吸入对苯二甲酸粉尘大鼠肺表面活性物质的改变
作者：施爱民 王顶贤 王心如 徐锡坤 徐峰 龚楠 何冬宁 姚宏伟
单位：施爱民(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；王顶贤(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；徐峰(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；姚宏伟(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；王心如(南京医科大学公共卫生学院)；徐锡坤(南京医科大学公共卫生学院)；龚楠(南京医科大学公共卫生学院)；何冬宁(南京医科大学公共卫生学院)
关键词：对苯二甲酸；肺表面活性物质；高效液相色谱
卫生研究000203 摘 要：用高效液相色谱法检测了动式吸入对苯二甲酸粉尘后大鼠支气管肺泡灌洗液中肺表面活性物质磷脂的含量，各实验组染尘几何平均浓度分别为8.93、274.45和618.12mg/m3。结果显示中、高剂量实验组磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇均较对照组减少(P<0.001)，提示吸入对苯二甲酸粉尘可影响肺泡Ⅱ型上皮细胞肺表面活性物质的合成与分泌功能。
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分类号：R135.2 R134.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0071-02
Changes of pulmonary surfactant in the rat lung
exposed to terephthalic acid
Shi Aimin Wang Dingxian Wang Xinru Xu Xikun，et al.
(Prevention & Health Center of Yizheng Chemical Fibre Group Corporetion，Yizheng 211900，China)
Abstract：The contents of phospholipids in the lung surfactant in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of rats inhaled terephthalic acid (TPA) dust were analysed with high pressure liquid chromatography (HPLC).The average geometric concentrations of TPA dust in experimental groups were 8.93，274.45 and 618.12mg/m3 respectively.The results showed that phosphatidylcholine(PC)，phosphatidyl glycerol(PG)，and phosphatidylinositol(PI) of the rats exposed to TPA at the middle and high concentrations were decreased as compared with those in the control (P<0.001).It was suggested that the functions of producing and secreting pulmonary surfactant in type Ⅱ epithelial cells were damaged after inhalating TPA dust.
, 百拇医药
Key words： terephthalic acid，pulmonary surfactant，high pressure liquid chromatography
对苯二甲酸(TPA)是聚酯和涤伦纤维生产的主要原料，职业接触人群较为广泛。关于TPA毒作用的实验研究，多为经口染毒，认为TPA是低毒化合物，主要以原形经泌尿道排泄，其毒作用主要是引起泌尿系统结石[1]。然而在实际生产中，TPA粉尘接触途径主要是经呼吸道吸入，对职业接触人群的肺功能检查发现有气道功能的改变[2]。因此，我们对吸入TPA粉尘大鼠的肺表面活性物质的变化进行了研究，旨在探讨TPA对肺的毒性作用，为制订车间空气TPA粉尘卫生标准提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
由上海实验动物中心提供的SD大鼠40只，体重(209.6±23.3)g，雌雄各半，随机分为对照组和低、中、高浓度暴露组，每组10只。
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1.2 受试物
精对苯二甲酸由仪征化纤公司化工厂提供，为白色粉末状，TPA纯度为99.9%。
1.3 染毒方法及浓度
用自制的粉尘吸入染毒柜染毒，染毒时间90天，每天连续4小时。各实验组动物暴露浓度以同步连续采样紫外分光光度法检测[3]。暴露空气TPA粉尘几何平均浓度及范围分别为8.93(4.19～19.30)、274.45(191.16～340.72)和618.12(563.68～709.20)mg/m3。
1.4 肺表面活性物质磷脂样品的制备
