含有CD基因的腺病毒载体的构建*
作者：高军 朱伟 崔龙 龙建秋 谷爱梅 李茂
单位：海军医学研究所，上海市 200433；
关键词：基因治疗；腺病毒载体；CD基因；载体构建
海军医学杂志990220 摘要 目的：构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法：先将真核表达载体质粒pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中，后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果：经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体，对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。
Construction of Adenovirus Vectors Carrying CD Gene and LacZ Gene
Gao Jun, Zhu Wei, Cui Long, et al
, 百拇医药
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To construct adenovirus vectors carrying CD gene and LacZ gene. Methods: The open reading frame was released from eukaryonic expression vector plasmid pCI and inserted into the adenovirus shuttle vectors p△E1 SP1A. Then CD and LacZ genes were put into the polylinker site of the open reading frame in the modified adenovirus vectors respectively. Results: The structure of the adenovirus vectors carrying CD gene and LacZ gene was identified by restriction enzyme analysis. The newly constructed adenovirus is useful for prodrug transformation gene therapy.
, 百拇医药
Key words gene therapy; adenovirus vector; CD gene; construction
肿瘤的基因治疗一直是肿瘤学和分子生物学的研究热点，被预言为攻克肿瘤的最有前途的方法。基因治疗中的基因运载系统是个关键。腺病毒载体滴度高，高效感染分裂和非分裂期细胞，在体外或体
内均可高效地进行基因转移，且其携带的外源基因不整合到宿主染色体中，避免了逆转录病毒载体易造成的插入突变和激活癌基因的危险，广泛地应用于基因转移中。在目的基因选择上，诸多研究表明某些细菌和真菌中含有的CD基因，其表达产物胞嘧啶转氨基酶可催化对哺乳动物无毒的5-氟胞嘧啶发生脱氨基反应，生成为具高毒性杀伤作用的5-氟尿嘧啶，该产物经过代谢又可生成5-氟-5′-三磷酸尿苷和5-氟-5′-一磷酸-2′脱氧尿苷，能够抑制DNA、RNA合成，导致细胞死亡。所以，CD基因可作为自杀基因转入哺乳动物肿瘤细胞内并令其表达，再由外源选择性投入5-氟胞嘧啶便可以杀死肿瘤细胞。
, 百拇医药
本实验分别成功地构建了含有CD基因和含有LacZ报告基因的腺病毒载体，为下一步在体内、体外进行肿瘤基因治疗的研究提供了物质基础。
1 材料和方法
1.1 材料
pCD2质粒来自长海医院普外科,含有1.6Kb的CD基因。pCI质粒购自Promega公司，含有真核细胞基因转录框架，其顺式元件包含有巨细胞病毒的早期启动子(CMV)、内含子(intron)、多克隆位点(polylinker)和SV40的 转录终止信号(PolyA结构序列)，这个框架位于BglⅡ、BamHⅠ两个酶切位点之间。pΔE1sp1A质粒来自Microbix Biosystems公司,为腺病毒载体系统中E1区缺失的小片段，含有从BamH Ⅰ到BglⅡ的一段多克隆位点，可供插入外源基因。 pSV-β-Galactosidase质粒购自Promega公司，含有位于Hind Ⅲ、BamH Ⅰ酶切位点之间LacZ基因片段，其后有SV40小T抗原的PolyA尾结构。
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1.2 方法
