嗜麦芽寡养单胞菌的简易鉴定方法研究
作者：林黎明 赵乃昕
单位：林黎明(东出入境检验检疫局，青岛 266002)；赵乃昕(东出入境检验检疫局，青岛 266002)；林黎明(山东省潍坊医学院)；赵乃昕(山东省潍坊医学院)
关键词：
文章编号文章编号：1000-8020(2000)02-0126-02
嗜麦芽寡养(窄食)单胞菌(stenortrophomonas maltophilia)是广泛存在于土壤、植物、农副产品、人体和动物体表面，是能引起感染的条件致病菌[1]。在分离的非发酵的细胞中，它仅次于铜绿假单胞菌[2]，该菌对一般抗生素和化学治疗剂的耐药性较高，因而给治疗带来困难[3]。该菌对药物敏感试验也不易得出准确和恒定的结果[4]。
, http://www.100md.com
由本实验建立的MBM三联培养基鉴定方法简易，结合被称之为金标准的API20NE鉴定系统和经典的实验方法，对临床标本、土壤、水果、蔬菜表面分离的嗜麦芽寡养单胞菌进行了比较研究，实验结果基本一致。
1 材料与方法
1.1 菌种与来源
该菌的模式株为ATCC13637，其它菌株分别来自临床标本、植物根系，土壤和水果蔬菜表面[5]。用于对照的细胞为铜绿假单胞菌，葱头假单胞菌ATCC 13945和大肠埃希氏菌。
1.2 培养基
1.2.1 API 20NE鉴定系统培养基，为法国La Balme les Grottes产品，包括21个生化反应，专用于葡萄糖非发酵型革兰氏阳性杆菌的鉴定。
, 百拇医药
1.2.2 经典实验方法培养基 包括氧化发酵(OF)试验培养基和其它生化反应培养基，按文献方法配制[6]。
1.2.3 无机盐基础培养基(Mineral basal medium， MBM)成分为(g/L)：(NH4)2SO4，2.0；NaH2PO4.H2O 0.5；K2HPO4，0.5；MgSO4*7H2O 0.2；CaCl2.2H2O 0.1。以蒸馏水配制，pH6.9。每升加入1%溴麝香草酚兰水溶液5mL，然后加入最终浓度为1%的化学纯琼脂粉，高压灭菌后可在4℃长久存放使用。
, http://www.100md.com
1.2.4 MBM三联培养基 MBM中含葡萄糖(MBM1)，麦芽糖(MBM2)和含特定氨基酸(MBM3)的三种培养基。
1.3 鉴定程序与比较研究方法
取血平板或普通平板上的疑似菌落，进行革兰氏染色及氧化发酵试验，如显示为葡萄糖非发酵型、氧化产酸缓慢或不产酸，革兰氏阴性杆菌则进行氧化酶试验，氧化酶阳性或极弱阳性者，分别进行API 20 NE系统鉴定；MBM三联培养基简易鉴定；经典底物利用试验及常规方法鉴定。
1.3.1 API 20 NE系统鉴定方法[7]，鉴定结果以代码表示，查阅有关手册以确定其符合率。
1.3.2 MBM三联培养基简易鉴定方法 当接种菌MBM1，MBM2，MBM3呈现-、-、+反应时即可认为是嗜麦芽寡养单胞菌。
, 百拇医药
1.3.3 经典底物利用试验 在MBM3培养基的基础上，加入要试验的有机化合物制备平板，每个平板含一种化合物，点种7～10个菌株，35℃培养48小时，有生长者为底物利用试验阳性。
1.3.4 常规方法鉴定[6] 共30项性状描述。
2 实验结果
分离并鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌的细菌为革兰氏阴性杆菌，胞内无苏丹黑颗粒(聚β-羟丁酸盐颗粒)，鞭毛染色为极鞭毛菌，每菌鞭毛数>1。在营养琼脂上易生长，淡黄或浅黄色菌落。血平板上呈淡紫绿色溶血。
氧化发酵(OF)试验为葡萄糖非发酵型，但氧化产酸能力较差，有的不显产酸或开始时反而微碱，氧化酶试验阴性。
该菌在API20NE中的反应见表1和表2。主要的编码结果为1452341，也有几株菌的编码结果略有不同，但经查阅有关手册，与嗜麦芽寡养单胞菌的符合率均达99%以上。
, 百拇医药
该菌在MBM三联培养基上生长结果见表1。
表1 嗜麦芽寡养单胞菌简易鉴定试验结果比较
菌号
菌种
来源或
保藏号
MBM1
MBM2
MBM3
API 20NE
结果
, http://www.100md.com 常规
鉴定
1
嗜麦芽寡养单胞
痰
-
-
+
1452341
符合
2
嗜麦芽寡养单胞
痰
-
, http://www.100md.com
-
+
1452341
符合
3
嗜麦芽寡养单胞
咽拭
-
-
+
1472341
符合
4
, http://www.100md.com 嗜麦芽寡养单胞
精液
-
-
+
1472345
符合
5
嗜麦芽寡养单胞
ATCC
13637
-
-
, http://www.100md.com +
1452341
符合
6
嗜麦芽寡养单胞
土壤
-
-
+
0472341
符合
7
嗜麦芽寡养单胞
, http://www.100md.com 血液
-
-
+
0472351
符合
8
嗜麦芽寡养单胞
脑脊液
-
-
+
1452341
符合
, 百拇医药
9
嗜麦芽寡养单胞
