缺氧耐受形成中脑内一氧化氮合成酶及L-精氨酸的变化
作者：刘宏雁 赵虹 吕国蔚 王维忠
单位：刘宏雁 赵虹 吕国蔚(白求恩医大第三临床学院中心研究室 吉林 长春130031)；王维忠(首都医科大学神经生物学研究室 北京100054)
关键词：缺氧耐受性；L-精氨酸；一氧化氮合成酶
白求恩医科大学学报000203
〔提 要〕 目的：探讨缺氧耐受形成中脑内一氧化氮(NO)减少的机理。方法：采用高压液相AccQ.Tag柱前衍生法测定缺氧耐受形成中小鼠脑内L-精氨酸含量，双波长分光光度法测定缺氧耐受形成中小鼠脑内一氧化氮合成酶(NOS)活性。结果：L-精氨酸：1次缺氧组与正常对照组比有升高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)；2，3，4次缺氧组比1次缺氧组明显下降(P<0.05)；2，3，4次缺氧组比正常对照组有下降的趋势，但无统计学意义(P>0.05)； 1次缺氧组与正常对照组比NOS活性显著升高；4次缺氧组与1次缺氧组比有下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)。结论：脑内L-精氨酸含量减少及NOS活性增加的抑制，导致脑内NO合成减少，促进了缺氧耐受性的形成。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R363.2+2 〔文献标识码〕 A
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0118-03
Changes of nitric oxide synthetase and L-arginine
in generation of hypoxia tolerance
Liu Hongyan Zhao Hong Wang Weizhong
(The Third Clinical College,NBUMS,Changchun,130031,China)
Lu Guowei
, 百拇医药
(Neurobiological Department,Capital University of Medical Science,Beijing 100054,China)
〔Abstract〕 Objective:To study mechanism of nitric oxide (NO) decreasing in generation of hypoxia tolerance.Methods:NOS activity of mouse brain was detected with spectrometer and L-Arginine of mouse brain,with HPLC in generation of hypoxia tolerance.Results:Contents of L-ARG in exposure to hypoxia one time were higher than those in control group (P>0.05) and the contents in exposure to hypoixa 2,3 and 4 time were lower than those in 1 group (P<0.05).And that of exposure to hypoxia 2,3 and 4 times was lower than that in control group (P>0.05).NOS activity of mouse brain tissues in exprosure to hypoxia one time was higher than that in control group (P<0.05).Whole NOS activity in exposure to hypoxia 4 times tended to decrease.Conclusion:These results indicated that decreasing of L-arginine and inhibition of NOS activity increasing could lead to the decrease of NO synthesis in mouse brain and enhance forming of acute hypoxidc tolerance in mice.
, 百拇医药
〔Key words〕 hypoxia;mouse;L-arginine;NOS
在重复缺氧过程中，脑组织一氧化氮(NO)含量减少，提高了小鼠对缺氧的耐受性〔1〕。本实验的目的在于观察NO合成前体L-精氨酸(L-ARG)及NO合成的关键酶一氧化氮合成酶(NOS)活性在缺氧耐受性中的变化，从而探讨缺氧耐受形成中脑内的NO含量减少的机理。
1 材料与方法
1.1 试 剂
AQC(6-氨基喹啉-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯)为美国Waters公司产品。D-正亮氨酸为中国科学院生物技术厂产品。L-ARG为上海丽珠东风技术有限公司产品。NOS试剂盒由北京邦定生物医学公司提供。
1.2 方 法
, 百拇医药
1.2.1 缺氧耐受模型 按急性重复缺氧方法〔2〕。将小鼠置于含有新鲜空气，经过标定的150 ml广口瓶内，以橡皮塞密闭，记时，一旦出现喘呼吸，立即取出，并随即转移到另一相似体积，含有新鲜空气的广口瓶内，密闭，记时。依次类推至4次。
