金属硫蛋白在镉致睾丸氧化损伤中的保护作用
作者：徐莉春 王沭沂 赵人琤 杨小芳 俞萍 王心如
单位：徐莉春(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；王沭沂(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；赵人琤(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；杨小芳(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；俞萍(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；王心如(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)
关键词：镉；金属硫蛋白；脂质过氧化
摘 要摘 要：应用不同剂量的氯化镉(0.2、0.4和0.8mg/kg BW)对成年雄性SD大鼠进行腹腔染毒，连续染毒7天后将动物处死，分离睾丸，测定其中金属硫蛋白(MT)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。结果显示，低剂量组MT含量虽有所升高，但与对照组比较差异无显著性，中剂量组MT含量显著升高，高剂量组MT含量反而显著降低。睾丸SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性和MDA含量在低、中剂量组变化不明显，而在高剂量组，SOD和GSH-Px的活性显著降低，MDA含量显著升高。结果揭示，MT对镉所致的睾丸氧化损伤起重要的保护作用，镉的雄性生殖毒性可能与MT及其他抗氧化物质的抗氧化失衡有关
, 百拇医药
分类号：Q355 Q344 O614.242 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0078-02
Protection of metallothionein on the peroxidative
injury in testis induced by cadmium
Xu Lichun Wang Shuyi Zhao Renzheng Yang Xiaofang，et al.
(Key Laboratory for Applied Toxicology of Jiangsu Province，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)
, 百拇医药
Abstract：In order to study the protection effect of metallothionein (MT) on peroxidative injury in testis induced by cadmium and to detect the mechanism of reproduction toxicity of cadmium， the SD rats were injected intraperitoneally with different doses of cadmium (0.2，0.4 and 0.8mg/kgBW) for 7 days. The content of MT， the activities of antioxidases and the content of malondialdehyde(MDA) in testis were detected. The results showed that the increase of MT content in the low dose group was not obvious. MT content increased significantly in the 0.4mg/kgBW group， while decreased in the 0.8mg/kgBW group. There was a significant reduction of the activities of superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the high dose group. The content of MDA did not change obviously in the low and middle dose groups， but increased significantly in the high dose group. It was concluded that MT might play an important role in protecting testis from oxidative damage. The toxicity of cadmium on male reproduction might be related to the unbalance of anti-oxidation system including MT.
, http://www.100md.com
Key words：cadmium，metallothionein，lipid peroxidation
镉是一种人体非必需微量元素，它对机体的毒性作用表现在多个方面，毒作用机制非常复杂。金属硫蛋白(MT)是影响镉毒性作用的重要因素[1]。雄性生殖系统是镉作用的重要部位，睾丸、附睾、前列腺等器官中普遍有MT的存在。因此镉对各生殖器官的毒作用机制可能与MT存在一定的关系。尤其是镉可以诱导MT的产生，MT富含巯基的特殊结构，使其抗氧化损伤的作用成为近年来研究的一个热点。因此本次研究观察了镉染毒后大鼠睾丸中MT含量、抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的变化情况，对MT在抗睾丸氧化损伤中的作用作了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体重250～300g，购于上海动物研究中心。
, 百拇医药
1.2 主要仪器
DU650分光光度计(美国Beckman公司生产)，AA-6501F原子吸收分光光度仪(日本岛津公司生产)。
1.3 动物处理