苹果表面
-
-
+
1452345
符合
10
嗜麦芽寡养单胞
真空
包装葱
-
, 百拇医药
-
+
1452341
符合
11
嗜麦芽寡养单胞
小麦根系
-
-
+
1472341
符合
12
, http://www.100md.com
铜绿假单胞菌
脓汁
+
-
-
0354575
不符合
13
葱头假单胞菌
ATCC
+
-
-
, 百拇医药 0476557
不符合
14
大肠埃希氏菌
水13945
+
+
+
-
不符合
底物利用试验结果见表2，146种底物中，可被90%以上菌株利用的有24种，另4种仅被少数菌株利用。118种未被利用的底物未列出。
常规鉴定的生化实验结果符合嗜麦芽寡养单胞菌的特征。表2 嗜麦芽寡养单胞菌的主要生
, 百拇医药
化反应及底物利用试验(1)
对API20NE的反应
Stanier底物中可
被90%菌株利用的
化合物
Stanier底物中仅
能为部分菌株利
用的化合物
硝酸盐还原 +/-
葡萄糖 乳糖
果糖
产生吲哚 -
, 百拇医药
麦芽糖 蔗糖
异丁酸盐
葡萄糖产酸 -/+
甘露糖 蕈糖
顺乌头酸盐
精氨酸水解 -
纤维二糖 水杨素
正丙醇
尿素水解 -
乙酸盐 丙酸盐
七叶苷水解 +
戊酸盐 丙二酸盐
, http://www.100md.com
明胶液化 +
琥珀酸盐 延胡索酸盐
β-半乳糖苷酶 -/+
L-苹果酸盐 乳酸盐
利用葡萄糖 +/(+)
柠檬酸盐 α-酮戊二酸盐
利用阿拉伯糖 -
L-丙酸盐 D-丙酸盐
利用甘露糖 +/-
L-谷氨酸 L-脯氨酸
利用甘露醇 -
, 百拇医药 L-组氨酸 丙酮酸盐
利用乙酰葡萄糖胺 +/-
利用麦芽糖 +
利用葡萄糖酸盐 -
利用癸酸盐 -
利用己二酸盐 -/+
利用苹果酸盐 +
利用柠檬酸盐 +
利用苯乙酸盐 -
氧化酶 -/(+)
注：(1)+阳性，-阴性，(+)弱阳性，Stanier的146种底物见文献[8]，116种不被利用的化合物未列出
, 百拇医药
3 讨 论
鉴定嗜麦芽寡养单胞菌的困难在于用于鉴定开始步骤的氧化发酵(OF)试验和氧化酶试验的结果不明确。由于该菌需要特定氨基酸作为生长因子，在含单一有机碳源的MBM上不生长；此菌能利用双糖中的麦芽糖、乳糖、蔗糖、蕈糖而不能利用半乳糖；有的不利用果糖且对葡萄糖的利用和产酸往往明显差于麦芽糖。根据以上特点我们设计了MBM三联培养基。实验结果证明，如三联培养基的结果为-、-、+，即可认定为是嗜麦芽寡养单胞菌，使此试验建立在可靠性较高的基础上[9]。
本文提供的简易鉴定方法，分别与被称为金标准的API 20NE系统方法、常规鉴定方法、以及Stanier等的底物利用试验比较，鉴定结果完全相符。
对于已鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌的菌株，为追踪传染与污染源及进行流行病学调查，需要进一步区别菌株间的多态性，采用的方法有抗O抗原的血清分型法，热裂解气相色谱测定细胞脂肪酸，细菌DNA限制片段长度多态性法，随机扩大多态性DNA等[10]。这些方法或需要供应分型血清，或需要贵重仪器，或需要繁琐步骤，从实用角度上看，难用于常规检验。从表型性状的差别，可以提供菌株间的区别符号和标记，再加上菌株间药敏谱的差别，可满足区别菌株间的多态性的要求。
, http://www.100md.com
作者简介：林黎明，男，大学本科，高级工程师
参考文献：
[1]Berg G. Stenotrophomonas maltophilia in the rhizosphere of oilseed rape-occurrence， characterization and interaction with phytopathogenic fungi. Microbiol Rds，1996，151(1)，19-27
[2]Villarino ME. Risk factors for epidemic Xanthomonas maltophilia infection/colonization intensive care unil patients. Infect Control Hosp Epidemiol，1992，13(4)：201—206
, 百拇医药
[3]Bellido JLM. In vitro activities of β-lactam-β-lactams inhibitor combinations against Stenotrophomonas maltophilia:correlation between methods for testing inhibitory activity， time-kill curves， and bacterial activity. Antimicrop Agents Chemother，1997，41(12)：2612—2615