1.2.2 L-ARG测定 选体重为18～22 g昆明小鼠，雌雄不限，随机分为：正常对照组、1次缺氧组、2次缺氧组、3次缺氧组、4次缺氧组，每组10只。采用高压液相AccQ.Tag柱前衍生法测定。以D-正亮氨酸为内标物。色谱条件：色谱柱：C18柱；柱温：37℃；流动相A：140 mmol/L醋酸钠溶液(含17 mmol/L三乙胺，用50%磷酸调pH至4.95)；流动相B：乙腈∶水(3∶2)；洗脱梯度：见表1；流速1.0 ml/min；检测波长Σx：250 nm，Σm：395 nm。
Table Gradient Table Step
, 百拇医药
Ratio changes of A and B
Time
(min)
%A
%B
Flow
(ml/min)
1
0.0
100
0
1.000
2
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0.5
98
2
1.000
3
15.0
93
7
1.000
4
19.0
90
10
, 百拇医药 1.000
5
42.0
80
20
1.000
6
55.0
55
45
1.000
7
56.0
, 百拇医药 0
100
1.000
8
60.0
0
100
1.000
9
61.0
100
0
1.000
, http://www.100md.com 10
65.0
100
0
1.000
1.2.3 NOS测定 选体重为18～22 g昆明小鼠，雌雄不限，随机分为：正常对照组，1次缺氧组、2次缺氧组、3次缺氧组、4次缺氧组，每组16～17只小鼠不等。采用双波长分光光度法测定，具体方法见试剂盒说明书。
1.3 统计学处理
实验数据用SPSS统计软件包处理，数据以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用单因数方差分析检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 急性缺氧小鼠的行为表现
小鼠在各次急性重复缺氧时的行为表现与以前报道相似〔2〕。第1次缺氧过程中小鼠烦躁不安，上下窜动，呼吸浅快，逐渐发绀，最后出现痉挛和喘呼吸。第2次缺氧过程中，小鼠自由活动明显减少，烦躁不安减轻，呼吸变慢，紫绀明显。第3，4次缺氧过程中，小鼠紫绀更加严重，活动更加减少，甚至出现喘呼吸时，也不出现烦躁不安。
Figure A chromatogram of mouse brain amino acid
2.2 L-ARG含量在缺氧耐受中的变化
对照组、1次、2次、3次、4次缺氧组全脑L-ARG的含量分别为347.189±49.354 nmol/g、430.864±41.770 nmol/g、307.304±35.690 nmol/g、296.033±41.211 nmol/g、293.81±51.830 nmol/g。1次缺氧组与正常对照组比有升高的趋势，但无统计学意义；2，3，4次缺氧组比1次缺氧组明显下降(P<0.05)；2，3，4次缺氧组比正常对照组有下降趋势，但无统计学决义。
, 百拇医药
2.3 NOS活性在缺氧预适应中的变化
正常对照组、1次、4次缺氧组NOS活性分别为0.166±0.276 nmol.min-1.g-1、0.902±0.132 nmol.min-1.g-1、0.413±0.218 nmol.min-1.g-1。1次缺氧组与正常对照组比NOS活性显著升高(P<0.05)，4次缺氧组与1次缺氧组比有下降趋势，但无统计学意义。
3 讨 论
L-ARG是NO合成的前体，在NOS作用下，ARG首先水解，再氧化成胍氨酸和NO。NOS是NO生物合成的关键酶。L-ARG为NOS合成NO的唯一底物。许多ARG衍生物具有竞争性抑制NOS活性。
, 百拇医药
在脑缺血缺氧时，由于兴奋性氨基酸(EAA)大量释放，激动N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)、海人藻酸型(KA)/α-氨基-羟甲基恶唑丙酸(AMPA)及亲代谢受体，使细胞内Ca2+增加，后者和钙调蛋白结合，激活神经元NOS使NO生成增加，NO介导了EAA的毒性〔3〕。在原代细胞培养中，NMDA受体介导的神经元死亡可被下列措施阻断：①用药物抑制NOS，②血红蛋白结合游离的NO，③耗竭培养液中的NO前体L-ARG，④预先选择性破坏培养细胞中富含NOS的神经元。体内应用NOS抑制剂也可减轻NMDA或局部脑缺血引起的脑组织坏死，NOS抑制剂能对抗正常动物海马和纹状体内注入NMDA毒性〔4～7〕。
研究表明，外源性和内源性NO过量产生和释放时具有神经毒性，促进了缺血缺氧脑损伤。40 nmol/L的NO真溶液可引起培养的海马细胞死亡；NO释放剂在培养皮层和纹状体及正常动物均引起神经损伤；缺血缺氧时，脑内NO含量增加，NOS抑制剂减少梗塞面积，而L-ARG可反转NOS抑制剂的保护作用〔8～10〕。
, 百拇医药
本研究观察到全脑组织L-ARG含量，1次缺氧组与正常对照组比有升高趋势，但无统计学意义；2，3，4次缺氧组比1次缺氧组明显下降。1次缺氧组与正常对照组比，NOS活性显著升高，4次缺氧组与1次缺氧组比不但不继续升高，反而有回降的趋势，但无统计学意义。结果提示，在重复缺氧过程中，脑内通过L-ARG的减少及NOS活性增加的抑制，减少NO的合成，促进了缺氧耐受的形成。
〔基金项目〕 国家自然科学基金资助项目(39670271)
〔作者简介〕 刘宏雁(1962-)，女，吉林省长春市人，讲师，主要从事缺氧耐受机理研究。
〔参考文献〕
〔1〕刘宏雁，赵 虹，王维忠，等.一氧化氮在缺氧耐受性形成中的作用〔J〕.中国应用生理学杂志，1998，14(2)；147～149.
