酶联免疫印迹法对弓形虫速殖子功能性抗原分析
作者：张 艳 刘宗文 杨柳萍 冯祖梅 史崇敏 张维艳
单位：张艳(河南医科大学药理学教研室 郑州 450052)；刘宗文(郑州郑荣食品有限公司职工医院 郑州 450053)；杨柳萍 冯祖梅 史崇敏(河南医科大学寄生虫学教研室 郑州 450052)；张维艳(信阳钢铁厂医院 信阳 464194)
关键词：聚丙烯酰胺凝胶电泳；免疫印迹；弓形虫；速殖子抗原；免疫血清
河南医科大学学报990225 摘要 目的：研究弓形虫功能性抗原，为开发弓形虫病诊断试剂及疫苗提供理论基础。方法：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹方法，对弓形虫抗原及弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分进行分析。结果：弓形虫速殖子抗原的蛋白组分在SDS-PAGE中用125g/L的分离胶可产生较好的分辨率，分离出30多条区带。免疫印迹分析表明2种抗血清均能特异地识别弓形虫速殖子抗原，共同识别的抗原组分相对分子质量为43000、33000、27000、14000。结论：这些抗原组分是诱导宿主产生对弓形虫感染免疫应答的功能性抗原。
, 百拇医药
中图分类号 R382.5
Analysis of functional tachyzoite antigens of toxoplasma gondii by immunoblot
Zhang Yan1)，Liu Zongwen2),Yang Liuping3),Feng Zumei 3),Shi Congmin3),Zhang Weiyan4)
1)Department of Pharmacology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052 2)Zhengrong Foods Co.Ltd,Zhengzhou 450053 3) Department of Parasitology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052
, 百拇医药
4) Hospital of Xinyang Steelworks,Xinyang 464194
Abstract Aim:To provide theoretical basis for developing the diagnosticum and vaccine through the analysis of tachyzoite antigens of toxoplasma gondii.Methods: Using SDS-PAGE and immunoblot analysed the antigens and tachyzoite antigens of toxoplasma gondii that can react on the antisera of rabbits and human specifically.Results:the SDS-PAGE patterns of antigens of toxoplasma gondii consisted of about 30 polypeptide bands.The better resolution of these antigens was obtained by using 125g/L polyacrylamide gels.The bands of 43000, 33000, 27000 and 14000 were commonly recognized with antisera of human and rabbit Conclusion:The four major bands of proteins were considered to be functional antigens that induced host to respond to toxoplasma gondii,suggesting they may be the can didate antigens for the vaccine research of toxoplasma gondii and diagnosis of Toxoplasmosis.
, 百拇医药
Key words SDS-PAGE;immunoblot;tachyzoite antigen; toxoplasma gondii;antisera
弓形虫病的免疫机制、免疫诊断特异性的提高以及免疫预防等许多理论和实际问题，均与弓形虫的抗原性质有密切关系。近些年随着对弓形虫病的重视，在检测弓形虫抗原方面的研究日益增多，但利用免疫印迹技术分析弓形虫抗原的研究开展较少[1～3]，并且关于弓形虫抗原性质的问题，有许多方面还需进一步探讨。作者利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹方法，分析弓形虫速殖子抗原，着重了解弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 抗原
1.1.1 虫体的收集：将小白鼠于人工感染弓形虫后第3d拉颈处死，体积分数为75%酒精消毒，在无菌条件下经腹腔注入生理盐水混匀，腹部切口吸取腹腔液，收集虫体。
, http://www.100md.com
1.1.2 抗原的制备：将收集含虫体的鼠腹腔液用TBS(pH7.4)洗涤，共3次。加无菌双蒸水置-20℃冰箱反复冻融3次后，超声粉碎，离心15000r/min，5min,取上清液作电泳样品，测蛋白含量后置-20℃冰箱备用。
1.2 血清的制备
1.2.1 兔抗弓形虫血清：用经超声粉碎的弓形虫速殖子混悬液注射于家兔腹腔，隔周1次，共4次，于最后1次免疫的第7d抽心血，Dot-ELISA法测效价为1∶16384，分离血清备用。
1.2.2 弓形虫抗体阳性人血清：取自IHA、IFA、Dot-ELISA3种方法检测弓形虫抗体滴度均在1∶64以上的男女各5人，静脉采血，分离血清备用。
1.2.3 对照血清：取自健康的家兔和弓形虫抗体阴性的正常人，采血方法同上。
, 百拇医药
1.3 SDS-PAGE 采用Laemmli[4]系统，浓缩胶浓度为48g/L，分离胶为125g/L,电流为25mA，泳毕作考马斯亮蓝染色或立即作免疫印迹。