将24只大鼠随机分为对照组和3个染毒组。低、中和高剂量染毒组分别腹腔注射用生理盐水配制的CdCl2.2.5H2O溶液(按镉计0.2、0.4、0.8mg/kg BW)，对照组注射等量的生理盐水。每天注射1次，7天后将动物处死。分离大鼠睾丸，剥离被膜，将睾丸实质称重，剪碎。按1∶4(g∶ml)的比例向睾丸中加生理盐水，4℃下制成匀浆。并于4℃，10 000g高速离心30min。将上清液保存于4℃冰箱中待测。
1.4 测定指标
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1.4.1 样品上清液中蛋白质含量 采用考马斯亮兰比色法测定。
1.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性 采用南京建成生物工程研究所提供的SOD试剂盒和GSH-Px试剂盒测定。
1.4.3 MDA含量 采用南京建成生物工程研究所提供的MDA试剂盒测定。
1.4.4 MT含量 参考杨森等的方法[2]，取大鼠睾丸，剥离被膜，将睾丸实质称重，剪碎。按1∶4(g∶ml)的比例向睾丸中加入Tris-HCl(pH8.7)缓冲液，4℃下制成匀浆。并于4℃，15 000g高速离心1.5h。取上清0.2ml，加入10μg/ml的镉溶液1.0ml及Tris-HCl(pH8.7)缓冲液2.2ml。室温放置10min后加入0.2ml溶血素(由大鼠血液提取)。80℃水浴5min，5 000r/min离心10min。吸出全部上清。重复加溶血素以后的步骤2次。应用火焰原子吸收分光光度法测定上清中与MT结合的镉含量。由于MT上的金属键在体外与加入到匀浆中的镉全部键合，鼠红细胞溶血素与镉有很强的亲合力，加入后可与过量的镉结合，从而将MT外的其他所有生物配位体中的镉去除。通过测定与MT结合的镉，将样品中的镉含量换算成MT的含量。
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1.5 统计学处理
所有数据均以
±s表示，采用实验组与对照组均数比较的q′检验比较组间的差异。
2 结果
2.1 大鼠睾丸中抗氧化酶活性及过氧化水平
镉染毒后大鼠睾丸中抗氧化酶活性及过氧化水平的变化见附表：SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性在低、中剂量组的变化与对照组比较没有出现显著性差异，在高剂量组则显著降低。低中剂量组的MDA含量与对照组比较差异没有显著性，而高剂量组含量显著升高。
2.2 大鼠睾丸中MT含量
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镉染毒后对大鼠睾丸MT含量的影响见附表：低剂量组，睾丸中MT含量有所升高，但与对照组比较没有出现显著性差异。中剂量组MT含量显著高于对照组(P<0.01)，随着染毒剂量的进一步加大，高剂量组MT含量反而显著降低(P<0.01)。
附表 镉染毒后睾丸中MT、抗氧化酶活性及过氧化
水平的变化(±s，n=6)
组别
SOD
(NU/mg)
GSH-Px
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(U/mg)
MDA
(nmol/mg)
MT
对照组
313.2±32.1
11.5±0.6
1.1±0.3
75.8±14.1
低剂量组
290.0±52.1
11.1±0.2
, 百拇医药
1.2±0.1
91.0±12.9
中剂量组
291.4±37.8
11.0±1.2
1.2±0.4
145.4±11.0(1)
高剂量组
46.9± 9.8(1)
4.9±1.4(2)
18.3±2.7(3)
, 百拇医药
31.7± 8.2(1)
注：与对照组比较，(1)q′=12.7，P<0.01 (2) q′=11.7，P<0.01 (3)q′=17.2，P<0.013 讨论
MT是一种低分子量的金属结合蛋白，含有大量的半胱氨酸。MT富含巯基的特殊结构，使其抗氧化损伤的作用成为近年来研究的一个热点。研究表明，MT缺乏的细胞对氧化损伤的敏感性升高[3]。资料显示，H2O2与DNA上的Fe2+作用后，产生·OH，可引起DNA链的交联。存在于细胞核内的MT是一种良好的·OH自由基清除剂，其清除能力是谷胱甘肽(GSH)的800倍，对DNA的过氧化损伤起着很重要的保护作用[4]。Tohyama等的研究发现[5]，MT蛋白广泛分布于各级生精细胞、精子和支持细胞中。由于睾丸中MT的存在，一定量的镉又能诱导MT的生物合成，因此镉的雄性生殖毒性机制与MT存在有必然的联系。
, 百拇医药
本次研究的结果表明，MT存在于大鼠睾丸组织中，不同剂量的镉对睾丸中MT的影响也不相同。中、小剂量的镉可能诱导睾丸中MT的产生，而大剂量的镉不但不表现出这种诱导作用，反而使睾丸中MT含量显著降低。由于MT的抗氧化作用，睾丸的过氧化损伤与MT的变化情况存在一定关系。低、中剂量组，睾丸中MT含量均有升高。由于MT对氧化损伤起保护作用，因此抑制了脂质过氧化作用的发生，此时睾丸中脂质过氧化的产物MDA含量没有出现明显改变。随着镉染毒剂量的加大，高剂量组MT含量显著降低，影响了睾丸抗氧化损伤的能力，使各组织细胞过氧化作用增强，MDA水平显著升高。睾丸中SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活性在低、中剂量组降低不明显，在高剂量组显著降低。它们可能与MT以协同作用的方式共同发挥抗氧化功能。但由于一定剂量的镉染毒后较易诱导MT的产生，因此MT在抗氧化损伤中可能起主要作用。
当然，睾丸中MT和其他抗氧化物质的保护作用是有一定限度的，随着镉染毒剂量的加大，必然引起睾丸抗氧化能力的耗竭，从而使镉的氧化损伤作用得以表达。有研究资料认为抗氧化能力的减弱、氧自由基及脂质过氧化物的产生等因素可引起不同程度的细胞毒性，并导致瞬时的不可逆的损伤[6]。因此大剂量的镉所致的睾丸损伤可能与MT含量降低所致的脂质过氧化作用有关。
, 百拇医药
当然，MT抗氧化损伤的机制比较复杂。镉染毒后睾丸中的MT一方面可能直接发挥抗氧化作用，另一方面可能通过减轻镉对抗氧化酶的抑制，间接地对镉所致的氧化损伤起保护作用。MT抗氧化损伤的确切机制有待于进一步探讨。
基金项目：国家自然科学基金(No.39640006)
作者简介：徐莉春，女，讲师，徐州医学院定向硕士研究生
本课题负责人、联系人：王心如
参考文献：
[1]Waalkes MP， Goering PL. Metallothionein and other cadmium-binding proteins:resent developments. Chem Res Toxicol，1990，3:281—288
, 百拇医药
