G-Rg3治疗单疱病毒性角膜炎实验观察
作者：常雅萍 吴雅珍 李平亚 宋玉珍 明月 刘金平 霍德胜
单位：常雅萍 李平亚 宋玉珍 刘金平 霍德胜(基础医学院 吉林 长春130021)；吴雅珍 明月(第二临床学院眼科)
关键词：角膜炎；单纯疱疹病毒；G-Rg3
白求恩医科大学学报000208
〔提 要〕 目的：观察人参皂甙单体G-Rg3治疗病毒性角膜炎的效果。方法：建立家兔单纯疱疹性角膜炎(HSK)模型，裂隙灯下观察病变恢复状况。结果：实验表明G-Rg3可以治疗HSK。结论：G-Rg3有希望成为一种抗HSK感染的新药。
〔中图分类号〕 R-332 〔文献标识码〕 A
, 百拇医药
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0134-03
Experimental observation on the therapy of herpes
simplex virus keratitis with G-Rg3
Chang Yaping Li Pingya Song Yuzhen Liu Jinping,Huo Desheng
(Basic School of Medical Sciences)
Wu Yazhen Ming Yue
(Department ofOphthalmology,The Second Clinical College,NBUMS)
, 百拇医药
〔Abstract〕 Objective:To investigate the therapeutic effect of ginsenosid monomer G-Rs3 on herpes simplex virus keratitis (HSK).Methods:HSK in rabbits was induced and recovery level of HSK was dynamically observed under slit lamp.Results:The results showed that experimental HSK could be cured by G-Rs3.Conclusion:G-Rs3 is a prospective drug in treatment of HSK infection.
〔Key words〕 keratitis;herpes simplex virus;G-Rs3
, 百拇医药
单纯疱疹性角膜炎(HSK)是一种眼科临床常见疾病，又是角膜病中首要致盲因素。本研究采用我们提取的人参皂甙单体G-Rg3，在体外证实具有抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)作用之后，制备HSV-1感染的家兔角膜炎模型。应用不同浓度药物及无环鸟苷对照进行治疗观察，以期开发治疗病毒性角膜炎的有效药物。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 病 毒 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，来自长春生物制品所。
1.1.2 细 胞 传代人羊膜细胞FL株，本室保存。
1.1.3 药 物 G-Rg3眼膏(本校药剂教研室制备)为人参皂甙单体，成分化学结构式已鉴定清楚。眼膏基质由羊毛脂等构成。膏剂外观细腻、均匀、色泽一致、不分层。金属性异物小于50粒/支，药物颗粒小于75 μm，实验选用浓度为1.5%，1%，0.5%(W/V)。0.1%无环鸟苷滴眼剂：湖北潜江市制药厂。
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1.1.4 动 物 大白兔(雄性)，体重2.5±0.5 kg。购自本校动物部。
1.1.5 仪 器 眼科裂隙灯及照像装置。
1.2 方 法
1.2.1 病毒扩增及毒力测定 选用人羊膜细胞扩增病毒，测定病毒毒力：将病毒按1∶10，1∶100，1∶1000，……1∶100 000 000等8个稀释度，加入已长好的细胞单层，每浓度4复孔，同时设细胞对照，72 h后进行CPE测定，采用结晶紫染色法分光光度计下以570 nm波长测定A值，计算TCID50〔1〕。
1.2.2 建立HSK模型 实验前裂隙灯下观察排除眼科异常。采用眼科角膜环钻法，上皮划痕滴入HSV-1(10-3.5TCID50)，每只家兔每只眼200 μl，分两次滴入，间隔2 h，术前采用庆大霉素冲洗。