1.2.1 构建具有pCI多克隆位点的腺病毒E1区缺失的小片段载体pCI′用BglⅡ& BamHⅠ双限制内切酶分别切开pCI和pΔE1sp1A质粒，经1%低熔点琼脂糖凝胶电泳(华美公司出品)后，用凝胶纯化试剂盒(华顺公司)回收来自pCI质粒的1.3Kb插入片段和来自pΔE1sp1A的6.4Kb载体片段,其中，1.3Kb片段为真核细胞基因转录框架,6.4Kb为含有E1区缺失的腺病毒小片断的线性化质粒,将两个片段以插入片段摩尔数∶载体片段摩尔数=3∶1的量，用T4连接酶进行连接反应。连接后的质粒转化到CaCl2致敏的DH5α菌株中，以含氨苄青霉素的SOB培养基平板筛选抗性克隆。挑选抗性单克隆10～20个，以碱裂解法小量制备质粒DNA。分别用BglⅡ& BamHⅠ和SalⅠ& EcoRⅠ两组双酶切鉴定出连接成功的阳性克隆菌，以碱裂解法大量制备质粒DNA，此质粒本实验室定名为pCI′。
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1.2.2 构建含有CD基因的腺病毒E1区缺失的小片段载体质粒 用SalⅠ限制内切酶切开质粒pCI′后，用Klenow酶和dCTP、dTTP将SalⅠ切出的粘性末端进行部分补平,灭活Klenow酶后,再用EcoRⅠ酶切出7.6Kb的插入片段。同理,用BamHⅠ酶切开质粒pCD2，用Klenow酶和dGTP、dATP将BamHⅠ切出的粘性末端进行部分补平,灭活Klenow酶后,再用EcoRⅠ酶切出1.5Kb的载体片段。以上两个片段均按方法1.2.1电泳、纯化、连接、转化及克隆挑取，用EcoRⅠ单酶切和用BamHⅠ&EcoRⅠ双酶切鉴定出连接成功的阳性菌株，大量制备质粒DNA，此即将CD基因放入的质粒pCI′转录框架的polylinker位点中，本实验室定名为pAd-CD。
1.2.3 构建含有LacZ报告基因的腺病毒E1区缺失的小片段载体 用HindⅢ& BamHⅠ酶分别切开pSV-β-Galactosidase质粒和pΔE1sp1A质粒，收取3.7Kb的含LacZ和SV40PolyA的β-Galactosidase插入片段，和6.3Kb的pΔE1sp1A载体片段。按1.2.1方法连接、转化、筛选、小量制备质粒，用HindⅢ& BamHⅠ双酶切鉴定，大量制备此两个片段成功连接的质粒DNA，并将其命名为pΔE1-LacZ 。用SalⅠ& BamHⅠ酶分别切开上述质粒pΔE1-LacZ和pCI′质粒，收取3.7Kb的插入片段和7.4Kb的pCI′载体片段。按1.2.1方法连接、转化及挑取克隆小量制备质粒，用EcoRⅠ&BamHⅠ和BamHⅠ&BglⅡ两次双酶切鉴定出连接成功的阳性克隆菌后，大量制备质粒DNA，本实验室将其定名为pAd-LacZ。
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2 结 果
在构建携带外源基因的腺病毒载体E1区缺失的小片段时，为了使外源基因能有效表达，我们在构建过程中首先将真核表达载体质粒pCI中的转录框架构建入腺病毒载体小片段中，而后再将CD基因和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点中，这样，既能使目的基因得到有效表达，且使LacZ基因在后期体内外转基因实验中作为对照更具有可比性。pAd-CD和pAd-LacZ 重组腺病毒载体小片段最后经大量扩增后，都经多酶切鉴定。对pAd-LacZ的鉴定：用EcoRⅠ单切，应切出3287bp和7922bp两条带；用EcoRⅠ& BamHⅠ双酶切，应切出450bp、3287bp和7472bp三条带。对pAd-CD的鉴定：用EcoRⅠ& BamHⅠ双酶切，应切出1769bp和7472bp两条带；用BamHⅠ& BglⅡ双酶切，应切出2832bp和6409bp两条带。以上理论推算值同实验酶切结果一致，由此可证明构建是成功的。(如图1所示)
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图1 pAd-LacZ和pAd-CD酶切鉴定电泳图
A：pAd-LacZ 酶切鉴定电泳图
LaneA-1：λDNA/HinderⅢ marker；LaneA-2：pAd-LacZ/ EcoRⅠ；LaneA-3：pAd-LacZ / EcoR Ⅰ&BamH Ⅰ
B、C：pAd-CD 酶切鉴定电泳图
LaneB-1：λDNA/HinderⅢ marker；LaneB-2：pAd-CD ；LaneB-3：pAd-CD / EcoRⅠ& BamH Ⅰ
LaneC-1：λDNA/HinderⅢ marker；LaneC-2：pAd-CD / BamHⅠ& Bgl Ⅱ；LaneC-3：pAd-CD
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3 讨 论
