肝脏缺血-再灌注后热休克蛋白70mRNA的表达
作者：刘胜 莫国贤 毛平传 吴孟超 钱光相
单位：解放军第四一一医院，上海市 200081
关键词：肝脏；缺血—再灌注；热休克蛋白；mRNA；杂交
海军医学杂志990218 摘要 目的：探讨缺血—再灌注后大鼠肝脏热休克蛋白(HSP)70mRNA的表达规律。方法：通过已建立的大鼠肝脏缺血—再灌注模型，应用人HSP 70cDNA，采用dot blot 杂交，观察缺血—再灌注后大鼠肝脏HSP 70mRNA的表达。结果：肝脏缺血15min，30min再灌注后没有HSP 70mRNA的表达，缺血60min再灌注2h伴有HSP 70mRNA的表达，高水平HSP 70mRNA的表达持续到再灌注12h，以再灌注4h表达水平为最高。缺血120min再灌注2h，HSP 70mRNA升高，高水平表达维持4h，再灌注12h HSP 70mRNA消失。结论：肝脏缺血—再灌注后可以诱导HSP 70mRNA的表达，必要的缺血时间所造成的肝脏损伤是HSP基因激活的基础，再灌注期间氧自由基的释放可能是其表达增加的原因。
, 百拇医药
Expression of Heat Shock Protein(HSP) 70mRNA in
Ischemic-Reperfused Rat Liver
Liu Sheng, Mo Guoxian, Mao Pingchuan, et al
No. 411 Hospital of PLA, Shanghai 200081
Abstract Objective: To explore the expression of heat shock protein 70mRNA in ischemic-reperfused rat liver. Methods: Changes in heat shock protein 70mRNA of rat liver were studied by dot blot hybridization using the ischemic-reperfused model of rat liver. Results: Short periods (15 or 30min) of liver ischemia was never followed by induction of HSP 70 genes after reestablishment of blood supply. Expression of HSP 70mRNA was found when 60min ischemia was followed by 2h blood reperfusion. High level HSP 70mRNA was maintained for the next 12h at least. Maximal induction of HSP 70mRNA occurred at 4h. The expression of HSP 70mRNA was increased at 2h of blood reperfusion after 120 minutes of ischemia. High level HSP 70mRNA expression was maintained for 4h. HSP 70mRNA disappeared completely 12h after restoration of the blood supply. Conclusion: The results indicate that blood reperfusion after temporary liver ischemia induces the expression of heat shock genes. The cell damage resulting from a certain duration of ischemia before reperfusion is essential for activation of heat shock genes. The possible reason of increases in HSP 70mRNA expression may be the release of oxygen free radicals during reperfusion.
, 百拇医药
Key words: liver; ischemia-reperfusion; heat shock protein; mRNA; hybridization
肝脏缺血—再灌注后引起器官水平的变化，以及某些生物化学等方面的改变，文献已报告很多，但基因转录水平有何变化，是否伴有HSP mRNA的表达，尚未见报道。我们通过建立大鼠肝脏缺血—再灌注模型，来探讨HSP 70mRNA的表达规律，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 体重150～200g Wistar 雄性大鼠50只。HSP 70cRNA质粒：由Dr. R. Morimoto惠赠。β-actin cDNA 质粒：由Dr. L. Kedes 惠赠。工具酶：BRL公司和Biolabs公司(美国)。α-32p-dATP(3 000ci/mmol,10ci/L)福瑞生物工程公司(北京)。随机引物标记盒：BRL公司(美国)。
, http://www.100md.com
1.2 动物模型的建立
1.2.1 按照Bassi[1]法制作肝缺血及再灌注损伤模型。Wistar雄性大鼠被随机分为四组：(1)肝缺血15min再灌注组；(2)肝缺血30min再灌注组；(3)肝缺血60min再灌注组；(4)肝缺血120min再灌注组。
以上各组分别于肝脏缺血后立即、肝脏缺血再灌注后1、2、4、6、12h分别断头处死大鼠取材，取材标本迅速移入液氮中保存。