[2]杨森，戴建国，陈景衡.钙和镉对金属硫蛋白在小鼠肝合成中的影响.卫生毒理学杂志，1996，10(1)：4—5
[3]Zheng H， Liu J， Liu Y， et al. Hepatocytes from metallothionein- I and II knockout mice are sensitive to cadmium-and ter-butylhydroperoxide-induced cytotoxicity. Toxicol Lett，1996，87(2—3):139—145
[4]Chubatsu LS， Meneghini R. Metallothionein protects DNA from oxidative damage. Biochem J， 1993，291：193—198
[5]Tohyama C， Nishimura N， Suzuki JS, et al. Metallothionein mRNA in the testis and prostate of the rat detected by digoxigenin-labeled riboprobe. Histochem，1994，101(5)：341—346
[6]Saltman P. Oxidative stress:a radical view. Seminars Hematol，1989，26:249—256
收稿日期：1999-07-14, http://www.100md.com
单位：徐莉春(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；王沭沂(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；赵人琤(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；杨小芳(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；俞萍(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)；王心如(南京医科大学应用毒理重点实验室，南京 210029)
关键词：镉；金属硫蛋白；脂质过氧化
摘 要摘 要：应用不同剂量的氯化镉(0.2、0.4和0.8mg/kg BW)对成年雄性SD大鼠进行腹腔染毒，连续染毒7天后将动物处死，分离睾丸，测定其中金属硫蛋白(MT)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。结果显示，低剂量组MT含量虽有所升高，但与对照组比较差异无显著性，中剂量组MT含量显著升高，高剂量组MT含量反而显著降低。睾丸SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性和MDA含量在低、中剂量组变化不明显，而在高剂量组，SOD和GSH-Px的活性显著降低，MDA含量显著升高。结果揭示，MT对镉所致的睾丸氧化损伤起重要的保护作用，镉的雄性生殖毒性可能与MT及其他抗氧化物质的抗氧化失衡有关
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分类号：Q355 Q344 O614.242 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0078-02
Protection of metallothionein on the peroxidative
injury in testis induced by cadmium
Xu Lichun Wang Shuyi Zhao Renzheng Yang Xiaofang，et al.
(Key Laboratory for Applied Toxicology of Jiangsu Province，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)
, 百拇医药
Abstract：In order to study the protection effect of metallothionein (MT) on peroxidative injury in testis induced by cadmium and to detect the mechanism of reproduction toxicity of cadmium， the SD rats were injected intraperitoneally with different doses of cadmium (0.2，0.4 and 0.8mg/kgBW) for 7 days. The content of MT， the activities of antioxidases and the content of malondialdehyde(MDA) in testis were detected. The results showed that the increase of MT content in the low dose group was not obvious. MT content increased significantly in the 0.4mg/kgBW group， while decreased in the 0.8mg/kgBW group. There was a significant reduction of the activities of superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the high dose group. The content of MDA did not change obviously in the low and middle dose groups， but increased significantly in the high dose group. It was concluded that MT might play an important role in protecting testis from oxidative damage. The toxicity of cadmium on male reproduction might be related to the unbalance of anti-oxidation system including MT.
