甲基对硫磷人工抗原的合成及鉴定
作者：王刚垛 马兆扬 鱼涛 何凤生
单位：王刚垛(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；马兆扬(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；鱼涛(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；何凤生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
关键词：甲基对硫磷；人工抗原；多抗血清
卫生研究000202 摘 要：为了合成甲基对硫磷(M1605)人工抗原，用醋酸-锌粉-盐酸还原甲基对硫磷，制备氨基甲基对硫磷，重氮化法使氨基甲基对硫磷与牛血清白蛋白(BSA)及中国鲎血蓝蛋白(TTH)偶合，合成人工抗原M1605-BSA、M1605-TTH。M1605-BSA免疫新西兰兔10周后，双向琼脂扩散试验和间接ELISA检测，证明得到了高价且具有较好特异性的多抗血清，成功地合成了甲基对硫磷人工抗原，为其免疫分析方法的建立提供了条件。
, 百拇医药
分类号：R139.3 TS207.53 文献标识码：B
文章编号：1000-8020(2000)02-0069-02
Synthesis and identification of methylparathion artificial antigen
Wang Gangduo Ma Zhaoyang Yu Tao He Fengsheng
(Institute of Occupational Medicine，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100050，China)
Abstract：In order to synthesize the artificial antigen methylparathion(M1605)，methylparathion was reduced into amino-methylparathion by using acetic acid-zinc powder-hydrochloric acid.Artificial antigens (M1605-BSA，M1605-TTH) were synthesized by conjugating amino-methylparathion to bovine serum albumin(BSA) and tachypleus tridentatus hemocyanin (TTH) directly after diazotization.Rabbits were immunized with M1605-BSA for 10 weeks，and the high titer and high specificity antiserum from those rabbits was testified by double agar gel diffusion and indirect ELISA.The results showed that an artificial antigen was obtained successfully and this made it possible to establish the immunoassay of M1605.
, 百拇医药
Key words： methylparathion，artificial antigen，antiserum
甲基对硫磷(M1605)是常见的有机磷农药，近年来它不仅被单独使用，还常常与氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农药混配使用[1]，造成环境污染和职业危害，甚至引起急性中毒。既往检测多用液相色谱法，仪器昂贵、纯化费时，且需要专门人员操作。为探讨简便、快速、特异的免疫分析方法[2]，我们合成了甲基对硫磷的人工抗原，并得到了高价多抗血清。为其免疫分析方法的建立提供了必要的条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 甲基对硫磷为市售农药，本实验室纯化，纯度98%以上。对氧磷和甲基对氧磷均为本实验室合成，纯度大于98%。对硫磷为中外合资绿色特种化学品有限公司产品，含量大于99%。牛血清白蛋白(BSA)为Sigma产品，国内分装。中国鲎血蓝蛋白(TTH)由军事医学科学院毒物药物研究所荣康泰研究员惠赠。Freund氏完全和不完全佐剂为Gibco产品。冻干卡介苗为北京生物制品研究所产品。HRP标记羊抗兔IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司。琼脂粉为日本生产，国内分装。其它化学试剂均为国产，分析纯。
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1.1.2 仪器 550型酶标仪系美国Bio-Rad公司生产。96孔酶标板为Nunc产品。冷冻干燥器系Bio-Rad公司产品。
1.1.3 动物 新西兰纯种雌性白兔购自中国药品生物制品鉴定所动物繁殖场，兔龄3个月，体重2.2～2.5kg。
1.2 方法
