白血病抑制因子对体外培养小鼠早期胚胎发育的影响
作者：张炜 周剑萍 张俊慧
单位：上海医科大学妇产科医院，200011
关键词：白血病抑制因子；小鼠早期胚胎；发育；体外培养
现代妇产科进展990104 摘要 目的：研究白血病抑制因子(LIF)对胚胎发育的影响。方法：用小鼠的单细胞胚胎体外培养120h，观察不同浓度的LIF对早期胚胎发育的影响。结果：①0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml浓度的LIF对小鼠早期胚胎的发育和胚泡的形成有促进作用，0.01ng/ml和100ng/ml浓度的LIF对胚胎的发育无明显影响；②LIF对小鼠早期胚胎发育的影响主要发生于桑椹胚和胚泡期，对1～8细胞期胚胎无明显影响。结论：适当浓度的LIF可促进胚胎发育和胚泡形成。
The effects of leukeamia inhibitory factor on the development of mouse early embryos in vitro.
, 百拇医药
Zhang Wei，Zhou Jianping，Zhang Junhui.
Hospital of Obstetrics and Gynecology，Shanghai Medical University，200011
Abstract Objective：To study the effect of LIF on the development of the mouse early embryos in vitro.Methods：The one-cell mouse embryos were cultured with LIF at different concentration for 120 hours.The development stages of embryos were observed each day. Results：LIF improved the development rate of early embryo at the concentration of 0.1，1 and 10ng/ml(P<0.05).The enhanced effects of LIF were significant for morula and blastocyst stage，not for 1～8 cell stage of embryos.Conclusion：LIF may improve the development of early mouse embryos at the appropriate concentration.
, 百拇医药
Key words Leukeamia inhibitory factor；Mouse early embryo，development；In vitro culture
近年，细胞因子对生殖过程的影响日益受到重视，其中，白血病抑制因子(leukeamia inhibitory factor，LIF)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、集落细胞刺激因子(CSF)等与生殖过程关系密切，它们通过卵巢内分泌、卵泡成熟、胚胎发育及胚泡着床等环节参与生殖调节[1]。为进一步研究LIF在生殖过程中的作用，我们研究了LIF在体外培养小鼠早期胚胎发育过程中的作用，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 培养液的配制 对照组培养液：M16培养液(Sigma)中加入10%小牛血清(中科院)、100μg/ml硫酸链霉素(Sigma)、100U/ml青霉素G钠盐(Sigma)。实验组培养液：在对照组培养液的基础上加入不同比例的小鼠重组LIF(Sigma)，使浓度分别为0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml，4℃冰箱保存待用。
, 百拇医药
1.2 动物准备 采用清洁级昆明种小鼠(上海医科大学实验动物中心)，8～12周龄，体重25～30g。腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG，天津实验动物中心)10IU，48h后注射人绒毛膜促性腺激素(hCG，天津实验动物中心)10IU，造成超排卵刺激，注射hCG后，按雌：雄1∶1比例合笼交配，次日晨检查阴道粘液栓，发现阴道粘液栓者为妊娠第1天。
1.3 单细胞受精卵的获取 于上午10时将孕第1天小鼠脱颈处死，在无菌条件下迅速取出卵巢和输卵管，放入含有对照组培养液的培养皿中洗涤，再移入含有对照组培养液的液滴中，在解剖显微镜下，找到膨大的输卵管壶腹部，用针头挑破输卵管管壁，受精卵溢出，用微吸管收集单细胞受精卵。
1.4 胚胎培养和观察 将对照组培养液和含不同浓度LIF的实验组培养液分别加入四孔培养皿(Nunc)中，每孔0.3ml，然后将以上收集的单细胞受精卵用微吸管随机吸入培养皿中，每孔20～30个，放入37℃、5% CO2、95%空气的恒温培养箱中培养120h，每24h用倒置显微镜观察胚胎发育情况，记录2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和胚泡数，计算胚胎发育率。实验共进行6次，收集胚胎691个，分为对照组和实验组共6组。
, 百拇医药
1.5 资料分析 胚胎发育率：达到某一细胞期的胚胎数与总胚胎数之比。胚胎形成率：在培养120h结束时，发育到和超过某期胚胎的数量之和与总胚胎数之比。统计学分析：采用χ2检验。
2 结果
2.1 在不同培养期LIF对胚胎发育率的影响 见表1。由表1可见，0.1ng/ml和10ng/ml浓度的LIF明显地提高了胚泡发育率(P<0.05)，而100ng/ml LIF浓度组从2细胞到胚泡的发育率有所下降，培养中可见部分细胞变性、退化和不规则分裂等现象，但无统计学意义(P>0.05)。
2.2 LIF对胚胎形成率的影响 见表2。
表1 各种浓度LIF在不同培养时间对胚胎发育率的影响(%) 培养时间
(h)
, http://www.100md.com