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Key words：cadmium，metallothionein，lipid peroxidation
镉是一种人体非必需微量元素，它对机体的毒性作用表现在多个方面，毒作用机制非常复杂。金属硫蛋白(MT)是影响镉毒性作用的重要因素[1]。雄性生殖系统是镉作用的重要部位，睾丸、附睾、前列腺等器官中普遍有MT的存在。因此镉对各生殖器官的毒作用机制可能与MT存在一定的关系。尤其是镉可以诱导MT的产生，MT富含巯基的特殊结构，使其抗氧化损伤的作用成为近年来研究的一个热点。因此本次研究观察了镉染毒后大鼠睾丸中MT含量、抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的变化情况，对MT在抗睾丸氧化损伤中的作用作了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体重250～300g，购于上海动物研究中心。
, 百拇医药
1.2 主要仪器
DU650分光光度计(美国Beckman公司生产)，AA-6501F原子吸收分光光度仪(日本岛津公司生产)。
1.3 动物处理
将24只大鼠随机分为对照组和3个染毒组。低、中和高剂量染毒组分别腹腔注射用生理盐水配制的CdCl2.2.5H2O溶液(按镉计0.2、0.4、0.8mg/kg BW)，对照组注射等量的生理盐水。每天注射1次，7天后将动物处死。分离大鼠睾丸，剥离被膜，将睾丸实质称重，剪碎。按1∶4(g∶ml)的比例向睾丸中加生理盐水，4℃下制成匀浆。并于4℃，10 000g高速离心30min。将上清液保存于4℃冰箱中待测。
1.4 测定指标
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1.4.1 样品上清液中蛋白质含量 采用考马斯亮兰比色法测定。
1.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性 采用南京建成生物工程研究所提供的SOD试剂盒和GSH-Px试剂盒测定。
1.4.3 MDA含量 采用南京建成生物工程研究所提供的MDA试剂盒测定。
1.4.4 MT含量 参考杨森等的方法[2]，取大鼠睾丸，剥离被膜，将睾丸实质称重，剪碎。按1∶4(g∶ml)的比例向睾丸中加入Tris-HCl(pH8.7)缓冲液，4℃下制成匀浆。并于4℃，15 000g高速离心1.5h。取上清0.2ml，加入10μg/ml的镉溶液1.0ml及Tris-HCl(pH8.7)缓冲液2.2ml。室温放置10min后加入0.2ml溶血素(由大鼠血液提取)。80℃水浴5min，5 000r/min离心10min。吸出全部上清。重复加溶血素以后的步骤2次。应用火焰原子吸收分光光度法测定上清中与MT结合的镉含量。由于MT上的金属键在体外与加入到匀浆中的镉全部键合，鼠红细胞溶血素与镉有很强的亲合力，加入后可与过量的镉结合，从而将MT外的其他所有生物配位体中的镉去除。通过测定与MT结合的镉，将样品中的镉含量换算成MT的含量。
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1.5 统计学处理
所有数据均以
±s表示，采用实验组与对照组均数比较的q′检验比较组间的差异。2 结果
2.1 大鼠睾丸中抗氧化酶活性及过氧化水平
镉染毒后大鼠睾丸中抗氧化酶活性及过氧化水平的变化见附表：SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性在低、中剂量组的变化与对照组比较没有出现显著性差异，在高剂量组则显著降低。低中剂量组的MDA含量与对照组比较差异没有显著性，而高剂量组含量显著升高。
2.2 大鼠睾丸中MT含量
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镉染毒后对大鼠睾丸MT含量的影响见附表：低剂量组，睾丸中MT含量有所升高，但与对照组比较没有出现显著性差异。中剂量组MT含量显著高于对照组(P<0.01)，随着染毒剂量的进一步加大，高剂量组MT含量反而显著降低(P<0.01)。
附表 镉染毒后睾丸中MT、抗氧化酶活性及过氧化
水平的变化(
±s，n=6)组别
SOD
(NU/mg)
GSH-Px
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(U/mg)
MDA
(nmol/mg)
MT
对照组
313.2±32.1
11.5±0.6
1.1±0.3
75.8±14.1
低剂量组
290.0±52.1
11.1±0.2
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1.2±0.1
91.0±12.9
中剂量组
291.4±37.8
11.0±1.2
1.2±0.4
145.4±11.0(1)