1.2.1 氨基甲基对硫磷的制备 称甲基对硫磷4g溶入40ml乙醚中，用0.1mol/L冷Na2CO3溶液20ml洗涤，共3次，洗水为黄色，弃去。在上述乙醚相中加入40ml乙酸-浓盐酸(9∶1，V/V)，分次加入锌粉8g，加毕升温搅拌50min。冷却乙醚层用25ml蒸馏水洗2次，无水硫酸钠干燥，过夜回收乙醚，得棕黄色油状物。将此油状物溶入0.5mol/L盐酸，使pH1～2，滤去不溶物，该溶液用己烷萃取，弃去己烷层，水层用2.5mol/L NaOH溶液碱化，调pH至10～11时，有橙黄色油状物析出，再用CHCl3萃取3次，合并，用无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏，得到棕色油状物。然后用硅胶GF254薄板层析(TLC)法点样鉴定(Rf=0.32)。
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1.2.2 人工抗原的合成 称取氨基甲基对硫磷100mg，用50ml含2mmol盐酸的蒸馏水将其溶解，投入150ml三颈瓶中，在冰浴中冷却，逐滴加入冷的0.1mol/L的NaNO2溶液，直至使无色淀粉碘化钾试纸变蓝，再继续搅拌30min后，加入适量尿素除去过量的HNO2。
称取BSA 400mg，溶入100ml pH9的硼酸盐酸缓冲液中，加入上述三颈瓶，冰浴里搅拌2h，反应液逐渐呈棕红色透明状，即得到人工抗原粗品。将其反应液置蒸馏水中透析5d，透析产物经冷冻、干燥得棕黄色片状物，即为M1605-BSA人工抗原，置干燥器内低温保存。
用同样的方法制备M1605-TTH人工抗原，作为ELISA方法检测时的包被抗原。
通过检测人工抗原中磷的含量计算甲基对硫磷与载体的结合比[3]。
, http://www.100md.com
1.2.3 多抗血清的制备 新西兰白兔皮内注射冻干卡介苗致敏，2周后M1605-BSA的生理盐水溶液与等容积的Freund氏完全佐剂制成乳剂，给2只白兔背部皮下多点注射作为基础免疫(每只兔1mg M1605-BSA)，4周后同剂量的M1605-BSA与Freund氏不完全佐剂乳化给白兔背部皮下多点注射加强免疫，以后每2周同剂量不加Freund氏佐剂的M1605-BSA再次加强免疫，第4次经耳缘静脉注射免疫，2周后取血即可得到所需要的多抗血清。
1.2.4 双向琼脂扩散试验 第4次免疫后10天，耳缘静脉取血，双向琼脂扩散法检测多抗血清。
1.2.5 多抗血清效价检测 第4次免疫后2周(共免疫10周)，间接ELISA法检测所得多抗血清的效价。
1.2.6 抗体的特异性检测 采用ELISA法就甲基对硫磷、甲基对氧磷、对硫磷和对氧磷对所得多抗血清进行抑制试验[4]，探讨该多抗血清的特异性。
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2 结果
2.1 根据人工抗原中磷的含量，计算出甲基对硫磷与载体的结合比分别是：甲基对硫磷与BSA为(8～10)∶1，甲基对硫磷与TTH为(630～690)∶1。
2.2 第4次免疫后10天，用所得的血清与M1605-TTH做双向琼脂扩散试验，12h后观察到沉淀线。说明多抗血清中含有抗半抗原甲基对硫磷的抗体。
2.3 第4次免疫后2周，2只被免疫兔多抗血清的抗体滴度见附图。
2.4 ELISA法检测甲基对硫磷、甲基对氧磷、对硫磷和对氧磷对获得的多抗血清抑制情况的结果显示，当抗血清的抑制率为50%时，甲基对硫磷为30ng，甲基对氧磷为120ng，对硫磷为1 000ng，对氧磷大于1 000ng。可见多抗血清对甲基对硫磷具有较高的特异性。
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附图 2只兔免疫后多抗血清抗体滴度
3 讨论
自从Hammok等人发现了免疫检测技术可用于小分子农药分析以后，国外已陆续开发了数十种农药的ELISA分析方法[5]。在国内，ELISA技术虽早已用于医学临床实验检测，但在职业医学中小分子物质检测领域尚少应用。
甲基对硫磷稳定性较差，其甲基比较活跃，在合成人工抗原时需要应用温和的反应条件，给合成带来一定困难。本研究中合成了甲基对硫磷的人工抗原，并用于免疫家兔得到了高价多抗血清，且该多抗血清对半抗原甲基对硫磷具有较高的特异性，说明我们合成的人工抗原具有较好的免疫原性。因此，甲基对硫磷人工抗原和多克隆抗体制备的成功，为其单克隆抗体的进一步研制、免疫分析方法的建立以及对甲基对硫磷急性中毒的快速特异性诊断和环境、食品中残留农药的快速检测等提供了具有一定价值的研究基础和技术储备。
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基金项目：国家“九五”攻关基金(No.96-906-04-11)
作者简介：王刚垛，男，博士生
参考文献：
[1]杨东仁，何凤生，付桂平.我国农药使用品种现状分析.中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(6)：348—350
[2]王刚垛，何凤生，荣康泰.农药免疫分析方法进展.国外医学卫生学分册，1998，25(5)：301—304
[3]荣康泰，龚雄麒.对氧磷-血蓝蛋白免疫家兔的抗毒试验.中华预防医学杂志，1980，14(3)：133—136
[4]Marco MP，Gee SJ，Cheng HM，et al.Development of an enzyme linked immunosorbent assay for carbaryl.J Agric Food Chem，1993，41:423—430
[5]Sherma J.Current status of pesticide residue analysis.J AOAC Int，1997，80:283—287
收稿日期：1999-05-30, http://www.100md.com