观察胚胎
期别
对照组
(n=117)
LIF组(ng/ml)
0.01
(n＝102)
0.1
(n=120)
1
(n=116)
10
(n＝115)
, http://www.100md.com
100
(n=121)
24
48
72
96
120
2细胞期
4细胞期
8细胞期
桑椹胚期
胚泡期
85.5
, 百拇医药
82.1
75.2
60.7
54.7
86.3
82.4
74.5
62.7
54.9
86.7
83.5
75.8
74.2
, 百拇医药
71.7
85.3
81.9
79.3
75.0
70.7
84.3
80.0
74.8
71.3
69.9
80.9
, 百拇医药
69.4
65.3
61.4
47.9
vs对照组 *P<0.05表2 培养120h不同浓度LIF对胚胎形成率的影响(%) 胚胎期
对照组
(n=117)
LIF组(ng/ml)
0.01
(n＝102)
0.1
, http://www.100md.com (n=120)
1
(n=116)
10
(n＝115)
100
(n=121)
2细胞期
4细胞期
8细胞期
桑椹胚期
胚泡期
99.1
, http://www.100md.com
90.6
82.9
70.1
54.7
98.2
92.2
85.3
68.6
54.9
97.5
95.0
84.1
79.3
, 百拇医药
71.7
98.3
92.2
83.6
79.3
70.7
97.4
92.2
85.2
80.0
69.9
, 百拇医药 92.5
81.8
73.5
66.1
47.9
vs对照组 *P<0.05
由表2可见，LIF0.01ng/ml组和10ng/ml浓度组的胚泡形成率比对照组明显提高(P<0.05)，但其程度不随浓度的提高而升高；100ng/ml浓度组的各期细胞形成率均有所下降，且在培养过程中发现部分胚胎死亡、变性等，但差异无显著性。
3 讨论
LIF是典型的多功能细胞因子，对细胞生长、增殖、分化等有广泛的作用，其最典型的生物学功能是体外抑制胚胎干细胞的分化，维持胚胎干细胞的细胞增殖和多潜能性。Stewart等[2]的转基因实验发现，LIF基因缺乏的小鼠胚泡不能着床，说明LIF对着床是必要的，但因这种LIF缺陷小鼠产生的胚泡比杂合鼠所产生者小，所以LIF有可能作为胚胎营养因子，促进胚胎发育。在小鼠胚胎2细胞期开始就有LIF表达，到胚泡期LIF水平达高峰[3]。此外，LIF的受体亚基gp130在桑椹胚期及囊胚期亦有表达，所以LIF可能通过胚胎上的LIF受体影响胚胎发育。Fry等[4]对羊的胚泡体外培养证实，加LIF培养48h可使胚胎的培养存活力(viability of culture)提高4倍，而且加LIF培养的胚胎移植入宫腔可提高成功率。最近Dunglison等[5]报道，LIF可提高人类胚胎体外培养的成形率(formation rate)。
, 百拇医药
本研究发现，LIF能提高体外培养小鼠胚泡的形成率，LIF对胚胎发育的影响主要在桑椹胚期和胚泡期，而对8细胞期以前的胚胎发育无明显的影响。本研究还观察了不同浓度LIF对胚胎发育的影响，在LIF浓度为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml时对胚胎发育有明显促进作用，而且在0.1ng/ml到10ng/ml浓度之间，其促进作用不随浓度的增加而提高；在0.01ng/ml浓度时胚胎发育无明显变化；在100ng/ml浓度时，胚胎的发育有所下降，且培养过程中有部分胚胎死亡、退化及变性等现象，但与对照组比，其胚胎发育率差异无显著性。
总之，适当浓度的LIF有利于早期胚胎的发育和胚泡形成。LIF有可能作为IVF时体外培养受精卵的促生长因子，以提高IVF时体外培养胚胎的质量，但这尚有待于对LIF的深入研究。
参考文献
1.张富春，王妮，曹咏清.细胞因子与胚泡着床关系的研究进展.生殖医学杂志 1995；4(2)：116
, 百拇医药
2.Stewart CL，Kaspar P，Brunst LJ.Blastocyst implantation depends on materenal expression of leukaemia inhibitory factor.Nature 1992；395：76
3.孙红，施渭康.白血病抑制因子.细胞生物学 1994；16(2)：49
4.Fry RC，Batt PA，Fairclough RT，et al.Leukemia inhibitory factor improves the viability of cultured ovine embryo.Biol Reprod 1992；46：470
5.Dunglison GF，Barlon DH，Sargent IL.Leukaemia inhibitory factor significantly enhances the blastocyst formation rate of human embryos culture in serum free medium.Hum Reprod 1996；11：191
(收稿日期 1998-07-10), http://www.100md.com
单位：上海医科大学妇产科医院，200011
关键词：白血病抑制因子；小鼠早期胚胎；发育；体外培养
现代妇产科进展990104 摘要 目的：研究白血病抑制因子(LIF)对胚胎发育的影响。方法：用小鼠的单细胞胚胎体外培养120h，观察不同浓度的LIF对早期胚胎发育的影响。结果：①0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml浓度的LIF对小鼠早期胚胎的发育和胚泡的形成有促进作用，0.01ng/ml和100ng/ml浓度的LIF对胚胎的发育无明显影响；②LIF对小鼠早期胚胎发育的影响主要发生于桑椹胚和胚泡期，对1～8细胞期胚胎无明显影响。结论：适当浓度的LIF可促进胚胎发育和胚泡形成。
The effects of leukeamia inhibitory factor on the development of mouse early embryos in vitro.