高剂量组
46.9± 9.8(1)
4.9±1.4(2)
18.3±2.7(3)
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31.7± 8.2(1)
注：与对照组比较，(1)q′=12.7，P<0.01 (2) q′=11.7，P<0.01 (3)q′=17.2，P<0.013 讨论
MT是一种低分子量的金属结合蛋白，含有大量的半胱氨酸。MT富含巯基的特殊结构，使其抗氧化损伤的作用成为近年来研究的一个热点。研究表明，MT缺乏的细胞对氧化损伤的敏感性升高[3]。资料显示，H2O2与DNA上的Fe2+作用后，产生·OH，可引起DNA链的交联。存在于细胞核内的MT是一种良好的·OH自由基清除剂，其清除能力是谷胱甘肽(GSH)的800倍，对DNA的过氧化损伤起着很重要的保护作用[4]。Tohyama等的研究发现[5]，MT蛋白广泛分布于各级生精细胞、精子和支持细胞中。由于睾丸中MT的存在，一定量的镉又能诱导MT的生物合成，因此镉的雄性生殖毒性机制与MT存在有必然的联系。
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本次研究的结果表明，MT存在于大鼠睾丸组织中，不同剂量的镉对睾丸中MT的影响也不相同。中、小剂量的镉可能诱导睾丸中MT的产生，而大剂量的镉不但不表现出这种诱导作用，反而使睾丸中MT含量显著降低。由于MT的抗氧化作用，睾丸的过氧化损伤与MT的变化情况存在一定关系。低、中剂量组，睾丸中MT含量均有升高。由于MT对氧化损伤起保护作用，因此抑制了脂质过氧化作用的发生，此时睾丸中脂质过氧化的产物MDA含量没有出现明显改变。随着镉染毒剂量的加大，高剂量组MT含量显著降低，影响了睾丸抗氧化损伤的能力，使各组织细胞过氧化作用增强，MDA水平显著升高。睾丸中SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活性在低、中剂量组降低不明显，在高剂量组显著降低。它们可能与MT以协同作用的方式共同发挥抗氧化功能。但由于一定剂量的镉染毒后较易诱导MT的产生，因此MT在抗氧化损伤中可能起主要作用。
当然，睾丸中MT和其他抗氧化物质的保护作用是有一定限度的，随着镉染毒剂量的加大，必然引起睾丸抗氧化能力的耗竭，从而使镉的氧化损伤作用得以表达。有研究资料认为抗氧化能力的减弱、氧自由基及脂质过氧化物的产生等因素可引起不同程度的细胞毒性，并导致瞬时的不可逆的损伤[6]。因此大剂量的镉所致的睾丸损伤可能与MT含量降低所致的脂质过氧化作用有关。
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当然，MT抗氧化损伤的机制比较复杂。镉染毒后睾丸中的MT一方面可能直接发挥抗氧化作用，另一方面可能通过减轻镉对抗氧化酶的抑制，间接地对镉所致的氧化损伤起保护作用。MT抗氧化损伤的确切机制有待于进一步探讨。
基金项目：国家自然科学基金(No.39640006)
作者简介：徐莉春，女，讲师，徐州医学院定向硕士研究生
本课题负责人、联系人：王心如
参考文献：
[1]Waalkes MP， Goering PL. Metallothionein and other cadmium-binding proteins:resent developments. Chem Res Toxicol，1990，3:281—288
, 百拇医药
[2]杨森，戴建国，陈景衡.钙和镉对金属硫蛋白在小鼠肝合成中的影响.卫生毒理学杂志，1996，10(1)：4—5
[3]Zheng H， Liu J， Liu Y， et al. Hepatocytes from metallothionein- I and II knockout mice are sensitive to cadmium-and ter-butylhydroperoxide-induced cytotoxicity. Toxicol Lett，1996，87(2—3):139—145
[4]Chubatsu LS， Meneghini R. Metallothionein protects DNA from oxidative damage. Biochem J， 1993，291：193—198
[5]Tohyama C， Nishimura N， Suzuki JS, et al. Metallothionein mRNA in the testis and prostate of the rat detected by digoxigenin-labeled riboprobe. Histochem，1994，101(5)：341—346
[6]Saltman P. Oxidative stress:a radical view. Seminars Hematol，1989，26:249—256
收稿日期：1999-07-14, http://www.100md.com