抗肿瘤药对膀胱癌细胞产生的免疫抑制因子作用的影响
作者：杨莉 汪少娟 杨业金 陈忠 吴燕丽
单位：杨莉(湖北医科大学第二附属医院药剂科 430071)；汪少娟(武汉市第一医院妇产科)；杨业金(同济医科大学医学分子生物学研究室)；陈忠(同济医院泌尿外科)；吴燕丽(湖北医科大学第二附属医院药剂科 430071)
关键词：白细胞介素-2；膀胱癌细胞；肿瘤免疫抑制因子
药物流行病学杂志000306 摘 要 为探索抗肿瘤药对膀胱癌细胞产生的免疫抑制因 子(TDSF)对肿瘤“免疫逃逸”病理生理过程的影响， 采用免疫生化共育实验的方法， 取得 膀胱癌细胞产生的免疫抑制因子作用于人外周血单个核细胞(PBMC)6 h， 即可抑制白细胞介 素-2(IL-2)产生， 与对照组相比经统计学处理P<0.01。 当TDSF存在时， 经激活 的PBMC效应细胞对外源性IL-2反应显著减弱， 表明IL-2的作用受到TDSF的抑制。 植物 血凝素-P(PHA-P)刺激PBMC增殖， 但TDSF使其增殖抑制。 表明IL-2产生及其作用受到TD SF抑制。 抗肿瘤药对TDSF的分泌有阻抑作用。
, 百拇医药
恶性肿瘤在其生长过程中， 能产生一系列生物学和免疫学效应， 造成宿主 的免疫抑制， 以保护其本身不受机体的攻击而继续生长， 这就是肿瘤免疫中的“免疫逃 逸”。 目前已知有多种因素参与， 其中肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子(tumor-de rived immunosuppre ssiuve factor, TDSF)是构成免疫逃逸的重要因素之一。 近年来， 国内外通过基因工程生 产IL-2， 应用IL-2和IL-2/LAK细胞对肿瘤进行过继性免疫治疗， 日益受到人们的重视[1]。 而TDSF对淋巴细胞和IL-2的抑制作用是治疗中必须解 决的问题之一。 为此 ， 我们探讨抗肿瘤药对膀胱癌细胞产生的TDSF的作用， 据此认识抗肿瘤药对肿瘤免疫逃逸 病理生理过程的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株和血清标本
BIU-87人膀胱癌细胞， 2BS正常人胚肺细胞； 膀胱癌9例， 献血员血清标本9份。
, http://www.100md.com
1.2 活性上清液的收集
10%新生小牛血清RPMI 1 640培养液调细胞 密 度至2×105/mL， 置37℃、 5% CO2孵箱培养细胞达(1～2)×106/mL时， 1 500 r pm离心10 min， 收获上清液， 0.22μm膜过滤后， 分装保存-20℃待测。
1.3 IL-2的诱生条件
用1∶10稀释的瘤细胞培养上清液与PBMC在37℃、 5% CO2中共同温育6 h， Hands液洗3次以清除残存的上清液， 再将此细胞与PHA在37 ℃、 5% CO2培养48 h， 同时设正常对照， 诱生IL-2。
1.4 效应细胞的驯化
, http://www.100md.com 用淋巴细胞分层液梯度离心获取PBMC 1×106 mL 培养于RPMI 1 640完全培养液中， 加入PHA-P10μ g/mL， 置37℃、 5% CO2中激活96 h， 此时， 大多数T细胞已转化成T淋 巴母细胞， 再用淋巴细胞分层液在100 g离心20 min， 收取淋巴母细胞， 即为IL-2的效 应细胞。
1.5 IL-2反应性的检测
用2%人血清 RPMI 1 640完全培养液 调效应细胞为2 ×105/mL， 每孔100 μL种于96孔板中， 再加1∶10稀释的瘤细胞培养上清液 及含有IL-2的条件培养液各50 μL， 同时设正常培养液及PHA对照， 37℃、 5% CO2 中培养64 h， 分别加入3H-TdR 0.5 μci/孔， 继续培养至72 h， 用多导细胞收集器 将细胞收集于玻璃纤维滤纸上， 烘干后， 同时设空白管和本底管， 用液体闪烁计数器测 定CPM值。