[4]Pankuch GA. Susceptibilities of 123 strains of Xanthomonas maltophilia to eight β-lactams (including β-lactamase inhibitor combinations)and ciprofloxacin tested by five methods. Antimicrob Agents Chemother，1994，38(10)：2317—2322
, 百拇医药
[5]马麦生.从病人痰中分离出两株嗜麦芽寡食单胞菌.潍坊医学院学报，1995，177(3)：177—180
[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细胞常用鉴定方法.北京：科学出版社，1978
[7]Gabriele B. Stenotrophomonas maltophilia in the rhizo sphere of oilseed rapeoccurrence， characterization and interaction with phytopathogenic fugni. Microbiol Res，1996，151(1)：19—27
[8]Stanier RY. The aerobic Pseudomonas:a taxonomic study. J Gen Microbiol， 1996，43:157—271
, 百拇医药
[9]Ikemoto S. Characterization of strains of Pseudomonas maltophilia which do not require methionine， Int J Syst Bacteriol，1980，30(2):437—447.
[10]van Couwenberghe CJ. Genomic fingerprinting of epidemic and endemic strains of Stenotrophomonas maltophilia(formerly Xanthomonas maltophilia)by arbitrarily primed PCR. J Clin Microbiol，1995，33(5)：1289—1291
收稿日期：1999-05-14, 百拇医药
单位：林黎明(东出入境检验检疫局，青岛 266002)；赵乃昕(东出入境检验检疫局，青岛 266002)；林黎明(山东省潍坊医学院)；赵乃昕(山东省潍坊医学院)
关键词：
文章编号文章编号：1000-8020(2000)02-0126-02
嗜麦芽寡养(窄食)单胞菌(stenortrophomonas maltophilia)是广泛存在于土壤、植物、农副产品、人体和动物体表面，是能引起感染的条件致病菌[1]。在分离的非发酵的细胞中，它仅次于铜绿假单胞菌[2]，该菌对一般抗生素和化学治疗剂的耐药性较高，因而给治疗带来困难[3]。该菌对药物敏感试验也不易得出准确和恒定的结果[4]。
, http://www.100md.com
由本实验建立的MBM三联培养基鉴定方法简易，结合被称之为金标准的API20NE鉴定系统和经典的实验方法，对临床标本、土壤、水果、蔬菜表面分离的嗜麦芽寡养单胞菌进行了比较研究，实验结果基本一致。
1 材料与方法
1.1 菌种与来源
该菌的模式株为ATCC13637，其它菌株分别来自临床标本、植物根系，土壤和水果蔬菜表面[5]。用于对照的细胞为铜绿假单胞菌，葱头假单胞菌ATCC 13945和大肠埃希氏菌。
1.2 培养基
1.2.1 API 20NE鉴定系统培养基，为法国La Balme les Grottes产品，包括21个生化反应，专用于葡萄糖非发酵型革兰氏阳性杆菌的鉴定。
, 百拇医药
1.2.2 经典实验方法培养基 包括氧化发酵(OF)试验培养基和其它生化反应培养基，按文献方法配制[6]。
1.2.3 无机盐基础培养基(Mineral basal medium， MBM)成分为(g/L)：(NH4)2SO4，2.0；NaH2PO4.H2O 0.5；K2HPO4，0.5；MgSO4*7H2O 0.2；CaCl2.2H2O 0.1。以蒸馏水配制，pH6.9。每升加入1%溴麝香草酚兰水溶液5mL，然后加入最终浓度为1%的化学纯琼脂粉，高压灭菌后可在4℃长久存放使用。
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1.2.4 MBM三联培养基 MBM中含葡萄糖(MBM1)，麦芽糖(MBM2)和含特定氨基酸(MBM3)的三种培养基。
1.3 鉴定程序与比较研究方法
取血平板或普通平板上的疑似菌落，进行革兰氏染色及氧化发酵试验，如显示为葡萄糖非发酵型、氧化产酸缓慢或不产酸，革兰氏阴性杆菌则进行氧化酶试验，氧化酶阳性或极弱阳性者，分别进行API 20 NE系统鉴定；MBM三联培养基简易鉴定；经典底物利用试验及常规方法鉴定。