肿瘤的基因治疗是肿瘤学和分子生物学飞速发展的结晶。其中，基因运载系统和前药转换基因的选择是基因治疗的关键。目前，基因运载系统主要有以下四种：逆转录病毒(retrovirus)，腺病毒(adenovirus)，腺病毒相关病毒(adeno-associated virus)和脂质体(liposome)。其中，腺病毒和逆转录病毒是迄今为止使用较广、效率较高的两种基因转移系统[1]。目前研究较为广泛的前药转换基因有Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)，水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶基因(VZV-tk)、大肠杆菌胞嘧啶转氨基酶基因(CD)、人dCK基因[2]。Hoganson(1996)等在对肺鳞状细胞癌的逆转录病毒的前药转换治疗中，对此三种基因治疗肿瘤的效果进行了比较，发现CD>HSV-tk>dCK，并发现HSV-tk基因的肿瘤杀伤效果及“旁观者”效应均存在着“饱和”状态，即，当HSV-tk达到一定数值后，对细胞的杀伤效果也已达到最高，随TK酶活力的增加，杀伤效果不再增加；但CD酶活力同杀伤效果之间却存在着剂量依赖性[3]。Simon 等人报道转入CD基因的KM12.CD肿瘤细胞在0.001-50mM的5-FC浓度范围内杀伤率与前药5-FC浓度成正比[4]。这提示在体内进行肿瘤前药转换基因治疗时，CD基因可能比同等条件下HSV-tk基因的治疗效果好。
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成功的构建pAd-CD只是完成了肿瘤前药转换基因治疗的第一步，体外细胞培养和动物体内转基因治疗的实验结果将在后续的文章中报道。
* 此课题部分受国家自然科学基金资助，批准号：39600172
作者简介：崔龙 第二军医大学附属长海医院普外科
参考文献
1 曹广文. 癌症基因治疗的基础与临床. 见：现代抗癌生物治疗学.北京:人民军医出版社,1995.291-391
2 高 军，曹广文.tk基因及其在肿瘤基因治疗中的应用。国外医学免疫学分册，1996.19(4)：183
3 Hoganson DK, Batra RK, Olsen JC et al. Comparison of the effects of three different toxin genes and their levels of expression on cell growth and by-stander effect in lung adenocarcinoma. Cancer Research, 1996， 56: 1315
4 Mullen CA, Coale MM, Lowe R et al. Tumors expressing the cytosine deaminase suicide gene can be eliminated in vivo with 5-fluorocy-tosine and induce protective immunity to wild type tumor .Cancer Research, 1994， 54(3):1503
(收稿：1999-06-15), http://www.100md.com
单位：海军医学研究所，上海市 200433；
关键词：基因治疗；腺病毒载体；CD基因；载体构建
海军医学杂志990220 摘要 目的：构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法：先将真核表达载体质粒pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中，后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果：经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体，对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。
Construction of Adenovirus Vectors Carrying CD Gene and LacZ Gene
Gao Jun, Zhu Wei, Cui Long, et al
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Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To construct adenovirus vectors carrying CD gene and LacZ gene. Methods: The open reading frame was released from eukaryonic expression vector plasmid pCI and inserted into the adenovirus shuttle vectors p△E1 SP1A. Then CD and LacZ genes were put into the polylinker site of the open reading frame in the modified adenovirus vectors respectively. Results: The structure of the adenovirus vectors carrying CD gene and LacZ gene was identified by restriction enzyme analysis. The newly constructed adenovirus is useful for prodrug transformation gene therapy.