, 百拇医药
1.2.3 实验分组及用药 共选用25只家兔，例数以每只眼睛为一单位，均为划痕并滴加病毒。分成如下组，Ⅰ组(n=10)：0.5%药物组；Ⅱ组(n=10)：1%药物组；Ⅲ组(n=10)：1.5%药物组；Ⅳ组(n=8)：无环鸟苷组；Ⅴ组(n=6)：药物基质毒性观察组；Ⅵ组(n=6)：自然恢复组。药物点眼治疗，每次滴药膏100 μl，每日3次。无环鸟苷每次2滴，每日3次。
1.2.4 病变观察及记录方法 接种病毒后于第2，4，6，8，10，14天分别与裂隙灯下或手电筒下放大镜观察，记录病变程度。角膜病变程度按占角膜面积划分，0度：正常。1度：病变<25%；2度：病变25%～50%；3度：50%～75%;4度：>75%。每度间以病变密度与深度可记为0.5度。
2 结 果
2.1 疗效观察
6组家兔实施手术后全部接种病毒，2 d后可见病变出现，表现为数枝状、点状、弥散点状，均为上皮病变型。为模型确实可靠，裂隙灯下观察记录后，随机分组，于第4天开始治疗。并于用药后第2，4，6，8，10，14天观察，其中第4，10天为手电筒下观察，用药后第2天变化不明显，故将结果列表如下。见表1，结果表明：治疗前各组模型间病变程度相近，各组之间比较无显著差异(P>0.05)，故给治疗奠定了可信赖的基础。治疗6 d时，药物治疗组已初见疗效，三种浓度药物及无环鸟苷与对照组比较均可见明显疗效(P<0.01)。治疗14 d时已有相当数量的病例恢复或痊愈，三种浓度药物与对照组比较差异显著(P<0.01)，无环鸟苷组与对照组比较亦差异显著(P<0.01)，但从病变恢复程度看三种浓度药物优于无环鸟苷。
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Tab.1 Comparison of pathological changes of corneae before and after treatment Time
Pathological changes of comeae
Ⅰ(n=10)
Ⅱ(n=10)
Ⅲ(n=10)
Ⅳ(n=8)
Ⅴ(n=6)
Ⅵ(n=6)
Pre-treatment
3.1±0.99
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3.2±0.63
3.3±0.67
3.2±0.75
3.25±0.5
3.25±0.5
6 d post-treatment
1.4±0.70*
1.2±0.63*
1.2±0.63*
1.6±0.52*
2.75±0.5
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3.2±0.44
14 d post-treatment
0.35±0.47*
0.1±0.31*
0.1±0.31*
0.67±0.81*
1.75±0.5
2.8±0.41
*P<0.01 group Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ comparied with group Ⅴ
2.2 治愈率比较
, 百拇医药
将治疗第6，8，14天治愈率进行比较，治愈百分率计算结果见表2。结果表明：三种浓度药物第6天治愈率为20%，40%，30%；无环鸟苷组为37.5%。第8天可达40%，60%，60%；无环鸟苷组仍为37.5%。到第14天三种浓度药物治愈率可达60%，90%，80%；而无环鸟苷治愈率仅为50%。Ⅴ，Ⅵ组结果表明，均未见自然完全痊愈，但病变程度有所减轻。
Tab.2 Comparison of healing rates of different concentrations of G-Rg3 Time (t/d)
Healing rates
Ⅰ(n=10)
Ⅱ(n=10)
Ⅲ(n=10)
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Ⅳ(n=8)
Ⅴ(n=6)
Ⅵ(n=6)
Post-treatment
6
20%
40%
30%
37.5%
0
0
8
40%
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60%
60%
37.5%
0
0
14
60%
90%
80%
50%
0
0