1.3.1 API 20 NE系统鉴定方法[7]，鉴定结果以代码表示，查阅有关手册以确定其符合率。
1.3.2 MBM三联培养基简易鉴定方法 当接种菌MBM1，MBM2，MBM3呈现-、-、+反应时即可认为是嗜麦芽寡养单胞菌。
, 百拇医药
1.3.3 经典底物利用试验 在MBM3培养基的基础上，加入要试验的有机化合物制备平板，每个平板含一种化合物，点种7～10个菌株，35℃培养48小时，有生长者为底物利用试验阳性。
1.3.4 常规方法鉴定[6] 共30项性状描述。
2 实验结果
分离并鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌的细菌为革兰氏阴性杆菌，胞内无苏丹黑颗粒(聚β-羟丁酸盐颗粒)，鞭毛染色为极鞭毛菌，每菌鞭毛数>1。在营养琼脂上易生长，淡黄或浅黄色菌落。血平板上呈淡紫绿色溶血。
氧化发酵(OF)试验为葡萄糖非发酵型，但氧化产酸能力较差，有的不显产酸或开始时反而微碱，氧化酶试验阴性。
该菌在API20NE中的反应见表1和表2。主要的编码结果为1452341，也有几株菌的编码结果略有不同，但经查阅有关手册，与嗜麦芽寡养单胞菌的符合率均达99%以上。
, 百拇医药
该菌在MBM三联培养基上生长结果见表1。
表1 嗜麦芽寡养单胞菌简易鉴定试验结果比较
菌号
菌种
来源或
保藏号
MBM1
MBM2
MBM3
API 20NE
结果
, http://www.100md.com 常规
鉴定
1
嗜麦芽寡养单胞
痰
-
-
+
1452341
符合
2
嗜麦芽寡养单胞
痰
-
, http://www.100md.com
-
+
1452341
符合
3
嗜麦芽寡养单胞
咽拭
-
-
+
1472341
符合
4
, http://www.100md.com 嗜麦芽寡养单胞
精液
-
-
+
1472345
符合
5
嗜麦芽寡养单胞
ATCC
13637
-
-
, http://www.100md.com +
1452341
符合
6
嗜麦芽寡养单胞
土壤
-
-
+
0472341
符合
7
嗜麦芽寡养单胞
, http://www.100md.com 血液
-
-
+
0472351
符合
8
嗜麦芽寡养单胞
脑脊液
-
-
+
1452341
符合
, 百拇医药
9
嗜麦芽寡养单胞
苹果表面
-
-
+
1452345
符合
10
嗜麦芽寡养单胞
真空
包装葱
-
, 百拇医药
-
+
1452341
符合
11
嗜麦芽寡养单胞
小麦根系
-
-
+
1472341
符合
12
, http://www.100md.com
铜绿假单胞菌
脓汁
+
-
-
0354575
不符合
13
葱头假单胞菌
ATCC
+
-
-
, 百拇医药 0476557
不符合
14
大肠埃希氏菌
水13945
+
+
+
-
不符合
底物利用试验结果见表2，146种底物中，可被90%以上菌株利用的有24种，另4种仅被少数菌株利用。118种未被利用的底物未列出。
常规鉴定的生化实验结果符合嗜麦芽寡养单胞菌的特征。表2 嗜麦芽寡养单胞菌的主要生
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化反应及底物利用试验(1)
对API20NE的反应
Stanier底物中可
被90%菌株利用的
化合物
Stanier底物中仅
能为部分菌株利
用的化合物
硝酸盐还原 +/-
葡萄糖 乳糖
果糖
产生吲哚 -
, 百拇医药
麦芽糖 蔗糖
异丁酸盐
葡萄糖产酸 -/+
甘露糖 蕈糖
顺乌头酸盐
精氨酸水解 -
纤维二糖 水杨素
正丙醇
尿素水解 -
乙酸盐 丙酸盐
七叶苷水解 +
戊酸盐 丙二酸盐
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明胶液化 +
琥珀酸盐 延胡索酸盐
β-半乳糖苷酶 -/+
L-苹果酸盐 乳酸盐
利用葡萄糖 +/(+)
柠檬酸盐 α-酮戊二酸盐
利用阿拉伯糖 -
L-丙酸盐 D-丙酸盐
利用甘露糖 +/-
L-谷氨酸 L-脯氨酸
利用甘露醇 -
, 百拇医药 L-组氨酸 丙酮酸盐
利用乙酰葡萄糖胺 +/-
利用麦芽糖 +
利用葡萄糖酸盐 -
利用癸酸盐 -
利用己二酸盐 -/+
利用苹果酸盐 +
利用柠檬酸盐 +
利用苯乙酸盐 -
氧化酶 -/(+)
注：(1)+阳性，-阴性，(+)弱阳性，Stanier的146种底物见文献[8]，116种不被利用的化合物未列出
, 百拇医药
3 讨 论
鉴定嗜麦芽寡养单胞菌的困难在于用于鉴定开始步骤的氧化发酵(OF)试验和氧化酶试验的结果不明确。由于该菌需要特定氨基酸作为生长因子，在含单一有机碳源的MBM上不生长；此菌能利用双糖中的麦芽糖、乳糖、蔗糖、蕈糖而不能利用半乳糖；有的不利用果糖且对葡萄糖的利用和产酸往往明显差于麦芽糖。根据以上特点我们设计了MBM三联培养基。实验结果证明，如三联培养基的结果为-、-、+，即可认定为是嗜麦芽寡养单胞菌，使此试验建立在可靠性较高的基础上[9]。