1.2.2 阳性对照大鼠模型的复制。大鼠麻醉后置于温箱内用数字式温度计显示大鼠肛温，维持肛温42℃，15min后，将大鼠取出置室温1h后断头处死取肝脏，迅速移入液氮中保存。
1.2.3 阴性对照大鼠模型的复制。大鼠麻醉后不给予任何刺激，立即断头处死取肝脏，迅速移入液氮中保存。
, 百拇医药
1.3 方法 以HSP 70cRNA为探针，采用dot blot 杂交方法观察大鼠肝脏中HSP 70mRNA的变化，HSP 70mRNA的检测按下列流程图进行：
大鼠肝脏组织 质粒的转换与扩增
↓ ↓
总RNA的抽提与鉴定 质粒的抽提与纯化
↓ ↓
制备杂交膜 质粒的酶切与回收
│ ↓
│ 用α-32pdATP标记探针
──────────────
, 百拇医药 ↓
杂 交
↓
放射自显影
↓
结果分析
2 结 果
2.1 正常大鼠肝脏细胞未发现有HSP 70mRNA表达，阳性对照大鼠肝脏细胞中伴有HSP 70mRNA的高水平表达。短时间缺血如15min或30min，只引起肝脏细胞轻微损伤，在缺血及再灌注期间，未见肝脏细胞有HSP 70mRNA的表达。
2.2 肝脏细胞在缺血60min及再灌注2h后发现有HSP 70mRNA的表达，直至再灌注12h后仍见有较高水平HSP 70mRNA的表达，在缺血60min再灌注4h后，肝脏细胞HSP 70mRNA的表达量为最高。
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2.3 120min缺血时间可造成肝脏细胞不可逆损伤，再灌注后肝脏细胞损伤更加严重。120min缺血期间未发现有HSP 70mRNA的表达，再灌注2h后伴有较高水平HSP 70mRNA的表达。高水平HSP 70mRNA表达至少持续4h，再灌注损伤12h后发现表达的HSP 70mRNA完全消失。
3 讨 论
自1982年Currie等首次证实大鼠整体受热能产生HSP以来，人们对高等动物在各种应激条件下HSP生成的研究进一步深入，因为从整体实验中得到的结果更有利于从整体水平认识这一现象的意义。近年来的研究发现大鼠整体受热或缺氧后，肝脏组织伴有活性mRNA的诱导并在体外成功地表达HSP，这就更加促进各种应激状态下对肝组织中HSP及其基因表达规律的研究。HSP70是哺乳类细胞中表达量最多，也是研究最多的HSP，对细胞具有明确的内源性保护作用，人的HSP70基因与果蝇及玉米的同源性分别是73%[2]和68%[3]，因此研究大鼠肝脏缺血—再灌注期间HSP 70mRNA的变化似可反应到临床变化的规律，从而为临床的应用提供相关的理论指导。从本实验结果可以看出，没有再灌注的单纯性肝脏缺血应激刺激并没有诱导HSP 70mRNA的表达，而缺血再灌注2h后发现有HSP 70mRNA的聚集，被认为在再灌注期间血管内增加的超氧阴离子可以激活HSP 基因[4]。实验工作也显示培养的隔离肝细胞及肝细胞瘤细胞在过氧化的培养基中可以诱导HSP基因的合成[5]，另外研究也发现在缺血后再灌注期间SOD(超氧化物歧化酶Superoxide dismutase)的介入可以抑制肝脏细胞中HSP 70mRNA的表达，从而提示再灌注过程中HSP 70mRNA的表达起码一定程度上依赖于氧自由基的生成[6]。
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相当长的缺血时间，对肝脏来讲至少为60min，对于激发HSP 70基因的转入是必要的，这提示除氧自由基以外，有其它因素对肝脏细胞HSP 70mRNA的表达是必要的，在缺血期间推测细胞内损伤或异常及变性蛋白质的出现可能是最终导致HSP基因活动机制改变的另外重要原因[7]。本实验结果也证实上述推测，短时间的缺血，如15min及30min，它只能引起细胞轻微迅速的可逆性损伤，直至血流再重新建立时仍未有HSP 70mRNA的表达，而在缺血60min或120min后，可造成严重的细胞损伤，包括蛋白变性，而在再灌注期间，增加的氧自由基又加重这一破坏过程，最终导致肝脏细胞中HSP 70mRNA的表达。
总之，在缺血—再灌注后肝脏细胞中HSP基因表达的触发是复杂的，并非是单一的因素。上述结果表明，必要的缺血时间所造成肝脏的损伤是HSP基因激活的基础，而再灌注期间氧自由基的释放可能是其增加的原因。
作者简介：吴孟超 钱光相 第二军医大学东方肝胆外科医院
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bassi M, Bernelli ZA. Ultrastructural cytoplasmic change of liver cells after reversible and irreversible ischemia. Exp Mol Pathol， 1964,3:332
2 Hunt C, Morimoto RL. Conserved feature of eukaryotic HSP70 genes revealed by comparison with the nuclectid aequene of human HSP70 gene. Proc Natl Acad Sci USA， 1985, 82:6455
3 Rochester DE, Winer JA, Shan DM. The structure and expression of maize genes encoding the major heat shock protein, HSP70. EMBO J， 1986, 5:451
, http://www.100md.com