, 百拇医药
Zhang Wei，Zhou Jianping，Zhang Junhui.
Hospital of Obstetrics and Gynecology，Shanghai Medical University，200011
Abstract Objective：To study the effect of LIF on the development of the mouse early embryos in vitro.Methods：The one-cell mouse embryos were cultured with LIF at different concentration for 120 hours.The development stages of embryos were observed each day. Results：LIF improved the development rate of early embryo at the concentration of 0.1，1 and 10ng/ml(P<0.05).The enhanced effects of LIF were significant for morula and blastocyst stage，not for 1～8 cell stage of embryos.Conclusion：LIF may improve the development of early mouse embryos at the appropriate concentration.
, 百拇医药
Key words Leukeamia inhibitory factor；Mouse early embryo，development；In vitro culture
近年，细胞因子对生殖过程的影响日益受到重视，其中，白血病抑制因子(leukeamia inhibitory factor，LIF)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、集落细胞刺激因子(CSF)等与生殖过程关系密切，它们通过卵巢内分泌、卵泡成熟、胚胎发育及胚泡着床等环节参与生殖调节[1]。为进一步研究LIF在生殖过程中的作用，我们研究了LIF在体外培养小鼠早期胚胎发育过程中的作用，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 培养液的配制 对照组培养液：M16培养液(Sigma)中加入10%小牛血清(中科院)、100μg/ml硫酸链霉素(Sigma)、100U/ml青霉素G钠盐(Sigma)。实验组培养液：在对照组培养液的基础上加入不同比例的小鼠重组LIF(Sigma)，使浓度分别为0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml，4℃冰箱保存待用。
, 百拇医药
1.2 动物准备 采用清洁级昆明种小鼠(上海医科大学实验动物中心)，8～12周龄，体重25～30g。腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG，天津实验动物中心)10IU，48h后注射人绒毛膜促性腺激素(hCG，天津实验动物中心)10IU，造成超排卵刺激，注射hCG后，按雌：雄1∶1比例合笼交配，次日晨检查阴道粘液栓，发现阴道粘液栓者为妊娠第1天。
1.3 单细胞受精卵的获取 于上午10时将孕第1天小鼠脱颈处死，在无菌条件下迅速取出卵巢和输卵管，放入含有对照组培养液的培养皿中洗涤，再移入含有对照组培养液的液滴中，在解剖显微镜下，找到膨大的输卵管壶腹部，用针头挑破输卵管管壁，受精卵溢出，用微吸管收集单细胞受精卵。
1.4 胚胎培养和观察 将对照组培养液和含不同浓度LIF的实验组培养液分别加入四孔培养皿(Nunc)中，每孔0.3ml，然后将以上收集的单细胞受精卵用微吸管随机吸入培养皿中，每孔20～30个，放入37℃、5% CO2、95%空气的恒温培养箱中培养120h，每24h用倒置显微镜观察胚胎发育情况，记录2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和胚泡数，计算胚胎发育率。实验共进行6次，收集胚胎691个，分为对照组和实验组共6组。
, 百拇医药
1.5 资料分析 胚胎发育率：达到某一细胞期的胚胎数与总胚胎数之比。胚胎形成率：在培养120h结束时，发育到和超过某期胚胎的数量之和与总胚胎数之比。统计学分析：采用χ2检验。
2 结果
2.1 在不同培养期LIF对胚胎发育率的影响 见表1。由表1可见，0.1ng/ml和10ng/ml浓度的LIF明显地提高了胚泡发育率(P<0.05)，而100ng/ml LIF浓度组从2细胞到胚泡的发育率有所下降，培养中可见部分细胞变性、退化和不规则分裂等现象，但无统计学意义(P>0.05)。
2.2 LIF对胚胎形成率的影响 见表2。
表1 各种浓度LIF在不同培养时间对胚胎发育率的影响(%) 培养时间
(h)
, http://www.100md.com
观察胚胎
期别
对照组