, http://www.100md.com
〔2〕吕国蔚，史美棠，李 凌，等.急性重复缺氧对小鼠耐受的影响及机制的初步探讨〔J〕.中国病理生理杂志，1992，8(4)：425～429.
〔3〕East SJ,Garthwaite J.NMDA receptor activation in rat hippocampus induces cyclic GMP formation through the L-Arginine-Nitric oxide pathway〔J〕.Neurosci Lett,1991,123:17～19.
〔4〕Buisson A,Margail L,Callebert J,et al.Mechanisms involved in the neuroprotective activity of a nitric oxide synthase inhibitor during focal cerebral ischemia〔J〕.J Neurochem,1993,61:690～696.
, 百拇医药
〔5〕Maiese K,Boniece I,Demeo D,et al.Peptide growth factors protect against ischemia in culture by preventing nitrtic oxide toxicity〔J〕.J Neurosci,1993,13;3034～3040.
〔6〕Vige X,Scatto B,Carreau A,et al.Antagonism by NG-Nitro-L-arginine of glutamate-induced Neurotoxity in cultured neonatal rat cortical Neurons:Prolonged application enhances neuroprotective efficiency〔J〕.Neuroscience,1993,55;893～901.
〔7〕Dawson VL,Dauson TM,Bartley DA,et al.Mechanism of nitric oxide-mediated neurotoxicity in primary brain cultures〔J〕.J Neurosci,1993,13:2651～2661.
, 百拇医药
〔8〕Dawson VL,Kizushi VM,Huang PL,et al.Resistance to neurotoxicity in cortical culture from neuronal nitric oxide synthase-deficient mice〔J〕.J Neurosci,1996,16(8):2479～2487.
〔9〕Buisson A,Morgaill I,Callebert J ,et al.Mechanisms in the neuroprotective activity of nitric oxide synthetase inhibitor during focal cerebra ischemia〔J〕.J Neurochem,1993,61:690～696.
〔10〕Nagafiji T,Matsui T,Koide T,et al.Blockade of nitric oxide formation by N omega-nitrio-L-arginine mitigates ischemic brain edema and subsequent cerebral infarction in rats〔J〕.Neurosci Lett,1992,147:159～162.
〔收稿日期〕 1999-09-15, http://www.100md.com
单位：刘宏雁 赵虹 吕国蔚(白求恩医大第三临床学院中心研究室 吉林 长春130031)；王维忠(首都医科大学神经生物学研究室 北京100054)
关键词：缺氧耐受性；L-精氨酸；一氧化氮合成酶
白求恩医科大学学报000203
〔提 要〕 目的：探讨缺氧耐受形成中脑内一氧化氮(NO)减少的机理。方法：采用高压液相AccQ.Tag柱前衍生法测定缺氧耐受形成中小鼠脑内L-精氨酸含量，双波长分光光度法测定缺氧耐受形成中小鼠脑内一氧化氮合成酶(NOS)活性。结果：L-精氨酸：1次缺氧组与正常对照组比有升高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)；2，3，4次缺氧组比1次缺氧组明显下降(P<0.05)；2，3，4次缺氧组比正常对照组有下降的趋势，但无统计学意义(P>0.05)； 1次缺氧组与正常对照组比NOS活性显著升高；4次缺氧组与1次缺氧组比有下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)。结论：脑内L-精氨酸含量减少及NOS活性增加的抑制，导致脑内NO合成减少，促进了缺氧耐受性的形成。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R363.2+2 〔文献标识码〕 A
〔文章编号〕 0253-3707(2000)02-0118-03
Changes of nitric oxide synthetase and L-arginine
in generation of hypoxia tolerance
Liu Hongyan Zhao Hong Wang Weizhong
(The Third Clinical College,NBUMS,Changchun,130031,China)
Lu Guowei
, 百拇医药
(Neurobiological Department,Capital University of Medical Science,Beijing 100054,China)
〔Abstract〕 Objective:To study mechanism of nitric oxide (NO) decreasing in generation of hypoxia tolerance.Methods:NOS activity of mouse brain was detected with spectrometer and L-Arginine of mouse brain,with HPLC in generation of hypoxia tolerance.Results:Contents of L-ARG in exposure to hypoxia one time were higher than those in control group (P>0.05) and the contents in exposure to hypoixa 2,3 and 4 time were lower than those in 1 group (P<0.05).And that of exposure to hypoxia 2,3 and 4 times was lower than that in control group (P>0.05).NOS activity of mouse brain tissues in exprosure to hypoxia one time was higher than that in control group (P<0.05).Whole NOS activity in exposure to hypoxia 4 times tended to decrease.Conclusion:These results indicated that decreasing of L-arginine and inhibition of NOS activity increasing could lead to the decrease of NO synthesis in mouse brain and enhance forming of acute hypoxidc tolerance in mice.