4 Courgeon AM. Hydrogen peroxide (H2O2) induces actin and some heat-shock proteins in Drosophila Cells. Eur J Biochem， 1988, 171:163
5 Cajone F, Bernelli Z A. Oxidative stress induces a sube of heat shock proteins in rat hepatocytes and MHlCl cells. Chem Biol Interact, 1988, 65(3):235
6 Schoeniger LO, Andreoni KA. Induction of heat-shock gene expression in postischemic pig liver depends on superoxide generation. Gastroenterology, 1994, 106(1):177
7 Edington BV. Inhibition of heat shock (stress) protein induction by deuterium oxide and glycerol: Additional support for the abnormal protein hypothesis of induction. J Cell Physiol, 1989, 139:219
(收稿：1999-05-10), 百拇医药
单位：解放军第四一一医院，上海市 200081
关键词：肝脏；缺血—再灌注；热休克蛋白；mRNA；杂交
海军医学杂志990218 摘要 目的：探讨缺血—再灌注后大鼠肝脏热休克蛋白(HSP)70mRNA的表达规律。方法：通过已建立的大鼠肝脏缺血—再灌注模型，应用人HSP 70cDNA，采用dot blot 杂交，观察缺血—再灌注后大鼠肝脏HSP 70mRNA的表达。结果：肝脏缺血15min，30min再灌注后没有HSP 70mRNA的表达，缺血60min再灌注2h伴有HSP 70mRNA的表达，高水平HSP 70mRNA的表达持续到再灌注12h，以再灌注4h表达水平为最高。缺血120min再灌注2h，HSP 70mRNA升高，高水平表达维持4h，再灌注12h HSP 70mRNA消失。结论：肝脏缺血—再灌注后可以诱导HSP 70mRNA的表达，必要的缺血时间所造成的肝脏损伤是HSP基因激活的基础，再灌注期间氧自由基的释放可能是其表达增加的原因。
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Expression of Heat Shock Protein(HSP) 70mRNA in
Ischemic-Reperfused Rat Liver
Liu Sheng, Mo Guoxian, Mao Pingchuan, et al
No. 411 Hospital of PLA, Shanghai 200081
Abstract Objective: To explore the expression of heat shock protein 70mRNA in ischemic-reperfused rat liver. Methods: Changes in heat shock protein 70mRNA of rat liver were studied by dot blot hybridization using the ischemic-reperfused model of rat liver. Results: Short periods (15 or 30min) of liver ischemia was never followed by induction of HSP 70 genes after reestablishment of blood supply. Expression of HSP 70mRNA was found when 60min ischemia was followed by 2h blood reperfusion. High level HSP 70mRNA was maintained for the next 12h at least. Maximal induction of HSP 70mRNA occurred at 4h. The expression of HSP 70mRNA was increased at 2h of blood reperfusion after 120 minutes of ischemia. High level HSP 70mRNA expression was maintained for 4h. HSP 70mRNA disappeared completely 12h after restoration of the blood supply. Conclusion: The results indicate that blood reperfusion after temporary liver ischemia induces the expression of heat shock genes. The cell damage resulting from a certain duration of ischemia before reperfusion is essential for activation of heat shock genes. The possible reason of increases in HSP 70mRNA expression may be the release of oxygen free radicals during reperfusion.