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1.6 PHA对淋巴细胞激活作用的测定
1×106 mLPBMC和RPMI 1 640完全 培养液中种于96孔板中， 每孔100 μL， 加入PHA-P10 μg/mL， 100 μL 1∶1 0稀释的瘤细胞培养上清液(或膀胱癌病人血清)， 以正常2BS人胚肺细胞培养上清液(或正常 人血清)作对照。 培养72 h， 同上进行3H-TdR掺入测定和计算抑制率。
1.7 抗癌药对BIU-87细胞分泌TDSF的影响
用RPMI 1 640完全培养液调 细胞密度至2×105/mL， 分别加入丝裂霉素(MMC)10 μg/mL， 5-氟 脲嘧啶(5-FU)50 μg/mL， 同时设正常对照， 置37、 5% CO2中培养60 min ， Hanks液洗3次， RPMI 1 640完全培养液重悬细胞， 调细胞至上述密度， 置37℃、 5% CO2中培养24 h， 收获上清测定TDSF活性， 方法按文献[2，3]。
, http://www.100md.com
2 结果
IL-2的分泌及反应性受到膀胱癌细胞培养上清液强烈的抑制作用(表1)；膀胱癌细胞培养上清液的临床确诊未经治疗膀胱癌患者血清对淋巴细胞激活增殖无一例外地 表现出强烈的抑制作用(表2)。 膀胱癌细胞培养上清液和膀胱癌病人血清无细胞毒作用， T DS F对IL-2的分泌及反应性， 对淋巴细胞激活增殖有剂量依赖关系， 本文结果与文献[ 3]报道一致。
表1 膀胱癌细胞培养上清液对IL-2分泌反应性的抑制作用 细胞株
n
IL-2分泌
IL-2反应性
*△CPM
, http://www.100md.com (
±S)
抑制率
(%)
*△CPM
(±S)
抑制率
(%)
对照
9
54 569±4 060
, 百拇医药 -
49 161±2 048
-
2BS
9
48 590±6 643
10.9
45 874±1 253
6.7
BIU-87
9
3 171±354
94.0*
, 百拇医药
12 668±1 698
74.2*
*与对照比较，P<0.01
CPM=测定管CPM-空白管CPM-本底CPM值示PHA对淋巴细胞或IL-2对效应细胞激活增 殖的CPM值表2 膀胱癌细胞培养上清液和膀胱癌病人血清对
PHA激活淋巴 细胞的抑制作用 级别
n
*△CPM
([ AKx-D〗±S)
抑制率
(%)
, 百拇医药
对照
9
22 740±2 204
-
2BS
9
22 161±961
2.8
BIU-87
9
2 433±527
89.3*
膀胱癌
, 百拇医药
9
12 352±1 209
45.9*
*与对照比较，P<0.01
用PHA-P刺激T淋巴细胞转化增殖时， 其它条件固定不变， 分别加入不同稀释度( 10-1～10-6)BIU-87细胞培养上清液， 用3H-TdR掺入法测定淋巴细胞 DNA合成情况。 结果表明， 随着瘤细胞上清液浓度增高， 抑制作用增强， 而2BS人胚肺细 胞培养上清液在各种稀释度上未见有明显的抑制作用(图1)。 抗癌药Mit 和5-FU对瘤细胞分泌TDSF都有阻抑作用(图2)。
用PBMC1 ×106/mL， 加入PHA-P10 μg/mL及10%瘤细胞培养上清液 (或10%膀胱癌患者血清)培养72 h， 台盼蓝染色 计数死细胞， 所有实验中PBMC存活率均达 98% 以上， 与对照组无明显差异， 可见各种瘤细胞上清液和膀胱癌患者血清无明显细胞毒作用 。
, 百拇医药
3 讨论