, 百拇医药
〔Key words〕 hypoxia;mouse;L-arginine;NOS
在重复缺氧过程中，脑组织一氧化氮(NO)含量减少，提高了小鼠对缺氧的耐受性〔1〕。本实验的目的在于观察NO合成前体L-精氨酸(L-ARG)及NO合成的关键酶一氧化氮合成酶(NOS)活性在缺氧耐受性中的变化，从而探讨缺氧耐受形成中脑内的NO含量减少的机理。
1 材料与方法
1.1 试 剂
AQC(6-氨基喹啉-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯)为美国Waters公司产品。D-正亮氨酸为中国科学院生物技术厂产品。L-ARG为上海丽珠东风技术有限公司产品。NOS试剂盒由北京邦定生物医学公司提供。
1.2 方 法
, 百拇医药
1.2.1 缺氧耐受模型 按急性重复缺氧方法〔2〕。将小鼠置于含有新鲜空气，经过标定的150 ml广口瓶内，以橡皮塞密闭，记时，一旦出现喘呼吸，立即取出，并随即转移到另一相似体积，含有新鲜空气的广口瓶内，密闭，记时。依次类推至4次。
1.2.2 L-ARG测定 选体重为18～22 g昆明小鼠，雌雄不限，随机分为：正常对照组、1次缺氧组、2次缺氧组、3次缺氧组、4次缺氧组，每组10只。采用高压液相AccQ.Tag柱前衍生法测定。以D-正亮氨酸为内标物。色谱条件：色谱柱：C18柱；柱温：37℃；流动相A：140 mmol/L醋酸钠溶液(含17 mmol/L三乙胺，用50%磷酸调pH至4.95)；流动相B：乙腈∶水(3∶2)；洗脱梯度：见表1；流速1.0 ml/min；检测波长Σx：250 nm，Σm：395 nm。
Table Gradient Table Step
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Ratio changes of A and B
Time
(min)
%A
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Flow
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1.2.3 NOS测定 选体重为18～22 g昆明小鼠，雌雄不限，随机分为：正常对照组，1次缺氧组、2次缺氧组、3次缺氧组、4次缺氧组，每组16～17只小鼠不等。采用双波长分光光度法测定，具体方法见试剂盒说明书。
1.3 统计学处理
实验数据用SPSS统计软件包处理，数据以均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用单因数方差分析检验。, 百拇医药
2 结 果
2.1 急性缺氧小鼠的行为表现
小鼠在各次急性重复缺氧时的行为表现与以前报道相似〔2〕。第1次缺氧过程中小鼠烦躁不安，上下窜动，呼吸浅快，逐渐发绀，最后出现痉挛和喘呼吸。第2次缺氧过程中，小鼠自由活动明显减少，烦躁不安减轻，呼吸变慢，紫绀明显。第3，4次缺氧过程中，小鼠紫绀更加严重，活动更加减少，甚至出现喘呼吸时，也不出现烦躁不安。
Figure A chromatogram of mouse brain amino acid
2.2 L-ARG含量在缺氧耐受中的变化
对照组、1次、2次、3次、4次缺氧组全脑L-ARG的含量分别为347.189±49.354 nmol/g、430.864±41.770 nmol/g、307.304±35.690 nmol/g、296.033±41.211 nmol/g、293.81±51.830 nmol/g。1次缺氧组与正常对照组比有升高的趋势，但无统计学意义；2，3，4次缺氧组比1次缺氧组明显下降(P<0.05)；2，3，4次缺氧组比正常对照组有下降趋势，但无统计学决义。
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2.3 NOS活性在缺氧预适应中的变化
正常对照组、1次、4次缺氧组NOS活性分别为0.166±0.276 nmol.min-1.g-1、0.902±0.132 nmol.min-1.g-1、0.413±0.218 nmol.min-1.g-1。1次缺氧组与正常对照组比NOS活性显著升高(P<0.05)，4次缺氧组与1次缺氧组比有下降趋势，但无统计学意义。
3 讨 论
L-ARG是NO合成的前体，在NOS作用下，ARG首先水解，再氧化成胍氨酸和NO。NOS是NO生物合成的关键酶。L-ARG为NOS合成NO的唯一底物。许多ARG衍生物具有竞争性抑制NOS活性。
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在脑缺血缺氧时，由于兴奋性氨基酸(EAA)大量释放，激动N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)、海人藻酸型(KA)/α-氨基-羟甲基恶唑丙酸(AMPA)及亲代谢受体，使细胞内Ca2+增加，后者和钙调蛋白结合，激活神经元NOS使NO生成增加，NO介导了EAA的毒性〔3〕。在原代细胞培养中，NMDA受体介导的神经元死亡可被下列措施阻断：①用药物抑制NOS，②血红蛋白结合游离的NO，③耗竭培养液中的NO前体L-ARG，④预先选择性破坏培养细胞中富含NOS的神经元。体内应用NOS抑制剂也可减轻NMDA或局部脑缺血引起的脑组织坏死，NOS抑制剂能对抗正常动物海马和纹状体内注入NMDA毒性〔4～7〕。