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Key words: liver; ischemia-reperfusion; heat shock protein; mRNA; hybridization
肝脏缺血—再灌注后引起器官水平的变化，以及某些生物化学等方面的改变，文献已报告很多，但基因转录水平有何变化，是否伴有HSP mRNA的表达，尚未见报道。我们通过建立大鼠肝脏缺血—再灌注模型，来探讨HSP 70mRNA的表达规律，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 体重150～200g Wistar 雄性大鼠50只。HSP 70cRNA质粒：由Dr. R. Morimoto惠赠。β-actin cDNA 质粒：由Dr. L. Kedes 惠赠。工具酶：BRL公司和Biolabs公司(美国)。α-32p-dATP(3 000ci/mmol,10ci/L)福瑞生物工程公司(北京)。随机引物标记盒：BRL公司(美国)。
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1.2 动物模型的建立
1.2.1 按照Bassi[1]法制作肝缺血及再灌注损伤模型。Wistar雄性大鼠被随机分为四组：(1)肝缺血15min再灌注组；(2)肝缺血30min再灌注组；(3)肝缺血60min再灌注组；(4)肝缺血120min再灌注组。
以上各组分别于肝脏缺血后立即、肝脏缺血再灌注后1、2、4、6、12h分别断头处死大鼠取材，取材标本迅速移入液氮中保存。
1.2.2 阳性对照大鼠模型的复制。大鼠麻醉后置于温箱内用数字式温度计显示大鼠肛温，维持肛温42℃，15min后，将大鼠取出置室温1h后断头处死取肝脏，迅速移入液氮中保存。
1.2.3 阴性对照大鼠模型的复制。大鼠麻醉后不给予任何刺激，立即断头处死取肝脏，迅速移入液氮中保存。
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1.3 方法 以HSP 70cRNA为探针，采用dot blot 杂交方法观察大鼠肝脏中HSP 70mRNA的变化，HSP 70mRNA的检测按下列流程图进行：
大鼠肝脏组织 质粒的转换与扩增
↓ ↓
总RNA的抽提与鉴定 质粒的抽提与纯化
↓ ↓
制备杂交膜 质粒的酶切与回收
│ ↓
│ 用α-32pdATP标记探针
──────────────
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杂 交
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放射自显影
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结果分析
2 结 果
2.1 正常大鼠肝脏细胞未发现有HSP 70mRNA表达，阳性对照大鼠肝脏细胞中伴有HSP 70mRNA的高水平表达。短时间缺血如15min或30min，只引起肝脏细胞轻微损伤，在缺血及再灌注期间，未见肝脏细胞有HSP 70mRNA的表达。
2.2 肝脏细胞在缺血60min及再灌注2h后发现有HSP 70mRNA的表达，直至再灌注12h后仍见有较高水平HSP 70mRNA的表达，在缺血60min再灌注4h后，肝脏细胞HSP 70mRNA的表达量为最高。
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2.3 120min缺血时间可造成肝脏细胞不可逆损伤，再灌注后肝脏细胞损伤更加严重。120min缺血期间未发现有HSP 70mRNA的表达，再灌注2h后伴有较高水平HSP 70mRNA的表达。高水平HSP 70mRNA表达至少持续4h，再灌注损伤12h后发现表达的HSP 70mRNA完全消失。
3 讨 论