T细胞承担着抗微生物， 移植物排斥和肿瘤的免疫监视等一系列重要生理功能， 是 细 胞免疫的主要执行者， 在体内通过分泌IL-2而发挥一系列重要的免疫效应[4]。 因此IL-2的作用日益受到重视希望大量产出， 但是迄今为止IL-2和IL-2诱导LAK细 胞对肿瘤进行过继性免疫治疗和效果远不能令人满意。 究其原因之一， 可能与TDSF抑制淋 巴细胞增殖， IL-2的产生和反应性及其对LAK细胞诱导受TDSF的抑制有关。 所以， 研究T DSF与IL -2的关系有十分重要的意义[5]。 将PBMC与瘤细胞共育6 h， 即可观察到明显的 抑制作用， 说明TDSF主要影响T细胞活化早期。 如何阻抑TDSF的抑制作用， 本文用抗肿瘤 药 与癌细胞进行共育实验， 结果两种抗肿瘤药能部分阻断TDSF的免疫抑制作用。 说明干扰核 代谢或直接破坏DNA结构的抗肿瘤药物， 亦具有消肿病免疫逃逸的作用，其有关机制 仍在研究中。
, 百拇医药
图1 BIU-87培养上清液抑制淋巴细胞对
PHA增殖反应的效应曲线
图2抗癌药物对BIU-87分泌TDSF的阻抑作用
参 考 文 献
1.张月桂， 刘军， 唐亚莉， 等. IL-2和IL-2诱导LAK细胞治疗晚期恶性肿瘤. 肿瘤防治研究， 1995，22(1)：12
2.冯新为， 卢巧凤， 龚非力. 某些抗生素和中药对健康人外周血中性粒细胞移动的影 响. 病理生理学报， 1985，1(14)：17
3.徐红霞， 陈兆聪， 王茹端， 等. 癌症患者血清免疫抑制活性及其动态观察. 癌症， 1989，8(5)：18
4.Mertelman, Weite K. Human interleukin 2: Molecular Biology and Clinical P ossbility. Immunobiol, 1986,172:93
5.Ebert EC, et al. A soluble factor produced by colon cancer inhibits the dvelopment of cytotoxic lymphocyte. Gastroentrol clin Biol, 1989,90:1403
(2000-08-08收稿 2000-08-11修回), http://www.100md.com
单位：杨莉(湖北医科大学第二附属医院药剂科 430071)；汪少娟(武汉市第一医院妇产科)；杨业金(同济医科大学医学分子生物学研究室)；陈忠(同济医院泌尿外科)；吴燕丽(湖北医科大学第二附属医院药剂科 430071)
关键词：白细胞介素-2；膀胱癌细胞；肿瘤免疫抑制因子
药物流行病学杂志000306 摘 要 为探索抗肿瘤药对膀胱癌细胞产生的免疫抑制因 子(TDSF)对肿瘤“免疫逃逸”病理生理过程的影响， 采用免疫生化共育实验的方法， 取得 膀胱癌细胞产生的免疫抑制因子作用于人外周血单个核细胞(PBMC)6 h， 即可抑制白细胞介 素-2(IL-2)产生， 与对照组相比经统计学处理P<0.01。 当TDSF存在时， 经激活 的PBMC效应细胞对外源性IL-2反应显著减弱， 表明IL-2的作用受到TDSF的抑制。 植物 血凝素-P(PHA-P)刺激PBMC增殖， 但TDSF使其增殖抑制。 表明IL-2产生及其作用受到TD SF抑制。 抗肿瘤药对TDSF的分泌有阻抑作用。
, 百拇医药
恶性肿瘤在其生长过程中， 能产生一系列生物学和免疫学效应， 造成宿主 的免疫抑制， 以保护其本身不受机体的攻击而继续生长， 这就是肿瘤免疫中的“免疫逃 逸”。 目前已知有多种因素参与， 其中肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子(tumor-de rived immunosuppre ssiuve factor, TDSF)是构成免疫逃逸的重要因素之一。 近年来， 国内外通过基因工程生 产IL-2， 应用IL-2和IL-2/LAK细胞对肿瘤进行过继性免疫治疗， 日益受到人们的重视[1]。 而TDSF对淋巴细胞和IL-2的抑制作用是治疗中必须解 决的问题之一。 为此 ， 我们探讨抗肿瘤药对膀胱癌细胞产生的TDSF的作用， 据此认识抗肿瘤药对肿瘤免疫逃逸 病理生理过程的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株和血清标本