3 讨 论 单纯疱疹病毒性角膜炎在临床眼科疾病中很常见〔2〕。文献报道，美国每年大约有40万人受到HSV感染，每年估计有48 000例活动性眼病发作，其中2万例为新发病例〔3〕。我国HSV性角膜炎的发病率亦很高。此病毒可导致角膜混浊，并可由上皮性角膜炎发展成基质性角膜炎及虹膜炎，导致结构损伤和瘢痕形成以至视力丧失。眼科临床目前治疗此类角膜炎选用无环鸟苷为多，且治疗效果一般。筛选中药作为治疗药物，无论从经济方面、毒副作用方面均优于西药。本研究基于前期工作基础，我们已证实了G-Rg3在细胞水平具有抗HSV-1活性，G-Rg3是我们提取的一种中药单体成分，化学结构式已确定。目前抗病毒中药多为复合制剂，难以确定有效成分及其结构，对中药打入国际市场造成了障碍，也不利于从分子水平去研究中药的药理作用。故选用中药单体成分G-Rg3用于病毒性角膜炎的治疗研究，具有重大的科研价值。
, 百拇医药
文献报道，在HSV眼病病史中，所有患者在患基质性角膜炎或虹膜炎之前或同时均患有HSV性上皮性角膜炎。我们所造的模型中，均为上皮性角膜炎，G-Rg3能有效的治愈上皮性角膜炎，可间接预防基质性角膜炎及虹膜炎的发生，减少角膜炎致盲率。该药物浓度在细胞水平对组织培养的细胞无毒性，同时又观察了眼药膏基质成分的毒副作用，Ⅴ组实验表明，药物基质成分对兔眼部无任何毒副作用，为此药的安全使用奠定了基础。
本研究采用G-Rg3治疗HSV-1性角膜炎，取得了较好的疗效，为进一步研究G-Rg3的药理作用以及开发此类药物奠定了实验基础。相信此药的进一步研究会给单疱疹病毒性角膜炎患者带来福音，并带来重大的社会效益与经济效益。
〔作者简介〕 常雅萍(1949-)，女，辽宁省铁岭市人，教授，医学硕士，主要从事中药免疫、分子免疫研究。
〔参考文献〕
〔1〕常雅萍，杨贵贞.秘灵王提取物抗DNA、RNA病毒效应〔J〕.白求恩医科大学学报，1996，22(5)：466～468.
〔2〕刘卫华，王香兰，彭淑玲.无环鸟苷和单克隆抗体治疗实验性单疱疹病毒性角膜炎〔J〕.眼科，1998，7(1)：50～52.
〔3〕姜中蓉译，李子良校.单疱疹病毒性上皮性角膜炎的患者口服无环鸟苷以预防基质性角膜炎或虹膜炎的对照性验证〔J〕.美国医学会眼科杂志中文版，1998，10(2)：74～77.
〔收稿日期〕 1999-06-23, 百拇医药
单位：常雅萍 李平亚 宋玉珍 刘金平 霍德胜(基础医学院 吉林 长春130021)；吴雅珍 明月(第二临床学院眼科)
关键词：角膜炎；单纯疱疹病毒；G-Rg3
白求恩医科大学学报000208
〔提 要〕 目的：观察人参皂甙单体G-Rg3治疗病毒性角膜炎的效果。方法：建立家兔单纯疱疹性角膜炎(HSK)模型，裂隙灯下观察病变恢复状况。结果：实验表明G-Rg3可以治疗HSK。结论：G-Rg3有希望成为一种抗HSK感染的新药。
〔中图分类号〕 R-332 〔文献标识码〕 A
, 百拇医药
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0134-03
Experimental observation on the therapy of herpes
simplex virus keratitis with G-Rg3
Chang Yaping Li Pingya Song Yuzhen Liu Jinping,Huo Desheng
(Basic School of Medical Sciences)
Wu Yazhen Ming Yue
(Department ofOphthalmology,The Second Clinical College,NBUMS)
, 百拇医药
〔Abstract〕 Objective:To investigate the therapeutic effect of ginsenosid monomer G-Rs3 on herpes simplex virus keratitis (HSK).Methods:HSK in rabbits was induced and recovery level of HSK was dynamically observed under slit lamp.Results:The results showed that experimental HSK could be cured by G-Rs3.Conclusion:G-Rs3 is a prospective drug in treatment of HSK infection.