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Key words gene therapy; adenovirus vector; CD gene; construction
肿瘤的基因治疗一直是肿瘤学和分子生物学的研究热点，被预言为攻克肿瘤的最有前途的方法。基因治疗中的基因运载系统是个关键。腺病毒载体滴度高，高效感染分裂和非分裂期细胞，在体外或体
内均可高效地进行基因转移，且其携带的外源基因不整合到宿主染色体中，避免了逆转录病毒载体易造成的插入突变和激活癌基因的危险，广泛地应用于基因转移中。在目的基因选择上，诸多研究表明某些细菌和真菌中含有的CD基因，其表达产物胞嘧啶转氨基酶可催化对哺乳动物无毒的5-氟胞嘧啶发生脱氨基反应，生成为具高毒性杀伤作用的5-氟尿嘧啶，该产物经过代谢又可生成5-氟-5′-三磷酸尿苷和5-氟-5′-一磷酸-2′脱氧尿苷，能够抑制DNA、RNA合成，导致细胞死亡。所以，CD基因可作为自杀基因转入哺乳动物肿瘤细胞内并令其表达，再由外源选择性投入5-氟胞嘧啶便可以杀死肿瘤细胞。
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本实验分别成功地构建了含有CD基因和含有LacZ报告基因的腺病毒载体，为下一步在体内、体外进行肿瘤基因治疗的研究提供了物质基础。
1 材料和方法
1.1 材料
pCD2质粒来自长海医院普外科,含有1.6Kb的CD基因。pCI质粒购自Promega公司，含有真核细胞基因转录框架，其顺式元件包含有巨细胞病毒的早期启动子(CMV)、内含子(intron)、多克隆位点(polylinker)和SV40的 转录终止信号(PolyA结构序列)，这个框架位于BglⅡ、BamHⅠ两个酶切位点之间。pΔE1sp1A质粒来自Microbix Biosystems公司,为腺病毒载体系统中E1区缺失的小片段，含有从BamH Ⅰ到BglⅡ的一段多克隆位点，可供插入外源基因。 pSV-β-Galactosidase质粒购自Promega公司，含有位于Hind Ⅲ、BamH Ⅰ酶切位点之间LacZ基因片段，其后有SV40小T抗原的PolyA尾结构。
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1.2 方法
1.2.1 构建具有pCI多克隆位点的腺病毒E1区缺失的小片段载体pCI′用BglⅡ& BamHⅠ双限制内切酶分别切开pCI和pΔE1sp1A质粒，经1%低熔点琼脂糖凝胶电泳(华美公司出品)后，用凝胶纯化试剂盒(华顺公司)回收来自pCI质粒的1.3Kb插入片段和来自pΔE1sp1A的6.4Kb载体片段,其中，1.3Kb片段为真核细胞基因转录框架,6.4Kb为含有E1区缺失的腺病毒小片断的线性化质粒,将两个片段以插入片段摩尔数∶载体片段摩尔数=3∶1的量，用T4连接酶进行连接反应。连接后的质粒转化到CaCl2致敏的DH5α菌株中，以含氨苄青霉素的SOB培养基平板筛选抗性克隆。挑选抗性单克隆10～20个，以碱裂解法小量制备质粒DNA。分别用BglⅡ& BamHⅠ和SalⅠ& EcoRⅠ两组双酶切鉴定出连接成功的阳性克隆菌，以碱裂解法大量制备质粒DNA，此质粒本实验室定名为pCI′。
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1.2.2 构建含有CD基因的腺病毒E1区缺失的小片段载体质粒 用SalⅠ限制内切酶切开质粒pCI′后，用Klenow酶和dCTP、dTTP将SalⅠ切出的粘性末端进行部分补平,灭活Klenow酶后,再用EcoRⅠ酶切出7.6Kb的插入片段。同理,用BamHⅠ酶切开质粒pCD2，用Klenow酶和dGTP、dATP将BamHⅠ切出的粘性末端进行部分补平,灭活Klenow酶后,再用EcoRⅠ酶切出1.5Kb的载体片段。以上两个片段均按方法1.2.1电泳、纯化、连接、转化及克隆挑取，用EcoRⅠ单酶切和用BamHⅠ&EcoRⅠ双酶切鉴定出连接成功的阳性菌株，大量制备质粒DNA，此即将CD基因放入的质粒pCI′转录框架的polylinker位点中，本实验室定名为pAd-CD。
1.2.3 构建含有LacZ报告基因的腺病毒E1区缺失的小片段载体 用HindⅢ& BamHⅠ酶分别切开pSV-β-Galactosidase质粒和pΔE1sp1A质粒，收取3.7Kb的含LacZ和SV40PolyA的β-Galactosidase插入片段，和6.3Kb的pΔE1sp1A载体片段。按1.2.1方法连接、转化、筛选、小量制备质粒，用HindⅢ& BamHⅠ双酶切鉴定，大量制备此两个片段成功连接的质粒DNA，并将其命名为pΔE1-LacZ 。用SalⅠ& BamHⅠ酶分别切开上述质粒pΔE1-LacZ和pCI′质粒，收取3.7Kb的插入片段和7.4Kb的pCI′载体片段。按1.2.1方法连接、转化及挑取克隆小量制备质粒，用EcoRⅠ&BamHⅠ和BamHⅠ&BglⅡ两次双酶切鉴定出连接成功的阳性克隆菌后，大量制备质粒DNA，本实验室将其定名为pAd-LacZ。
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2 结 果