研究表明，外源性和内源性NO过量产生和释放时具有神经毒性，促进了缺血缺氧脑损伤。40 nmol/L的NO真溶液可引起培养的海马细胞死亡；NO释放剂在培养皮层和纹状体及正常动物均引起神经损伤；缺血缺氧时，脑内NO含量增加，NOS抑制剂减少梗塞面积，而L-ARG可反转NOS抑制剂的保护作用〔8～10〕。
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本研究观察到全脑组织L-ARG含量，1次缺氧组与正常对照组比有升高趋势，但无统计学意义；2，3，4次缺氧组比1次缺氧组明显下降。1次缺氧组与正常对照组比，NOS活性显著升高，4次缺氧组与1次缺氧组比不但不继续升高，反而有回降的趋势，但无统计学意义。结果提示，在重复缺氧过程中，脑内通过L-ARG的减少及NOS活性增加的抑制，减少NO的合成，促进了缺氧耐受的形成。
〔基金项目〕 国家自然科学基金资助项目(39670271)
〔作者简介〕 刘宏雁(1962-)，女，吉林省长春市人，讲师，主要从事缺氧耐受机理研究。
〔参考文献〕
〔1〕刘宏雁，赵 虹，王维忠，等.一氧化氮在缺氧耐受性形成中的作用〔J〕.中国应用生理学杂志，1998，14(2)；147～149.
, http://www.100md.com
〔2〕吕国蔚，史美棠，李 凌，等.急性重复缺氧对小鼠耐受的影响及机制的初步探讨〔J〕.中国病理生理杂志，1992，8(4)：425～429.
〔3〕East SJ,Garthwaite J.NMDA receptor activation in rat hippocampus induces cyclic GMP formation through the L-Arginine-Nitric oxide pathway〔J〕.Neurosci Lett,1991,123:17～19.
〔4〕Buisson A,Margail L,Callebert J,et al.Mechanisms involved in the neuroprotective activity of a nitric oxide synthase inhibitor during focal cerebral ischemia〔J〕.J Neurochem,1993,61:690～696.
, 百拇医药
〔5〕Maiese K,Boniece I,Demeo D,et al.Peptide growth factors protect against ischemia in culture by preventing nitrtic oxide toxicity〔J〕.J Neurosci,1993,13;3034～3040.
〔6〕Vige X,Scatto B,Carreau A,et al.Antagonism by NG-Nitro-L-arginine of glutamate-induced Neurotoxity in cultured neonatal rat cortical Neurons:Prolonged application enhances neuroprotective efficiency〔J〕.Neuroscience,1993,55;893～901.
〔7〕Dawson VL,Dauson TM,Bartley DA,et al.Mechanism of nitric oxide-mediated neurotoxicity in primary brain cultures〔J〕.J Neurosci,1993,13:2651～2661.
, 百拇医药
〔8〕Dawson VL,Kizushi VM,Huang PL,et al.Resistance to neurotoxicity in cortical culture from neuronal nitric oxide synthase-deficient mice〔J〕.J Neurosci,1996,16(8):2479～2487.
〔9〕Buisson A,Morgaill I,Callebert J ,et al.Mechanisms in the neuroprotective activity of nitric oxide synthetase inhibitor during focal cerebra ischemia〔J〕.J Neurochem,1993,61:690～696.
〔10〕Nagafiji T,Matsui T,Koide T,et al.Blockade of nitric oxide formation by N omega-nitrio-L-arginine mitigates ischemic brain edema and subsequent cerebral infarction in rats〔J〕.Neurosci Lett,1992,147:159～162.
〔收稿日期〕 1999-09-15, http://www.100md.com