分别将大鼠以2%戊巴比妥钠麻醉，腔静脉放血处死，作颈部切开气管插管，用生理盐水12ml分4次作支气管肺泡灌洗，每次3ml，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)[4]。取8ml BALF，给予2倍体积的氯仿-甲醇(2∶1，V/V)混合液(均为国产分析纯)，在快速涡旋振荡器上混匀1min，于室温下2000r/min离心分相10min，吸取下相液，置于36℃水浴中用氮气吹干，-20℃保存待测[5]。
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1.5 磷脂的高效液相色谱(HPLC)检测[6]
采用美国Waters高效液相色谱仪，国产YWG SiO2色谱柱(4mm×300mm)，以体积比为100∶3∶1的乙腈-甲醇-磷酸混合液作流动相(乙腈为国产色谱纯，甲醇、磷酸为国产分析纯)。洗脱流速1.5ml/min，检测波长205nm。以0.5ml氯仿溶解样品，进样10μl。磷脂标准品磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)为美国Sigma公司产品，浓度均为5mg溶于0.5ml氯仿。以保留时间定性，以峰面积定量计算BALF中磷脂浓度。计算公式如下：
C=[C0×V0×A/(A0×V)]×1 000×0.5/8
式中：C表示BALF中磷脂浓度(μg/ml);C0表示标准品进样浓度(μg/μl);V0表示标准品进样体积(μl);A0表示标准品峰面积积分；V表示样品进样体积(μl);A表示样品峰面积积分；1 000为μg/μl换算成μg/ml;0.5为计算出0.5ml氯仿溶解样品中的磷脂量(μg);8为计算出8ml BALF中磷脂浓度(μg/ml)。
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1.6 碱性磷酸酶(ALP)测定
用日立7060型全自动生化分析仪检则。检测前用定质血清标定，重复性好。
1.7 数据处理
以
±s表示，用Sigma-stat软件作方差分析和Bonferroni t-test。
2 结果与分析
2.1 应用HPLC方法能较好地分离大鼠BALF中各磷脂组份。本次实验PC都表现为双峰，尚不能明确其原因，可能与分子异构有关。磷脂的HPLC检测的双峰表现其它文献也有报道[7]。大鼠BALF中磷脂的HPLC检测见附图。
2.2 HPLC检测0.5ml氯仿溶解样品，计算出各组BALF中3种磷脂的平均含量(见附表)，方差分析F值PG组为175.4、PI组为141.6、PC组为56.5，均P<0.0001。各实验组与对照组比较，PG中、高浓度组t值为15.97、18.47，PI中、高浓度组t值为14.01、16.92，PC中、高浓度组t值为9.23、11.12，均P<0.001。中、高浓度染毒组与对照组比较3种磷脂均有减少，差异有显著意义，碱性磷酸酶差异无显著性。
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附图 大鼠支气管肺泡灌洗液中磷脂高效液相色谱图
附表 对苯二甲酸染尘大鼠支气管肺泡灌洗液中磷脂含量及碱性磷酸酶活性变化(n=10，±s) 组 别
磷脂酰甘油
(μg/ml)
磷脂酰肌醇
(μg/ml)
磷脂酰胆碱
(μg/ml)
碱性磷酸酶
(U/L)
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对 照 组
5.07±0.41
7.32±1.01
69.95±10.01
79.1±17.3
低浓度组
4.66±0.35
6.52±0.68
60.44±5.53
70.1±20.4
中浓度组
2.22±0.33(1)
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2.36±0.43(1)
37.10±4.91(1)
83.4±18.1
高浓度组
1.79±0.26(1)
1.34±0.34(1)
30.38±4.97(1)
75.1±12.1
注：(1)与对照组比较 P<0.001
3 讨论
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肺表面活性物质(LS)主要成份为脂类和特异性结合蛋白，在大鼠的LS中脂肪约占88%，蛋白质占12%。而在脂质中，其主要活性成份——各种磷脂又约占84%，中性脂质占16%，所以磷脂的定量可基本反映LS的多少。LS在肺组织中由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成并储存于细胞内板层体中，然后分泌入肺泡腔。因此BALF中磷脂含量的变化，反映了肺泡Ⅱ型上皮细胞的LS合成与分泌功能。Gilfillan报道了大鼠BALF中PC、PG、PI 3种磷脂各占总磷脂的比例分别约为80.9%、7.1%、3.2%[8]。本次研究正常大鼠3种磷脂的检测结果与其基本相符。中、高浓度染毒组，BALF中3种磷脂均低于对照组(P<0.001)，提示不同浓度TPA粉尘吸入对肺泡Ⅱ型上皮细胞具有相应损伤作用，抑制了LS的合成与分泌。本实验还测定了BALF中磷脂水解酶ALP活性，实验组与对照组差异无显著性，可见染毒组LS减少的机制，不应是因为磷脂分解破坏加快所致。
LS具有保持外周小气道开放，改变气道内粘液特性的功能，从而影响气道功能[9]。吸入TPA粉尘大鼠BALF中LS量比正常对照组明显减少，势必对其气道功能产生影响。我们曾作了TPA职业接触人群肺功能检查，发现有通气功能改变[2]，除了TPA粉尘的物理化学刺激诱导组胺释放，引起气道平滑肌痉挛外，LS的减少也应是其发生机制之一。同时，LS能保持肺泡与组织间隙的液体平衡，阻止肺水肿的形成[9]。吸入TPA粉尘使LS下降，可以引起不同程度的肺水肿，这也是导致小气道阻力增加的原因之一。虽然动物实验结果不能直接外推到人群，TPA职业接触人群中亦尚未见明显的肺部X线征象[2]，但不能排列亚临床状态的轻微肺水肿存在的可能，应作为特殊高危人群进行前瞻性追踪观察。