(n=117)
LIF组(ng/ml)
0.01
(n＝102)
0.1
(n=120)
1
(n=116)
10
(n＝115)
, http://www.100md.com
100
(n=121)
24
48
72
96
120
2细胞期
4细胞期
8细胞期
桑椹胚期
胚泡期
85.5
, 百拇医药
82.1
75.2
60.7
54.7
86.3
82.4
74.5
62.7
54.9
86.7
83.5
75.8
74.2
, 百拇医药
71.7
85.3
81.9
79.3
75.0
70.7
84.3
80.0
74.8
71.3
69.9
80.9
, 百拇医药
69.4
65.3
61.4
47.9
vs对照组 *P<0.05表2 培养120h不同浓度LIF对胚胎形成率的影响(%) 胚胎期
对照组
(n=117)
LIF组(ng/ml)
0.01
(n＝102)
0.1
, http://www.100md.com (n=120)
1
(n=116)
10
(n＝115)
100
(n=121)
2细胞期
4细胞期
8细胞期
桑椹胚期
胚泡期
99.1
, http://www.100md.com
90.6
82.9
70.1
54.7
98.2
92.2
85.3
68.6
54.9
97.5
95.0
84.1
79.3
, 百拇医药
71.7
98.3
92.2
83.6
79.3
70.7
97.4
92.2
85.2
80.0
69.9
, 百拇医药 92.5
81.8
73.5
66.1
47.9
vs对照组 *P<0.05
由表2可见，LIF0.01ng/ml组和10ng/ml浓度组的胚泡形成率比对照组明显提高(P<0.05)，但其程度不随浓度的提高而升高；100ng/ml浓度组的各期细胞形成率均有所下降，且在培养过程中发现部分胚胎死亡、变性等，但差异无显著性。
3 讨论
LIF是典型的多功能细胞因子，对细胞生长、增殖、分化等有广泛的作用，其最典型的生物学功能是体外抑制胚胎干细胞的分化，维持胚胎干细胞的细胞增殖和多潜能性。Stewart等[2]的转基因实验发现，LIF基因缺乏的小鼠胚泡不能着床，说明LIF对着床是必要的，但因这种LIF缺陷小鼠产生的胚泡比杂合鼠所产生者小，所以LIF有可能作为胚胎营养因子，促进胚胎发育。在小鼠胚胎2细胞期开始就有LIF表达，到胚泡期LIF水平达高峰[3]。此外，LIF的受体亚基gp130在桑椹胚期及囊胚期亦有表达，所以LIF可能通过胚胎上的LIF受体影响胚胎发育。Fry等[4]对羊的胚泡体外培养证实，加LIF培养48h可使胚胎的培养存活力(viability of culture)提高4倍，而且加LIF培养的胚胎移植入宫腔可提高成功率。最近Dunglison等[5]报道，LIF可提高人类胚胎体外培养的成形率(formation rate)。
, 百拇医药
本研究发现，LIF能提高体外培养小鼠胚泡的形成率，LIF对胚胎发育的影响主要在桑椹胚期和胚泡期，而对8细胞期以前的胚胎发育无明显的影响。本研究还观察了不同浓度LIF对胚胎发育的影响，在LIF浓度为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml时对胚胎发育有明显促进作用，而且在0.1ng/ml到10ng/ml浓度之间，其促进作用不随浓度的增加而提高；在0.01ng/ml浓度时胚胎发育无明显变化；在100ng/ml浓度时，胚胎的发育有所下降，且培养过程中有部分胚胎死亡、退化及变性等现象，但与对照组比，其胚胎发育率差异无显著性。
总之，适当浓度的LIF有利于早期胚胎的发育和胚泡形成。LIF有可能作为IVF时体外培养受精卵的促生长因子，以提高IVF时体外培养胚胎的质量，但这尚有待于对LIF的深入研究。
参考文献
1.张富春，王妮，曹咏清.细胞因子与胚泡着床关系的研究进展.生殖医学杂志 1995；4(2)：116
, 百拇医药
2.Stewart CL，Kaspar P，Brunst LJ.Blastocyst implantation depends on materenal expression of leukaemia inhibitory factor.Nature 1992；395：76
3.孙红，施渭康.白血病抑制因子.细胞生物学 1994；16(2)：49
4.Fry RC，Batt PA，Fairclough RT，et al.Leukemia inhibitory factor improves the viability of cultured ovine embryo.Biol Reprod 1992；46：470
5.Dunglison GF，Barlon DH，Sargent IL.Leukaemia inhibitory factor significantly enhances the blastocyst formation rate of human embryos culture in serum free medium.Hum Reprod 1996；11：191
(收稿日期 1998-07-10), http://www.100md.com