1.4 免疫印迹(Immunoblot)[5～7] 电泳后的凝胶紧贴硝酸纤维素膜(NC膜)上，置4℃、225mA转印4h。转印后的NC膜用30g/LBSA-TBS封闭，分别加1∶50的免疫兔血清及正常兔血清、1∶50的弓形虫抗体阳性人血清及健康人血清，置4℃过夜，次日反复用TBS及0.5g/LTBS-TritonX-100荡洗后，分别加1∶60辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,1∶200酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体，置37℃孵育2h,再反复荡洗后，加入3’-3’二氨基联苯胺底物液，约5～10min显色，经水洗终止反应后观察结果。
2 结果
2.1 弓形虫速殖子虫体蛋白质的SDS-PAGE分析
, 百拇医药
弓形虫速殖子抗原经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色后可显示30多条区带，其中主要区带的相对分子质量为：100000，95000，93000，84000，81000，72000，55000，50000，46000，43000，37000，33000，30000，27000，22000，20000，19000，17000，14000。正常鼠腹腔液区带的相对分子质量为：65000，53000，45000，40000，36000，32000。
2.2 虫体抗原的免疫印迹分析
2.2.1 兔抗弓形虫血清识别弓形虫抗原：实验感染弓形虫家兔的免疫血清酶反应后显色区带14条，主要区带的相对分子质量为95000，84000，55000，46000，43000，37000，33000，30000，24000，27000，14000。该种免疫兔血清与正常鼠腹腔液之间无显色区带出现。
2.2.2 抗弓形虫人血清识别弓形虫抗原：经IHA、IFA及Dot-ELISA确认为弓形虫抗体阳性的人血清识别弓形虫速殖子抗原反应显色区带4条，相对分子质量为43000，33000，27000，14000。抗弓形虫人血清与正常鼠腹腔液之间无显色区带出现。
, 百拇医药
2.2.3 对照反应：正常兔血清及正常人血清与弓形虫抗原及正常鼠腹腔液之间均无显色区带出现。
3 讨论
本实验采用125g/L的分离胶，分离弓形虫虫体蛋白可获得最佳的分辨率。经SDS-PAGE分离弓形虫速殖子抗原，能显示约30条多肽区带，主要区带范围为14000～10 0000之间，与沈继龙等[2]的实验结果一致。
有实验证明感染弓形虫的啮齿动物可产生强的保护性免疫力[8]。作者利用弓形虫速殖子经腹腔注射感染途径免疫家兔制备的免疫血清做免疫印迹分析也证实了上述结论。
在本实验中，用免疫印迹法测得兔的免疫血清中IgG抗体可识别14种弓形虫抗原，人的抗弓形虫血清IgG抗体可识别4种弓形虫抗原而反应较弱。由2种抗血清的免疫印迹结果可见，2种免疫血清中IgG抗体均能识别相对分子质量为43000，33000，27000及14000的抗原组分。说明这些抗原组分是诱导宿主产生对弓形虫感染免疫应答的功能性抗原，并可能成为弓形虫病的诊断性抗原及疫苗研制的候选抗原。
, 百拇医药
综上所述，本研究对弓形虫抗原的免疫学性质作了初步的实验性探讨，为今后进一步研究弓形虫感染的免疫提供了一定的理论基础。目前，虽然有许多种免疫和生化技术用于弓形虫抗原的分离纯化，然而获得理想的抗原仍有很大的困难。在鉴定了特异性抗原的基础上，利用粗抗原或部分纯化的抗原，结合免疫印迹技术，有可能成为弓形虫病免疫诊断、疗效考核、疫苗研制及了解弓形虫与宿主相互关系的手段之一。
参考文献
[1] 于恩庶，黄桂森，严延生，等.弓形虫抗原分型的研究.中国人兽共患病杂志，1989，5(1)：11
[2] 沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原的免疫化学研究.中国人兽共患病杂志，1990，6(4)：14
[3] 曾小军.弓形虫与日本血吸成虫、虫卵蛋白组分的初步分析.中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：47
, 百拇医药
[4] Laemmli UK. Clerge of structural proteins during of the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature,1970,227:680
[5] Towbin HT,Staehelin TH,Gordon JU. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheet procedure and some application. Pro Natl Acad Sei USA,1979,76:4350
[6] Ruppel A,Diestfeld HJ,Rother UR. Immunoblot analysis of Schistosoma mansoni santigens with sera of Schistosomiasis patients diagnostic potential of an adult schistosome polypeptide. Clin Exp Immunol,1985,62:499
, 百拇医药
[7] Lucius R,Rauterberg EW,Diesfeld HJ. Identification of immunogenic protein of clipetlonerma vileae(Filarioidea)by the“Western blotting”technique. Tropenmed parasitol,1983,34:133
[8] Makioka A,Suzwki Y,Kobayashi A. Recognition of tachyzoite and brodyzoite antigens of Toxoplasma gondii by infected hosts. Infect Immun,1991,59(8):2764
(1998-10-05收稿), http://www.100md.com
单位：张艳(河南医科大学药理学教研室 郑州 450052)；刘宗文(郑州郑荣食品有限公司职工医院 郑州 450053)；杨柳萍 冯祖梅 史崇敏(河南医科大学寄生虫学教研室 郑州 450052)；张维艳(信阳钢铁厂医院 信阳 464194)
