提示3～7mg/kg BWZn诱导产生的ZnMT能够拮抗MeHg对膜流动性改变的影响。
表3 锌金属硫蛋白对甲基汞染毒小鼠红细胞膜通透性、流动性及巯基含量的影响 (x±s)
组别
给Zn剂量
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(mg/kgBW)
n
LDH活性
(IU/L)
荧光偏振度
硫基含量
(mg/g)
NC
0
10
1 081.5± 98.0
0.21±0.03
2.44±0.07(3)
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PC
0
10
1 404.0±122.9(1)
0.43±0.05(1)
1.71±0.10
实验A组
3
10
1 100.9±110.3(2)
0.24±0.04(2)
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2.36±0.15(3)
实验B组
5
10
1 100.9±137.8(2)
0.23±0.05(2)
2.41±0.14(3)
实验C组
7
10
1 293.7±139.1(3，4)
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0.33±0.05(1，3)
2.31±0.23(3)
实验D组
10
9(5)
1 396.6±207.0(1)
0.33±0.05(1，3)
2.36±0.21(3)
注：(1)与NC比较P<0.01 (2)与PC比较P<0.01 (3)与PC比较P<0.05 (4)与NC比较P<0.05 (5)死亡一只 由表3可见正常对照组及各实验组膜SH基含量均比染毒对照组高(P<0.01)，但各实验组及正常对照组之间膜硫基含量无差异，证明ZnMT能够提供并保护膜硫基。
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3 讨论
在利用MT解毒作用时，诱导金属主要为Zn[10]，因为Zn本身是机体所必需的微量元素之一，是许多金属酶的必要组成成分，具有多种重要的生理功能，有着不可替代的作用；同时过量的ZnMT对机体无害[11]。Zn同MT结合的稳定常数是较低的，易被许多其它的有害重金属所置换，这也是其拮抗重金属毒性的一个重要原因。从本实验的结果可以看出Zn确实可以诱导产生ZnMT，产量同给锌的剂量呈正相关关系，这同杨森等人的研究结果一致[12]。从血清学的结果中可见，锌代谢的速度较快，因此对重金属的拮抗作用主要为ZnMT。在体内给予Zn诱导时可发现血浆和红细胞中都存在着ZnMT，在成熟红细胞中缓慢的消失。血液中的ZnMT主要来自肝脏[13]。ZnMT主要吸附在血细胞表面，并和存在于血浆中的少量ZnMT建立起一个动态平衡，形成细胞表面吸附层，对各种异物(重金属、自由基等)的进攻起到保护作用。
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α螺旋度是细胞膜蛋白的序参量，是生命的一种标志，随着细胞膜的损伤和细胞的老化，膜蛋白α螺旋含量降低，直至无序死亡。MeHg在血清和组织内能与血浆蛋白、血红蛋白以及膜蛋白的硫基结合而形成结合型汞，并在代谢中产生了自由基，破坏蛋白质的立体结构，造成功能丧失，在实验结果中可见染毒对照组中膜蛋白α螺旋度下降，证实了这一点。适量的锌诱导产生的ZnMT，可使膜蛋白α螺旋含量有所升高，改善了细胞膜的功能，证明ZnMT具有拮抗MeHg对细胞膜蛋白构象的影响。
细胞膜通透性是与其细胞功能相适应的，通透性改变是毒物作用于细胞膜的早期反应。本实验中MeHg染毒对照组血清中LDH的活性显著增加，证明MeHg增加了膜的通透性。3～7mg/kgBW的锌诱导产生的ZnMT能够拮抗MeHg对细胞膜通透性影响，主要原因是由于MT能够提供硫基而保护膜蛋白的构象[14]以及抑制MeHg产生自由基造成的过氧化作用。
利用荧光偏振技术研究细胞膜的流动性是较常用的有效方法，从实验结果看，MeHg及高锌(10mg/kgBW)具有损伤细胞膜流动性的作用。这主要是由于高锌情况下锌将取代或阻止Ca2+的吸收，使细胞膜结构受损，引起细胞膜流动性降低[15]。3～7mg/kgBW的锌诱导产生的ZnMT具有拮抗MeHg对细胞膜流动性的损伤作用，其原因可能是ZnMT具有丰富的活性巯基，能够保护Na+、K+-ATP酶的活性，维持膜蛋白的构象，拮抗自由基过氧化产物MDA的形成，而使膜的流动性在外来毒物作用下保持正常。
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诱导ZnMT的Zn的量要加以注意：Zn虽是有益金属，但超过一定剂量，反而对机体产生有害作用[16]。在一些实验中，高Zn产生大量的MT，造成了实验动物的死亡[12]。这同本实验的结果较为相似。故而无论补Zn还是诱导ZnMT的Zn剂量都应在一定的范围内。从本实验中可以看到，小鼠Zn的摄入量在3和5mg/kgBW能够产生较好的保护效果；当超过7mg/kgBW时则对细胞膜不但不起保护，反而会产生损伤作用。所以Zn的剂量要根据摄入的方式、频率、动物种类等因素，在安全的剂量范围内选择合适的剂量，才能达到预期的效果。
作者简介：徐乐焱，男，博士研究生
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收稿日期：1999-11-08, 百拇医药