自1982年Currie等首次证实大鼠整体受热能产生HSP以来，人们对高等动物在各种应激条件下HSP生成的研究进一步深入，因为从整体实验中得到的结果更有利于从整体水平认识这一现象的意义。近年来的研究发现大鼠整体受热或缺氧后，肝脏组织伴有活性mRNA的诱导并在体外成功地表达HSP，这就更加促进各种应激状态下对肝组织中HSP及其基因表达规律的研究。HSP70是哺乳类细胞中表达量最多，也是研究最多的HSP，对细胞具有明确的内源性保护作用，人的HSP70基因与果蝇及玉米的同源性分别是73%[2]和68%[3]，因此研究大鼠肝脏缺血—再灌注期间HSP 70mRNA的变化似可反应到临床变化的规律，从而为临床的应用提供相关的理论指导。从本实验结果可以看出，没有再灌注的单纯性肝脏缺血应激刺激并没有诱导HSP 70mRNA的表达，而缺血再灌注2h后发现有HSP 70mRNA的聚集，被认为在再灌注期间血管内增加的超氧阴离子可以激活HSP 基因[4]。实验工作也显示培养的隔离肝细胞及肝细胞瘤细胞在过氧化的培养基中可以诱导HSP基因的合成[5]，另外研究也发现在缺血后再灌注期间SOD(超氧化物歧化酶Superoxide dismutase)的介入可以抑制肝脏细胞中HSP 70mRNA的表达，从而提示再灌注过程中HSP 70mRNA的表达起码一定程度上依赖于氧自由基的生成[6]。
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相当长的缺血时间，对肝脏来讲至少为60min，对于激发HSP 70基因的转入是必要的，这提示除氧自由基以外，有其它因素对肝脏细胞HSP 70mRNA的表达是必要的，在缺血期间推测细胞内损伤或异常及变性蛋白质的出现可能是最终导致HSP基因活动机制改变的另外重要原因[7]。本实验结果也证实上述推测，短时间的缺血，如15min及30min，它只能引起细胞轻微迅速的可逆性损伤，直至血流再重新建立时仍未有HSP 70mRNA的表达，而在缺血60min或120min后，可造成严重的细胞损伤，包括蛋白变性，而在再灌注期间，增加的氧自由基又加重这一破坏过程，最终导致肝脏细胞中HSP 70mRNA的表达。
总之，在缺血—再灌注后肝脏细胞中HSP基因表达的触发是复杂的，并非是单一的因素。上述结果表明，必要的缺血时间所造成肝脏的损伤是HSP基因激活的基础，而再灌注期间氧自由基的释放可能是其增加的原因。
作者简介：吴孟超 钱光相 第二军医大学东方肝胆外科医院
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bassi M, Bernelli ZA. Ultrastructural cytoplasmic change of liver cells after reversible and irreversible ischemia. Exp Mol Pathol， 1964,3:332
2 Hunt C, Morimoto RL. Conserved feature of eukaryotic HSP70 genes revealed by comparison with the nuclectid aequene of human HSP70 gene. Proc Natl Acad Sci USA， 1985, 82:6455
3 Rochester DE, Winer JA, Shan DM. The structure and expression of maize genes encoding the major heat shock protein, HSP70. EMBO J， 1986, 5:451
, http://www.100md.com
4 Courgeon AM. Hydrogen peroxide (H2O2) induces actin and some heat-shock proteins in Drosophila Cells. Eur J Biochem， 1988, 171:163
5 Cajone F, Bernelli Z A. Oxidative stress induces a sube of heat shock proteins in rat hepatocytes and MHlCl cells. Chem Biol Interact, 1988, 65(3):235
6 Schoeniger LO, Andreoni KA. Induction of heat-shock gene expression in postischemic pig liver depends on superoxide generation. Gastroenterology, 1994, 106(1):177
7 Edington BV. Inhibition of heat shock (stress) protein induction by deuterium oxide and glycerol: Additional support for the abnormal protein hypothesis of induction. J Cell Physiol, 1989, 139:219
(收稿：1999-05-10), 百拇医药