单位：王刚垛(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；马兆扬(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；鱼涛(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；何凤生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
关键词：甲基对硫磷；人工抗原；多抗血清
卫生研究000202 摘 要：为了合成甲基对硫磷(M1605)人工抗原，用醋酸-锌粉-盐酸还原甲基对硫磷，制备氨基甲基对硫磷，重氮化法使氨基甲基对硫磷与牛血清白蛋白(BSA)及中国鲎血蓝蛋白(TTH)偶合，合成人工抗原M1605-BSA、M1605-TTH。M1605-BSA免疫新西兰兔10周后，双向琼脂扩散试验和间接ELISA检测，证明得到了高价且具有较好特异性的多抗血清，成功地合成了甲基对硫磷人工抗原，为其免疫分析方法的建立提供了条件。
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分类号：R139.3 TS207.53 文献标识码：B
文章编号：1000-8020(2000)02-0069-02
Synthesis and identification of methylparathion artificial antigen
Wang Gangduo Ma Zhaoyang Yu Tao He Fengsheng
(Institute of Occupational Medicine，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100050，China)
Abstract：In order to synthesize the artificial antigen methylparathion(M1605)，methylparathion was reduced into amino-methylparathion by using acetic acid-zinc powder-hydrochloric acid.Artificial antigens (M1605-BSA，M1605-TTH) were synthesized by conjugating amino-methylparathion to bovine serum albumin(BSA) and tachypleus tridentatus hemocyanin (TTH) directly after diazotization.Rabbits were immunized with M1605-BSA for 10 weeks，and the high titer and high specificity antiserum from those rabbits was testified by double agar gel diffusion and indirect ELISA.The results showed that an artificial antigen was obtained successfully and this made it possible to establish the immunoassay of M1605.
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Key words： methylparathion，artificial antigen，antiserum
甲基对硫磷(M1605)是常见的有机磷农药，近年来它不仅被单独使用，还常常与氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农药混配使用[1]，造成环境污染和职业危害，甚至引起急性中毒。既往检测多用液相色谱法，仪器昂贵、纯化费时，且需要专门人员操作。为探讨简便、快速、特异的免疫分析方法[2]，我们合成了甲基对硫磷的人工抗原，并得到了高价多抗血清。为其免疫分析方法的建立提供了必要的条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 甲基对硫磷为市售农药，本实验室纯化，纯度98%以上。对氧磷和甲基对氧磷均为本实验室合成，纯度大于98%。对硫磷为中外合资绿色特种化学品有限公司产品，含量大于99%。牛血清白蛋白(BSA)为Sigma产品，国内分装。中国鲎血蓝蛋白(TTH)由军事医学科学院毒物药物研究所荣康泰研究员惠赠。Freund氏完全和不完全佐剂为Gibco产品。冻干卡介苗为北京生物制品研究所产品。HRP标记羊抗兔IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司。琼脂粉为日本生产，国内分装。其它化学试剂均为国产，分析纯。
, 百拇医药
1.1.2 仪器 550型酶标仪系美国Bio-Rad公司生产。96孔酶标板为Nunc产品。冷冻干燥器系Bio-Rad公司产品。
1.1.3 动物 新西兰纯种雌性白兔购自中国药品生物制品鉴定所动物繁殖场，兔龄3个月，体重2.2～2.5kg。
1.2 方法