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基金项目：国家卫生部(No.3-92-109)和江苏省科委自然科学基金(No.BS92033)
作者简介：施爱民，男，硕士，主管医师
参考文献：
[1]龚楠，王心如.对苯二甲酸毒性与生物学效应研究进展.国外医学卫生学分册，1997，24(4)：223—226
[2]李祖荣，张长来，王楷，等.对苯二甲酸作业人群肺功能的变化.卫生研究，1999，28(1)：1—3
[3]唐春元，俞筱芳.紫外分光光度法测定空气中微量对苯二甲酸.中华预防医学杂志，1982，16(2)：101—103
[4]王心如，翟为雷.急性氰戊菊酯中毒大鼠肺泡细胞形态的动态变化.中国药理学与毒理学杂志，1990，4(2)：134—137
, 百拇医药
[5]Folch J，Lees M，Sloane S GH.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.J Biol Chem，1957，226:497—509
[6]Paton RD，McGillivray AI，Speir TF，et al.HPLC of phospholipids in biolopical fluid.Clin Chim Acta，1983，133:97—99
[7]欧阳瑶，耿秋明，赵鸣武，等.大鼠支气管肺泡灌洗液磷脂组分的高效液相色谱测定.贵州医药，1997，21(4)：203—204
[8]Hollingsworth M，Gilfillan AM.The pharmacology of lung surfactant secretion.Pharmacol Rev，1984，36(2):69—85
[9]谢尔凡.肺表面活性物质的功能研究进展.国外医学呼吸系统分册，1997，17(1)：24—26
收稿日期：1999-09-08, 百拇医药
单位：施爱民(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；王顶贤(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；徐峰(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；姚宏伟(仪征化纤集团公司预防保健中心，仪征 211900)；王心如(南京医科大学公共卫生学院)；徐锡坤(南京医科大学公共卫生学院)；龚楠(南京医科大学公共卫生学院)；何冬宁(南京医科大学公共卫生学院)
关键词：对苯二甲酸；肺表面活性物质；高效液相色谱
卫生研究000203 摘 要：用高效液相色谱法检测了动式吸入对苯二甲酸粉尘后大鼠支气管肺泡灌洗液中肺表面活性物质磷脂的含量，各实验组染尘几何平均浓度分别为8.93、274.45和618.12mg/m3。结果显示中、高剂量实验组磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇均较对照组减少(P<0.001)，提示吸入对苯二甲酸粉尘可影响肺泡Ⅱ型上皮细胞肺表面活性物质的合成与分泌功能。
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分类号：R135.2 R134.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)02-0071-02
Changes of pulmonary surfactant in the rat lung
exposed to terephthalic acid
Shi Aimin Wang Dingxian Wang Xinru Xu Xikun，et al.
(Prevention & Health Center of Yizheng Chemical Fibre Group Corporetion，Yizheng 211900，China)
Abstract：The contents of phospholipids in the lung surfactant in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of rats inhaled terephthalic acid (TPA) dust were analysed with high pressure liquid chromatography (HPLC).The average geometric concentrations of TPA dust in experimental groups were 8.93，274.45 and 618.12mg/m3 respectively.The results showed that phosphatidylcholine(PC)，phosphatidyl glycerol(PG)，and phosphatidylinositol(PI) of the rats exposed to TPA at the middle and high concentrations were decreased as compared with those in the control (P<0.001).It was suggested that the functions of producing and secreting pulmonary surfactant in type Ⅱ epithelial cells were damaged after inhalating TPA dust.