BIU-87人膀胱癌细胞， 2BS正常人胚肺细胞； 膀胱癌9例， 献血员血清标本9份。
, http://www.100md.com
1.2 活性上清液的收集
10%新生小牛血清RPMI 1 640培养液调细胞 密 度至2×105/mL， 置37℃、 5% CO2孵箱培养细胞达(1～2)×106/mL时， 1 500 r pm离心10 min， 收获上清液， 0.22μm膜过滤后， 分装保存-20℃待测。
1.3 IL-2的诱生条件
用1∶10稀释的瘤细胞培养上清液与PBMC在37℃、 5% CO2中共同温育6 h， Hands液洗3次以清除残存的上清液， 再将此细胞与PHA在37 ℃、 5% CO2培养48 h， 同时设正常对照， 诱生IL-2。
1.4 效应细胞的驯化
, http://www.100md.com 用淋巴细胞分层液梯度离心获取PBMC 1×106 mL 培养于RPMI 1 640完全培养液中， 加入PHA-P10μ g/mL， 置37℃、 5% CO2中激活96 h， 此时， 大多数T细胞已转化成T淋 巴母细胞， 再用淋巴细胞分层液在100 g离心20 min， 收取淋巴母细胞， 即为IL-2的效 应细胞。
1.5 IL-2反应性的检测
用2%人血清 RPMI 1 640完全培养液 调效应细胞为2 ×105/mL， 每孔100 μL种于96孔板中， 再加1∶10稀释的瘤细胞培养上清液 及含有IL-2的条件培养液各50 μL， 同时设正常培养液及PHA对照， 37℃、 5% CO2 中培养64 h， 分别加入3H-TdR 0.5 μci/孔， 继续培养至72 h， 用多导细胞收集器 将细胞收集于玻璃纤维滤纸上， 烘干后， 同时设空白管和本底管， 用液体闪烁计数器测 定CPM值。
, http://www.100md.com
1.6 PHA对淋巴细胞激活作用的测定
1×106 mLPBMC和RPMI 1 640完全 培养液中种于96孔板中， 每孔100 μL， 加入PHA-P10 μg/mL， 100 μL 1∶1 0稀释的瘤细胞培养上清液(或膀胱癌病人血清)， 以正常2BS人胚肺细胞培养上清液(或正常 人血清)作对照。 培养72 h， 同上进行3H-TdR掺入测定和计算抑制率。
1.7 抗癌药对BIU-87细胞分泌TDSF的影响
用RPMI 1 640完全培养液调 细胞密度至2×105/mL， 分别加入丝裂霉素(MMC)10 μg/mL， 5-氟 脲嘧啶(5-FU)50 μg/mL， 同时设正常对照， 置37、 5% CO2中培养60 min ， Hanks液洗3次， RPMI 1 640完全培养液重悬细胞， 调细胞至上述密度， 置37℃、 5% CO2中培养24 h， 收获上清测定TDSF活性， 方法按文献[2，3]。
, http://www.100md.com
2 结果
IL-2的分泌及反应性受到膀胱癌细胞培养上清液强烈的抑制作用(表1)；膀胱癌细胞培养上清液的临床确诊未经治疗膀胱癌患者血清对淋巴细胞激活增殖无一例外地 表现出强烈的抑制作用(表2)。 膀胱癌细胞培养上清液和膀胱癌病人血清无细胞毒作用， T DS F对IL-2的分泌及反应性， 对淋巴细胞激活增殖有剂量依赖关系， 本文结果与文献[ 3]报道一致。
表1 膀胱癌细胞培养上清液对IL-2分泌反应性的抑制作用 细胞株
n
IL-2分泌
IL-2反应性
*△CPM
, http://www.100md.com (
±S)抑制率
(%)
*△CPM
(
±S)抑制率
(%)
对照
9
54 569±4 060
, 百拇医药 -
49 161±2 048
-
2BS
9
48 590±6 643