1.2.1 氨基甲基对硫磷的制备 称甲基对硫磷4g溶入40ml乙醚中，用0.1mol/L冷Na2CO3溶液20ml洗涤，共3次，洗水为黄色，弃去。在上述乙醚相中加入40ml乙酸-浓盐酸(9∶1，V/V)，分次加入锌粉8g，加毕升温搅拌50min。冷却乙醚层用25ml蒸馏水洗2次，无水硫酸钠干燥，过夜回收乙醚，得棕黄色油状物。将此油状物溶入0.5mol/L盐酸，使pH1～2，滤去不溶物，该溶液用己烷萃取，弃去己烷层，水层用2.5mol/L NaOH溶液碱化，调pH至10～11时，有橙黄色油状物析出，再用CHCl3萃取3次，合并，用无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏，得到棕色油状物。然后用硅胶GF254薄板层析(TLC)法点样鉴定(Rf=0.32)。
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1.2.2 人工抗原的合成 称取氨基甲基对硫磷100mg，用50ml含2mmol盐酸的蒸馏水将其溶解，投入150ml三颈瓶中，在冰浴中冷却，逐滴加入冷的0.1mol/L的NaNO2溶液，直至使无色淀粉碘化钾试纸变蓝，再继续搅拌30min后，加入适量尿素除去过量的HNO2。
称取BSA 400mg，溶入100ml pH9的硼酸盐酸缓冲液中，加入上述三颈瓶，冰浴里搅拌2h，反应液逐渐呈棕红色透明状，即得到人工抗原粗品。将其反应液置蒸馏水中透析5d，透析产物经冷冻、干燥得棕黄色片状物，即为M1605-BSA人工抗原，置干燥器内低温保存。
用同样的方法制备M1605-TTH人工抗原，作为ELISA方法检测时的包被抗原。
通过检测人工抗原中磷的含量计算甲基对硫磷与载体的结合比[3]。
, http://www.100md.com
1.2.3 多抗血清的制备 新西兰白兔皮内注射冻干卡介苗致敏，2周后M1605-BSA的生理盐水溶液与等容积的Freund氏完全佐剂制成乳剂，给2只白兔背部皮下多点注射作为基础免疫(每只兔1mg M1605-BSA)，4周后同剂量的M1605-BSA与Freund氏不完全佐剂乳化给白兔背部皮下多点注射加强免疫，以后每2周同剂量不加Freund氏佐剂的M1605-BSA再次加强免疫，第4次经耳缘静脉注射免疫，2周后取血即可得到所需要的多抗血清。
1.2.4 双向琼脂扩散试验 第4次免疫后10天，耳缘静脉取血，双向琼脂扩散法检测多抗血清。
1.2.5 多抗血清效价检测 第4次免疫后2周(共免疫10周)，间接ELISA法检测所得多抗血清的效价。
1.2.6 抗体的特异性检测 采用ELISA法就甲基对硫磷、甲基对氧磷、对硫磷和对氧磷对所得多抗血清进行抑制试验[4]，探讨该多抗血清的特异性。
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2 结果
2.1 根据人工抗原中磷的含量，计算出甲基对硫磷与载体的结合比分别是：甲基对硫磷与BSA为(8～10)∶1，甲基对硫磷与TTH为(630～690)∶1。
2.2 第4次免疫后10天，用所得的血清与M1605-TTH做双向琼脂扩散试验，12h后观察到沉淀线。说明多抗血清中含有抗半抗原甲基对硫磷的抗体。
2.3 第4次免疫后2周，2只被免疫兔多抗血清的抗体滴度见附图。
2.4 ELISA法检测甲基对硫磷、甲基对氧磷、对硫磷和对氧磷对获得的多抗血清抑制情况的结果显示，当抗血清的抑制率为50%时，甲基对硫磷为30ng，甲基对氧磷为120ng，对硫磷为1 000ng，对氧磷大于1 000ng。可见多抗血清对甲基对硫磷具有较高的特异性。
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附图 2只兔免疫后多抗血清抗体滴度
3 讨论
自从Hammok等人发现了免疫检测技术可用于小分子农药分析以后，国外已陆续开发了数十种农药的ELISA分析方法[5]。在国内，ELISA技术虽早已用于医学临床实验检测，但在职业医学中小分子物质检测领域尚少应用。
甲基对硫磷稳定性较差，其甲基比较活跃，在合成人工抗原时需要应用温和的反应条件，给合成带来一定困难。本研究中合成了甲基对硫磷的人工抗原，并用于免疫家兔得到了高价多抗血清，且该多抗血清对半抗原甲基对硫磷具有较高的特异性，说明我们合成的人工抗原具有较好的免疫原性。因此，甲基对硫磷人工抗原和多克隆抗体制备的成功，为其单克隆抗体的进一步研制、免疫分析方法的建立以及对甲基对硫磷急性中毒的快速特异性诊断和环境、食品中残留农药的快速检测等提供了具有一定价值的研究基础和技术储备。
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基金项目：国家“九五”攻关基金(No.96-906-04-11)
作者简介：王刚垛，男，博士生
参考文献：
[1]杨东仁，何凤生，付桂平.我国农药使用品种现状分析.中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(6)：348—350
[2]王刚垛，何凤生，荣康泰.农药免疫分析方法进展.国外医学卫生学分册，1998，25(5)：301—304
[3]荣康泰，龚雄麒.对氧磷-血蓝蛋白免疫家兔的抗毒试验.中华预防医学杂志，1980，14(3)：133—136
[4]Marco MP，Gee SJ，Cheng HM，et al.Development of an enzyme linked immunosorbent assay for carbaryl.J Agric Food Chem，1993，41:423—430
[5]Sherma J.Current status of pesticide residue analysis.J AOAC Int，1997，80:283—287
收稿日期：1999-05-30, http://www.100md.com