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Key words： terephthalic acid，pulmonary surfactant，high pressure liquid chromatography
对苯二甲酸(TPA)是聚酯和涤伦纤维生产的主要原料，职业接触人群较为广泛。关于TPA毒作用的实验研究，多为经口染毒，认为TPA是低毒化合物，主要以原形经泌尿道排泄，其毒作用主要是引起泌尿系统结石[1]。然而在实际生产中，TPA粉尘接触途径主要是经呼吸道吸入，对职业接触人群的肺功能检查发现有气道功能的改变[2]。因此，我们对吸入TPA粉尘大鼠的肺表面活性物质的变化进行了研究，旨在探讨TPA对肺的毒性作用，为制订车间空气TPA粉尘卫生标准提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
由上海实验动物中心提供的SD大鼠40只，体重(209.6±23.3)g，雌雄各半，随机分为对照组和低、中、高浓度暴露组，每组10只。
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1.2 受试物
精对苯二甲酸由仪征化纤公司化工厂提供，为白色粉末状，TPA纯度为99.9%。
1.3 染毒方法及浓度
用自制的粉尘吸入染毒柜染毒，染毒时间90天，每天连续4小时。各实验组动物暴露浓度以同步连续采样紫外分光光度法检测[3]。暴露空气TPA粉尘几何平均浓度及范围分别为8.93(4.19～19.30)、274.45(191.16～340.72)和618.12(563.68～709.20)mg/m3。
1.4 肺表面活性物质磷脂样品的制备
分别将大鼠以2%戊巴比妥钠麻醉，腔静脉放血处死，作颈部切开气管插管，用生理盐水12ml分4次作支气管肺泡灌洗，每次3ml，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)[4]。取8ml BALF，给予2倍体积的氯仿-甲醇(2∶1，V/V)混合液(均为国产分析纯)，在快速涡旋振荡器上混匀1min，于室温下2000r/min离心分相10min，吸取下相液，置于36℃水浴中用氮气吹干，-20℃保存待测[5]。
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1.5 磷脂的高效液相色谱(HPLC)检测[6]
采用美国Waters高效液相色谱仪，国产YWG SiO2色谱柱(4mm×300mm)，以体积比为100∶3∶1的乙腈-甲醇-磷酸混合液作流动相(乙腈为国产色谱纯，甲醇、磷酸为国产分析纯)。洗脱流速1.5ml/min，检测波长205nm。以0.5ml氯仿溶解样品，进样10μl。磷脂标准品磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)为美国Sigma公司产品，浓度均为5mg溶于0.5ml氯仿。以保留时间定性，以峰面积定量计算BALF中磷脂浓度。计算公式如下：
C=[C0×V0×A/(A0×V)]×1 000×0.5/8
式中：C表示BALF中磷脂浓度(μg/ml);C0表示标准品进样浓度(μg/μl);V0表示标准品进样体积(μl);A0表示标准品峰面积积分；V表示样品进样体积(μl);A表示样品峰面积积分；1 000为μg/μl换算成μg/ml;0.5为计算出0.5ml氯仿溶解样品中的磷脂量(μg);8为计算出8ml BALF中磷脂浓度(μg/ml)。
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1.6 碱性磷酸酶(ALP)测定
用日立7060型全自动生化分析仪检则。检测前用定质血清标定，重复性好。
1.7 数据处理
以
±s表示，用Sigma-stat软件作方差分析和Bonferroni t-test。2 结果与分析
2.1 应用HPLC方法能较好地分离大鼠BALF中各磷脂组份。本次实验PC都表现为双峰，尚不能明确其原因，可能与分子异构有关。磷脂的HPLC检测的双峰表现其它文献也有报道[7]。大鼠BALF中磷脂的HPLC检测见附图。
2.2 HPLC检测0.5ml氯仿溶解样品，计算出各组BALF中3种磷脂的平均含量(见附表)，方差分析F值PG组为175.4、PI组为141.6、PC组为56.5，均P<0.0001。各实验组与对照组比较，PG中、高浓度组t值为15.97、18.47，PI中、高浓度组t值为14.01、16.92，PC中、高浓度组t值为9.23、11.12，均P<0.001。中、高浓度染毒组与对照组比较3种磷脂均有减少，差异有显著意义，碱性磷酸酶差异无显著性。
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附图 大鼠支气管肺泡灌洗液中磷脂高效液相色谱图