在构建携带外源基因的腺病毒载体E1区缺失的小片段时，为了使外源基因能有效表达，我们在构建过程中首先将真核表达载体质粒pCI中的转录框架构建入腺病毒载体小片段中，而后再将CD基因和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点中，这样，既能使目的基因得到有效表达，且使LacZ基因在后期体内外转基因实验中作为对照更具有可比性。pAd-CD和pAd-LacZ 重组腺病毒载体小片段最后经大量扩增后，都经多酶切鉴定。对pAd-LacZ的鉴定：用EcoRⅠ单切，应切出3287bp和7922bp两条带；用EcoRⅠ& BamHⅠ双酶切，应切出450bp、3287bp和7472bp三条带。对pAd-CD的鉴定：用EcoRⅠ& BamHⅠ双酶切，应切出1769bp和7472bp两条带；用BamHⅠ& BglⅡ双酶切，应切出2832bp和6409bp两条带。以上理论推算值同实验酶切结果一致，由此可证明构建是成功的。(如图1所示)
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图1 pAd-LacZ和pAd-CD酶切鉴定电泳图
A：pAd-LacZ 酶切鉴定电泳图
LaneA-1：λDNA/HinderⅢ marker；LaneA-2：pAd-LacZ/ EcoRⅠ；LaneA-3：pAd-LacZ / EcoR Ⅰ&BamH Ⅰ
B、C：pAd-CD 酶切鉴定电泳图
LaneB-1：λDNA/HinderⅢ marker；LaneB-2：pAd-CD ；LaneB-3：pAd-CD / EcoRⅠ& BamH Ⅰ
LaneC-1：λDNA/HinderⅢ marker；LaneC-2：pAd-CD / BamHⅠ& Bgl Ⅱ；LaneC-3：pAd-CD
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3 讨 论
肿瘤的基因治疗是肿瘤学和分子生物学飞速发展的结晶。其中，基因运载系统和前药转换基因的选择是基因治疗的关键。目前，基因运载系统主要有以下四种：逆转录病毒(retrovirus)，腺病毒(adenovirus)，腺病毒相关病毒(adeno-associated virus)和脂质体(liposome)。其中，腺病毒和逆转录病毒是迄今为止使用较广、效率较高的两种基因转移系统[1]。目前研究较为广泛的前药转换基因有Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)，水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶基因(VZV-tk)、大肠杆菌胞嘧啶转氨基酶基因(CD)、人dCK基因[2]。Hoganson(1996)等在对肺鳞状细胞癌的逆转录病毒的前药转换治疗中，对此三种基因治疗肿瘤的效果进行了比较，发现CD>HSV-tk>dCK，并发现HSV-tk基因的肿瘤杀伤效果及“旁观者”效应均存在着“饱和”状态，即，当HSV-tk达到一定数值后，对细胞的杀伤效果也已达到最高，随TK酶活力的增加，杀伤效果不再增加；但CD酶活力同杀伤效果之间却存在着剂量依赖性[3]。Simon 等人报道转入CD基因的KM12.CD肿瘤细胞在0.001-50mM的5-FC浓度范围内杀伤率与前药5-FC浓度成正比[4]。这提示在体内进行肿瘤前药转换基因治疗时，CD基因可能比同等条件下HSV-tk基因的治疗效果好。
, 百拇医药
成功的构建pAd-CD只是完成了肿瘤前药转换基因治疗的第一步，体外细胞培养和动物体内转基因治疗的实验结果将在后续的文章中报道。
* 此课题部分受国家自然科学基金资助，批准号：39600172
作者简介：崔龙 第二军医大学附属长海医院普外科
参考文献
1 曹广文. 癌症基因治疗的基础与临床. 见：现代抗癌生物治疗学.北京:人民军医出版社,1995.291-391
2 高 军，曹广文.tk基因及其在肿瘤基因治疗中的应用。国外医学免疫学分册，1996.19(4)：183
3 Hoganson DK, Batra RK, Olsen JC et al. Comparison of the effects of three different toxin genes and their levels of expression on cell growth and by-stander effect in lung adenocarcinoma. Cancer Research, 1996， 56: 1315
4 Mullen CA, Coale MM, Lowe R et al. Tumors expressing the cytosine deaminase suicide gene can be eliminated in vivo with 5-fluorocy-tosine and induce protective immunity to wild type tumor .Cancer Research, 1994， 54(3):1503
(收稿：1999-06-15), http://www.100md.com