本文提供的简易鉴定方法，分别与被称为金标准的API 20NE系统方法、常规鉴定方法、以及Stanier等的底物利用试验比较，鉴定结果完全相符。
对于已鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌的菌株，为追踪传染与污染源及进行流行病学调查，需要进一步区别菌株间的多态性，采用的方法有抗O抗原的血清分型法，热裂解气相色谱测定细胞脂肪酸，细菌DNA限制片段长度多态性法，随机扩大多态性DNA等[10]。这些方法或需要供应分型血清，或需要贵重仪器，或需要繁琐步骤，从实用角度上看，难用于常规检验。从表型性状的差别，可以提供菌株间的区别符号和标记，再加上菌株间药敏谱的差别，可满足区别菌株间的多态性的要求。
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作者简介：林黎明，男，大学本科，高级工程师
参考文献：
[1]Berg G. Stenotrophomonas maltophilia in the rhizosphere of oilseed rape-occurrence， characterization and interaction with phytopathogenic fungi. Microbiol Rds，1996，151(1)，19-27
[2]Villarino ME. Risk factors for epidemic Xanthomonas maltophilia infection/colonization intensive care unil patients. Infect Control Hosp Epidemiol，1992，13(4)：201—206
, 百拇医药
[3]Bellido JLM. In vitro activities of β-lactam-β-lactams inhibitor combinations against Stenotrophomonas maltophilia:correlation between methods for testing inhibitory activity， time-kill curves， and bacterial activity. Antimicrop Agents Chemother，1997，41(12)：2612—2615
[4]Pankuch GA. Susceptibilities of 123 strains of Xanthomonas maltophilia to eight β-lactams (including β-lactamase inhibitor combinations)and ciprofloxacin tested by five methods. Antimicrob Agents Chemother，1994，38(10)：2317—2322
, 百拇医药
[5]马麦生.从病人痰中分离出两株嗜麦芽寡食单胞菌.潍坊医学院学报，1995，177(3)：177—180
[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细胞常用鉴定方法.北京：科学出版社，1978
[7]Gabriele B. Stenotrophomonas maltophilia in the rhizo sphere of oilseed rapeoccurrence， characterization and interaction with phytopathogenic fugni. Microbiol Res，1996，151(1)：19—27
[8]Stanier RY. The aerobic Pseudomonas:a taxonomic study. J Gen Microbiol， 1996，43:157—271
, 百拇医药
[9]Ikemoto S. Characterization of strains of Pseudomonas maltophilia which do not require methionine， Int J Syst Bacteriol，1980，30(2):437—447.
[10]van Couwenberghe CJ. Genomic fingerprinting of epidemic and endemic strains of Stenotrophomonas maltophilia(formerly Xanthomonas maltophilia)by arbitrarily primed PCR. J Clin Microbiol，1995，33(5)：1289—1291
收稿日期：1999-05-14, 百拇医药