〔Key words〕 keratitis;herpes simplex virus;G-Rs3
, 百拇医药
单纯疱疹性角膜炎(HSK)是一种眼科临床常见疾病，又是角膜病中首要致盲因素。本研究采用我们提取的人参皂甙单体G-Rg3，在体外证实具有抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)作用之后，制备HSV-1感染的家兔角膜炎模型。应用不同浓度药物及无环鸟苷对照进行治疗观察，以期开发治疗病毒性角膜炎的有效药物。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 病 毒 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，来自长春生物制品所。
1.1.2 细 胞 传代人羊膜细胞FL株，本室保存。
1.1.3 药 物 G-Rg3眼膏(本校药剂教研室制备)为人参皂甙单体，成分化学结构式已鉴定清楚。眼膏基质由羊毛脂等构成。膏剂外观细腻、均匀、色泽一致、不分层。金属性异物小于50粒/支，药物颗粒小于75 μm，实验选用浓度为1.5%，1%，0.5%(W/V)。0.1%无环鸟苷滴眼剂：湖北潜江市制药厂。
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1.1.4 动 物 大白兔(雄性)，体重2.5±0.5 kg。购自本校动物部。
1.1.5 仪 器 眼科裂隙灯及照像装置。
1.2 方 法
1.2.1 病毒扩增及毒力测定 选用人羊膜细胞扩增病毒，测定病毒毒力：将病毒按1∶10，1∶100，1∶1000，……1∶100 000 000等8个稀释度，加入已长好的细胞单层，每浓度4复孔，同时设细胞对照，72 h后进行CPE测定，采用结晶紫染色法分光光度计下以570 nm波长测定A值，计算TCID50〔1〕。
1.2.2 建立HSK模型 实验前裂隙灯下观察排除眼科异常。采用眼科角膜环钻法，上皮划痕滴入HSV-1(10-3.5TCID50)，每只家兔每只眼200 μl，分两次滴入，间隔2 h，术前采用庆大霉素冲洗。
, 百拇医药
1.2.3 实验分组及用药 共选用25只家兔，例数以每只眼睛为一单位，均为划痕并滴加病毒。分成如下组，Ⅰ组(n=10)：0.5%药物组；Ⅱ组(n=10)：1%药物组；Ⅲ组(n=10)：1.5%药物组；Ⅳ组(n=8)：无环鸟苷组；Ⅴ组(n=6)：药物基质毒性观察组；Ⅵ组(n=6)：自然恢复组。药物点眼治疗，每次滴药膏100 μl，每日3次。无环鸟苷每次2滴，每日3次。
1.2.4 病变观察及记录方法 接种病毒后于第2，4，6，8，10，14天分别与裂隙灯下或手电筒下放大镜观察，记录病变程度。角膜病变程度按占角膜面积划分，0度：正常。1度：病变<25%；2度：病变25%～50%；3度：50%～75%;4度：>75%。每度间以病变密度与深度可记为0.5度。
2 结 果
2.1 疗效观察
6组家兔实施手术后全部接种病毒，2 d后可见病变出现，表现为数枝状、点状、弥散点状，均为上皮病变型。为模型确实可靠，裂隙灯下观察记录后，随机分组，于第4天开始治疗。并于用药后第2，4，6，8，10，14天观察，其中第4，10天为手电筒下观察，用药后第2天变化不明显，故将结果列表如下。见表1，结果表明：治疗前各组模型间病变程度相近，各组之间比较无显著差异(P>0.05)，故给治疗奠定了可信赖的基础。治疗6 d时，药物治疗组已初见疗效，三种浓度药物及无环鸟苷与对照组比较均可见明显疗效(P<0.01)。治疗14 d时已有相当数量的病例恢复或痊愈，三种浓度药物与对照组比较差异显著(P<0.01)，无环鸟苷组与对照组比较亦差异显著(P<0.01)，但从病变恢复程度看三种浓度药物优于无环鸟苷。
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Tab.1 Comparison of pathological changes of corneae before and after treatment Time
Pathological changes of comeae
Ⅰ(n=10)
Ⅱ(n=10)
Ⅲ(n=10)
Ⅳ(n=8)
Ⅴ(n=6)
Ⅵ(n=6)
Pre-treatment
3.1±0.99
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3.2±0.63