关键词：聚丙烯酰胺凝胶电泳；免疫印迹；弓形虫；速殖子抗原；免疫血清
河南医科大学学报990225 摘要 目的：研究弓形虫功能性抗原，为开发弓形虫病诊断试剂及疫苗提供理论基础。方法：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹方法，对弓形虫抗原及弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分进行分析。结果：弓形虫速殖子抗原的蛋白组分在SDS-PAGE中用125g/L的分离胶可产生较好的分辨率，分离出30多条区带。免疫印迹分析表明2种抗血清均能特异地识别弓形虫速殖子抗原，共同识别的抗原组分相对分子质量为43000、33000、27000、14000。结论：这些抗原组分是诱导宿主产生对弓形虫感染免疫应答的功能性抗原。
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中图分类号 R382.5
Analysis of functional tachyzoite antigens of toxoplasma gondii by immunoblot
Zhang Yan1)，Liu Zongwen2),Yang Liuping3),Feng Zumei 3),Shi Congmin3),Zhang Weiyan4)
1)Department of Pharmacology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052 2)Zhengrong Foods Co.Ltd,Zhengzhou 450053 3) Department of Parasitology,Henan Medical University,Zhengzhou 450052
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4) Hospital of Xinyang Steelworks,Xinyang 464194
Abstract Aim:To provide theoretical basis for developing the diagnosticum and vaccine through the analysis of tachyzoite antigens of toxoplasma gondii.Methods: Using SDS-PAGE and immunoblot analysed the antigens and tachyzoite antigens of toxoplasma gondii that can react on the antisera of rabbits and human specifically.Results:the SDS-PAGE patterns of antigens of toxoplasma gondii consisted of about 30 polypeptide bands.The better resolution of these antigens was obtained by using 125g/L polyacrylamide gels.The bands of 43000, 33000, 27000 and 14000 were commonly recognized with antisera of human and rabbit Conclusion:The four major bands of proteins were considered to be functional antigens that induced host to respond to toxoplasma gondii,suggesting they may be the can didate antigens for the vaccine research of toxoplasma gondii and diagnosis of Toxoplasmosis.
, 百拇医药
Key words SDS-PAGE;immunoblot;tachyzoite antigen; toxoplasma gondii;antisera
弓形虫病的免疫机制、免疫诊断特异性的提高以及免疫预防等许多理论和实际问题，均与弓形虫的抗原性质有密切关系。近些年随着对弓形虫病的重视，在检测弓形虫抗原方面的研究日益增多，但利用免疫印迹技术分析弓形虫抗原的研究开展较少[1～3]，并且关于弓形虫抗原性质的问题，有许多方面还需进一步探讨。作者利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹方法，分析弓形虫速殖子抗原，着重了解弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 抗原
1.1.1 虫体的收集：将小白鼠于人工感染弓形虫后第3d拉颈处死，体积分数为75%酒精消毒，在无菌条件下经腹腔注入生理盐水混匀，腹部切口吸取腹腔液，收集虫体。
, http://www.100md.com
1.1.2 抗原的制备：将收集含虫体的鼠腹腔液用TBS(pH7.4)洗涤，共3次。加无菌双蒸水置-20℃冰箱反复冻融3次后，超声粉碎，离心15000r/min，5min,取上清液作电泳样品，测蛋白含量后置-20℃冰箱备用。
1.2 血清的制备
1.2.1 兔抗弓形虫血清：用经超声粉碎的弓形虫速殖子混悬液注射于家兔腹腔，隔周1次，共4次，于最后1次免疫的第7d抽心血，Dot-ELISA法测效价为1∶16384，分离血清备用。
1.2.2 弓形虫抗体阳性人血清：取自IHA、IFA、Dot-ELISA3种方法检测弓形虫抗体滴度均在1∶64以上的男女各5人，静脉采血，分离血清备用。
1.2.3 对照血清：取自健康的家兔和弓形虫抗体阴性的正常人，采血方法同上。
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1.3 SDS-PAGE 采用Laemmli[4]系统，浓缩胶浓度为48g/L，分离胶为125g/L,电流为25mA，泳毕作考马斯亮蓝染色或立即作免疫印迹。