10.9
45 874±1 253
6.7
BIU-87
9
3 171±354
94.0*
, 百拇医药
12 668±1 698
74.2*
*与对照比较，P<0.01
CPM=测定管CPM-空白管CPM-本底CPM值示PHA对淋巴细胞或IL-2对效应细胞激活增 殖的CPM值表2 膀胱癌细胞培养上清液和膀胱癌病人血清对
PHA激活淋巴 细胞的抑制作用 级别
n
*△CPM
([ AKx-D〗±S)
抑制率
(%)
, 百拇医药
对照
9
22 740±2 204
-
2BS
9
22 161±961
2.8
BIU-87
9
2 433±527
89.3*
膀胱癌
, 百拇医药
9
12 352±1 209
45.9*
*与对照比较，P<0.01
用PHA-P刺激T淋巴细胞转化增殖时， 其它条件固定不变， 分别加入不同稀释度( 10-1～10-6)BIU-87细胞培养上清液， 用3H-TdR掺入法测定淋巴细胞 DNA合成情况。 结果表明， 随着瘤细胞上清液浓度增高， 抑制作用增强， 而2BS人胚肺细 胞培养上清液在各种稀释度上未见有明显的抑制作用(图1)。 抗癌药Mit 和5-FU对瘤细胞分泌TDSF都有阻抑作用(图2)。
用PBMC1 ×106/mL， 加入PHA-P10 μg/mL及10%瘤细胞培养上清液 (或10%膀胱癌患者血清)培养72 h， 台盼蓝染色 计数死细胞， 所有实验中PBMC存活率均达 98% 以上， 与对照组无明显差异， 可见各种瘤细胞上清液和膀胱癌患者血清无明显细胞毒作用 。
, 百拇医药
3 讨论
T细胞承担着抗微生物， 移植物排斥和肿瘤的免疫监视等一系列重要生理功能， 是 细 胞免疫的主要执行者， 在体内通过分泌IL-2而发挥一系列重要的免疫效应[4]。 因此IL-2的作用日益受到重视希望大量产出， 但是迄今为止IL-2和IL-2诱导LAK细 胞对肿瘤进行过继性免疫治疗和效果远不能令人满意。 究其原因之一， 可能与TDSF抑制淋 巴细胞增殖， IL-2的产生和反应性及其对LAK细胞诱导受TDSF的抑制有关。 所以， 研究T DSF与IL -2的关系有十分重要的意义[5]。 将PBMC与瘤细胞共育6 h， 即可观察到明显的 抑制作用， 说明TDSF主要影响T细胞活化早期。 如何阻抑TDSF的抑制作用， 本文用抗肿瘤 药 与癌细胞进行共育实验， 结果两种抗肿瘤药能部分阻断TDSF的免疫抑制作用。 说明干扰核 代谢或直接破坏DNA结构的抗肿瘤药物， 亦具有消肿病免疫逃逸的作用，其有关机制 仍在研究中。
, 百拇医药
图1 BIU-87培养上清液抑制淋巴细胞对
PHA增殖反应的效应曲线
图2抗癌药物对BIU-87分泌TDSF的阻抑作用
参 考 文 献
1.张月桂， 刘军， 唐亚莉， 等. IL-2和IL-2诱导LAK细胞治疗晚期恶性肿瘤. 肿瘤防治研究， 1995，22(1)：12
2.冯新为， 卢巧凤， 龚非力. 某些抗生素和中药对健康人外周血中性粒细胞移动的影 响. 病理生理学报， 1985，1(14)：17
3.徐红霞， 陈兆聪， 王茹端， 等. 癌症患者血清免疫抑制活性及其动态观察. 癌症， 1989，8(5)：18
4.Mertelman, Weite K. Human interleukin 2: Molecular Biology and Clinical P ossbility. Immunobiol, 1986,172:93
5.Ebert EC, et al. A soluble factor produced by colon cancer inhibits the dvelopment of cytotoxic lymphocyte. Gastroentrol clin Biol, 1989,90:1403
(2000-08-08收稿 2000-08-11修回), http://www.100md.com