3.3±0.67
3.2±0.75
3.25±0.5
3.25±0.5
6 d post-treatment
1.4±0.70*
1.2±0.63*
1.2±0.63*
1.6±0.52*
2.75±0.5
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3.2±0.44
14 d post-treatment
0.35±0.47*
0.1±0.31*
0.1±0.31*
0.67±0.81*
1.75±0.5
2.8±0.41
*P<0.01 group Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ comparied with group Ⅴ
2.2 治愈率比较
, 百拇医药
将治疗第6，8，14天治愈率进行比较，治愈百分率计算结果见表2。结果表明：三种浓度药物第6天治愈率为20%，40%，30%；无环鸟苷组为37.5%。第8天可达40%，60%，60%；无环鸟苷组仍为37.5%。到第14天三种浓度药物治愈率可达60%，90%，80%；而无环鸟苷治愈率仅为50%。Ⅴ，Ⅵ组结果表明，均未见自然完全痊愈，但病变程度有所减轻。
Tab.2 Comparison of healing rates of different concentrations of G-Rg3 Time (t/d)
Healing rates
Ⅰ(n=10)
Ⅱ(n=10)
Ⅲ(n=10)
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Ⅳ(n=8)
Ⅴ(n=6)
Ⅵ(n=6)
Post-treatment
6
20%
40%
30%
37.5%
0
0
8
40%
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60%
60%
37.5%
0
0
14
60%
90%
80%
50%
0
0
3 讨 论 单纯疱疹病毒性角膜炎在临床眼科疾病中很常见〔2〕。文献报道，美国每年大约有40万人受到HSV感染，每年估计有48 000例活动性眼病发作，其中2万例为新发病例〔3〕。我国HSV性角膜炎的发病率亦很高。此病毒可导致角膜混浊，并可由上皮性角膜炎发展成基质性角膜炎及虹膜炎，导致结构损伤和瘢痕形成以至视力丧失。眼科临床目前治疗此类角膜炎选用无环鸟苷为多，且治疗效果一般。筛选中药作为治疗药物，无论从经济方面、毒副作用方面均优于西药。本研究基于前期工作基础，我们已证实了G-Rg3在细胞水平具有抗HSV-1活性，G-Rg3是我们提取的一种中药单体成分，化学结构式已确定。目前抗病毒中药多为复合制剂，难以确定有效成分及其结构，对中药打入国际市场造成了障碍，也不利于从分子水平去研究中药的药理作用。故选用中药单体成分G-Rg3用于病毒性角膜炎的治疗研究，具有重大的科研价值。
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文献报道，在HSV眼病病史中，所有患者在患基质性角膜炎或虹膜炎之前或同时均患有HSV性上皮性角膜炎。我们所造的模型中，均为上皮性角膜炎，G-Rg3能有效的治愈上皮性角膜炎，可间接预防基质性角膜炎及虹膜炎的发生，减少角膜炎致盲率。该药物浓度在细胞水平对组织培养的细胞无毒性，同时又观察了眼药膏基质成分的毒副作用，Ⅴ组实验表明，药物基质成分对兔眼部无任何毒副作用，为此药的安全使用奠定了基础。
本研究采用G-Rg3治疗HSV-1性角膜炎，取得了较好的疗效，为进一步研究G-Rg3的药理作用以及开发此类药物奠定了实验基础。相信此药的进一步研究会给单疱疹病毒性角膜炎患者带来福音，并带来重大的社会效益与经济效益。
〔作者简介〕 常雅萍(1949-)，女，辽宁省铁岭市人，教授，医学硕士，主要从事中药免疫、分子免疫研究。
〔参考文献〕
〔1〕常雅萍，杨贵贞.秘灵王提取物抗DNA、RNA病毒效应〔J〕.白求恩医科大学学报，1996，22(5)：466～468.
〔2〕刘卫华，王香兰，彭淑玲.无环鸟苷和单克隆抗体治疗实验性单疱疹病毒性角膜炎〔J〕.眼科，1998，7(1)：50～52.
〔3〕姜中蓉译，李子良校.单疱疹病毒性上皮性角膜炎的患者口服无环鸟苷以预防基质性角膜炎或虹膜炎的对照性验证〔J〕.美国医学会眼科杂志中文版，1998，10(2)：74～77.
〔收稿日期〕 1999-06-23, 百拇医药