附表 对苯二甲酸染尘大鼠支气管肺泡灌洗液中磷脂含量及碱性磷酸酶活性变化(n=10，
±s) 组 别磷脂酰甘油
(μg/ml)
磷脂酰肌醇
(μg/ml)
磷脂酰胆碱
(μg/ml)
碱性磷酸酶
(U/L)
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对 照 组
5.07±0.41
7.32±1.01
69.95±10.01
79.1±17.3
低浓度组
4.66±0.35
6.52±0.68
60.44±5.53
70.1±20.4
中浓度组
2.22±0.33(1)
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2.36±0.43(1)
37.10±4.91(1)
83.4±18.1
高浓度组
1.79±0.26(1)
1.34±0.34(1)
30.38±4.97(1)
75.1±12.1
注：(1)与对照组比较 P<0.001
3 讨论
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肺表面活性物质(LS)主要成份为脂类和特异性结合蛋白，在大鼠的LS中脂肪约占88%，蛋白质占12%。而在脂质中，其主要活性成份——各种磷脂又约占84%，中性脂质占16%，所以磷脂的定量可基本反映LS的多少。LS在肺组织中由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成并储存于细胞内板层体中，然后分泌入肺泡腔。因此BALF中磷脂含量的变化，反映了肺泡Ⅱ型上皮细胞的LS合成与分泌功能。Gilfillan报道了大鼠BALF中PC、PG、PI 3种磷脂各占总磷脂的比例分别约为80.9%、7.1%、3.2%[8]。本次研究正常大鼠3种磷脂的检测结果与其基本相符。中、高浓度染毒组，BALF中3种磷脂均低于对照组(P<0.001)，提示不同浓度TPA粉尘吸入对肺泡Ⅱ型上皮细胞具有相应损伤作用，抑制了LS的合成与分泌。本实验还测定了BALF中磷脂水解酶ALP活性，实验组与对照组差异无显著性，可见染毒组LS减少的机制，不应是因为磷脂分解破坏加快所致。
LS具有保持外周小气道开放，改变气道内粘液特性的功能，从而影响气道功能[9]。吸入TPA粉尘大鼠BALF中LS量比正常对照组明显减少，势必对其气道功能产生影响。我们曾作了TPA职业接触人群肺功能检查，发现有通气功能改变[2]，除了TPA粉尘的物理化学刺激诱导组胺释放，引起气道平滑肌痉挛外，LS的减少也应是其发生机制之一。同时，LS能保持肺泡与组织间隙的液体平衡，阻止肺水肿的形成[9]。吸入TPA粉尘使LS下降，可以引起不同程度的肺水肿，这也是导致小气道阻力增加的原因之一。虽然动物实验结果不能直接外推到人群，TPA职业接触人群中亦尚未见明显的肺部X线征象[2]，但不能排列亚临床状态的轻微肺水肿存在的可能，应作为特殊高危人群进行前瞻性追踪观察。
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作者简介：施爱民，男，硕士，主管医师
参考文献：
[1]龚楠，王心如.对苯二甲酸毒性与生物学效应研究进展.国外医学卫生学分册，1997，24(4)：223—226
[2]李祖荣，张长来，王楷，等.对苯二甲酸作业人群肺功能的变化.卫生研究，1999，28(1)：1—3
[3]唐春元，俞筱芳.紫外分光光度法测定空气中微量对苯二甲酸.中华预防医学杂志，1982，16(2)：101—103
[4]王心如，翟为雷.急性氰戊菊酯中毒大鼠肺泡细胞形态的动态变化.中国药理学与毒理学杂志，1990，4(2)：134—137
, 百拇医药
[5]Folch J，Lees M，Sloane S GH.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.J Biol Chem，1957，226:497—509
[6]Paton RD，McGillivray AI，Speir TF，et al.HPLC of phospholipids in biolopical fluid.Clin Chim Acta，1983，133:97—99
[7]欧阳瑶，耿秋明，赵鸣武，等.大鼠支气管肺泡灌洗液磷脂组分的高效液相色谱测定.贵州医药，1997，21(4)：203—204
[8]Hollingsworth M，Gilfillan AM.The pharmacology of lung surfactant secretion.Pharmacol Rev，1984，36(2):69—85
[9]谢尔凡.肺表面活性物质的功能研究进展.国外医学呼吸系统分册，1997，17(1)：24—26
收稿日期：1999-09-08, 百拇医药