1.4 免疫印迹(Immunoblot)[5～7] 电泳后的凝胶紧贴硝酸纤维素膜(NC膜)上，置4℃、225mA转印4h。转印后的NC膜用30g/LBSA-TBS封闭，分别加1∶50的免疫兔血清及正常兔血清、1∶50的弓形虫抗体阳性人血清及健康人血清，置4℃过夜，次日反复用TBS及0.5g/LTBS-TritonX-100荡洗后，分别加1∶60辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,1∶200酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体，置37℃孵育2h,再反复荡洗后，加入3’-3’二氨基联苯胺底物液，约5～10min显色，经水洗终止反应后观察结果。
2 结果
2.1 弓形虫速殖子虫体蛋白质的SDS-PAGE分析
, 百拇医药
弓形虫速殖子抗原经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色后可显示30多条区带，其中主要区带的相对分子质量为：100000，95000，93000，84000，81000，72000，55000，50000，46000，43000，37000，33000，30000，27000，22000，20000，19000，17000，14000。正常鼠腹腔液区带的相对分子质量为：65000，53000，45000，40000，36000，32000。
2.2 虫体抗原的免疫印迹分析
2.2.1 兔抗弓形虫血清识别弓形虫抗原：实验感染弓形虫家兔的免疫血清酶反应后显色区带14条，主要区带的相对分子质量为95000，84000，55000，46000，43000，37000，33000，30000，24000，27000，14000。该种免疫兔血清与正常鼠腹腔液之间无显色区带出现。
2.2.2 抗弓形虫人血清识别弓形虫抗原：经IHA、IFA及Dot-ELISA确认为弓形虫抗体阳性的人血清识别弓形虫速殖子抗原反应显色区带4条，相对分子质量为43000，33000，27000，14000。抗弓形虫人血清与正常鼠腹腔液之间无显色区带出现。
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2.2.3 对照反应：正常兔血清及正常人血清与弓形虫抗原及正常鼠腹腔液之间均无显色区带出现。
3 讨论
本实验采用125g/L的分离胶，分离弓形虫虫体蛋白可获得最佳的分辨率。经SDS-PAGE分离弓形虫速殖子抗原，能显示约30条多肽区带，主要区带范围为14000～10 0000之间，与沈继龙等[2]的实验结果一致。
有实验证明感染弓形虫的啮齿动物可产生强的保护性免疫力[8]。作者利用弓形虫速殖子经腹腔注射感染途径免疫家兔制备的免疫血清做免疫印迹分析也证实了上述结论。
在本实验中，用免疫印迹法测得兔的免疫血清中IgG抗体可识别14种弓形虫抗原，人的抗弓形虫血清IgG抗体可识别4种弓形虫抗原而反应较弱。由2种抗血清的免疫印迹结果可见，2种免疫血清中IgG抗体均能识别相对分子质量为43000，33000，27000及14000的抗原组分。说明这些抗原组分是诱导宿主产生对弓形虫感染免疫应答的功能性抗原，并可能成为弓形虫病的诊断性抗原及疫苗研制的候选抗原。
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综上所述，本研究对弓形虫抗原的免疫学性质作了初步的实验性探讨，为今后进一步研究弓形虫感染的免疫提供了一定的理论基础。目前，虽然有许多种免疫和生化技术用于弓形虫抗原的分离纯化，然而获得理想的抗原仍有很大的困难。在鉴定了特异性抗原的基础上，利用粗抗原或部分纯化的抗原，结合免疫印迹技术，有可能成为弓形虫病免疫诊断、疗效考核、疫苗研制及了解弓形虫与宿主相互关系的手段之一。
参考文献
[1] 于恩庶，黄桂森，严延生，等.弓形虫抗原分型的研究.中国人兽共患病杂志，1989，5(1)：11
[2] 沈继龙，徐秉锟.弓形虫抗原的免疫化学研究.中国人兽共患病杂志，1990，6(4)：14
[3] 曾小军.弓形虫与日本血吸成虫、虫卵蛋白组分的初步分析.中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：47
, 百拇医药
[4] Laemmli UK. Clerge of structural proteins during of the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature,1970,227:680
[5] Towbin HT,Staehelin TH,Gordon JU. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheet procedure and some application. Pro Natl Acad Sei USA,1979,76:4350
[6] Ruppel A,Diestfeld HJ,Rother UR. Immunoblot analysis of Schistosoma mansoni santigens with sera of Schistosomiasis patients diagnostic potential of an adult schistosome polypeptide. Clin Exp Immunol,1985,62:499
, 百拇医药
[7] Lucius R,Rauterberg EW,Diesfeld HJ. Identification of immunogenic protein of clipetlonerma vileae(Filarioidea)by the“Western blotting”technique. Tropenmed parasitol,1983,34:133
[8] Makioka A,Suzwki Y,Kobayashi A. Recognition of tachyzoite and brodyzoite antigens of Toxoplasma gondii by infected hosts. Infect Immun,1991,59(8):2764
(1998-10-05收稿), http://www.100md.com