人脐静脉内皮细胞E-选择素分子克隆
作者：马民慧 汲言山 胡美茹 沈倍奋
单位：马民慧(河南医科大学组织学与胚胎学教研室 郑州 450052)；汲言山 胡美茹 沈倍奋(军事医学科学院基础所分子免疫室 北京 100850)
关键词：人脐静脉内皮细胞；粘附分子，E-选择素；cDNA
河南医科大学学报990221 摘要 目的：为探讨E-选择素结构与功能的关系。方法：采用人脐静脉内皮细胞，经分离培养及激活后，提取总RNA，用M-MLV逆转录酶将其转录成cDNA第一链，设计引物行PCR扩增。结果：其产物经电泳测定为1.9kb的片段，即E-选择素cDNA的全长编码区。先将cDNA连接至PUC-18载体并转化至JM-109中，提取质粒DNA。再将E-选择素酶切为3个片段进行序列测定，显示人脐静脉内皮细胞E-选择素与文献报道略有差异：即53位G→A；655位T→C而导致氨基酸的改变(亮氨酸→脯氨酸)；1914～1916位缺失AGC(丝氨酸)。结论：为进一步研究E-选择素结构与功能的关系，制备探针与单克隆抗体打下基础。
, http://www.100md.com
中图分类号 R339.28
Molecular cloning of E-selectin from human umbilical vein Endothelial cells
Ma Minhui1)，Ji Yanshan2)，Hu Meiru2) ，Shen Beifen2)
1)Department Histology & Embryology of Henan Medical University,Zhengzhou 450052 2)Department Molecular Immunology,Institute of Basic Medicine ,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850
, 百拇医药
Abstract Aim:To study relationship between E-selectin structure and its function.Methods:Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were is olated,cultered and activated.Furthermore,RNA was extracted and reverse-transcripted to the cDNA first chain with M-MLA reverse transcriptase.A pair of primers was designed for the PCR.Results:The amplified product was a 1.9kb segment through the electroporesis determination that was the encode domain cDNA of E-selectin.The cDNA was ligated into the vector PUC-18 and transformed into JM-109.The plasmid DNA was extracted and cut-up into three segments with endonuclease to sequence the DNA.E-selectin cDNA differed slightly from that reported before.Conclusion:This study has established the basis for further studying the structure frunction relationship of E-selectin and preparing the probe and monoclone an tibody.
, 百拇医药
Key words HUVEC;adhesion molecules;E-selectin;cDNA
E-选择素(E-selectin)是由体内激活的微静脉内皮细胞产生的细胞表面糖蛋白。实验证明在体内经炎症因子、细胞因子等的刺激，大血管内皮也可表达。E-selectin是近年来发现的粘附分子选择素家族三成员(L-selectin由白细胞表达；P-selectin由血小板表达；E-selectin由内皮细胞表达)之一，在炎症、损伤、肿瘤转移、器官发生等病理及生理过程中具有重要作用[1]。作者用人脐静脉内皮细胞作为HUVEC细胞来源，体外分离培养后，提取E-selectin总RNA，克隆cDNA。为进一步研究其结构与功能的关系，制备DNA探针与单克隆抗体打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料 HUVEC(取自北京永定路医院产房足月产新生儿脐带)。胶原酶Ⅰ型(SigmaCO130)，IL-V1，TNFα(军科院三所四室)。M199培养基(Sigma)。反转录试剂盒(Promega),DNA合成仪(ADI391A，USA)，PCR扩增仪及紫外分光光度仪。
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1.2 方法
1.2.1 HUVEC的收集、培养和活化[2，3]：将新生儿脐带(6h内，无菌)静脉插管，用脐带Buffer(0.14mol/LNaCl,0.004mol/LKCl，0.001mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4、0.011mol/L葡萄糖)或1×PBS冲洗，体积分数为0.1%胶原酶灌注，37℃10～15min取消化液。PBS洗后离心。将细胞重悬于150g/LFeS-M199中，置涂胶的6孔培养皿中，37℃体积分数为5%CO2条件下培养。48h后，细胞贴壁，生长良好，加入重组TNFα10μg/ml,IL-120U/ml2.5h。继之用体积分数为0.25%胰酶消化，37℃10min,将细胞Buffer或PBS洗后置-70℃存放。
1.2.2 HUVEC总DNA提取：取冻存的内皮细胞(1×106以上)，加D溶液(4mol/L异硫氰酸胍，2.5mmol/L枸橼酸钠，体积分数为0.5%肌醇，2-硫基乙醇)500ml，充分打匀。依次加入100μl2mol/L的NaAc(pH4.0)、500μl水平衡酚、200μl氯仿，混匀后冰浴20min离心，弃上清。体积分数为70%酒精洗，再加160μlD溶液打匀沉淀，加等体积异丙醇，混匀后置-70℃沉淀。弃上清，酒清洗后真空抽干。
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1.2.3 RNA反转录-PCR扩增cDNA:反转录体系(为HUVEC RNA 11μl，5×Buffer 4μl，RNassin 1μl，OLig(dT)151μl,10mol/L dNTP 2μl,m-MLVRTose1μl)混匀后在PCR仪上行反转录。反应时间为37℃5min，42℃5min,42℃55min,70℃10min。
PCR扩增体系为：反转录混合物5μl，10×Buffer10μl，25mol/LMgCl6ml，2.5mol/l dNTP 8μl,20mmol/L上下游引物各4μl，消毒去离子水62.5μl，95℃变性6min后加入TagDNA聚合酶0.5μl，矿物油60μl，反应时间为94℃ 1min,55℃1min,72℃2.5min,35个周期。PCR所用引物为作者自行合成。上游引物：TCATGATTGCTTCACAGTTTCTCTCAGC；下游引物：GGAACTAGAGGGATACACTGAAGTTTAAG。
1.2.4 PCR产物电泳鉴定：10g/L琼脂糖凝胶，1×TBE电泳缓冲液，PCR产物5μl。50mA,70V,电泳1h。
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1.2.5 PCR产物(cDNA片段)电泳回收：将扩增产物电泳(70V)2h。在片段前方切一宽2mm槽，填入透析薄膜，继续电泳(100V)。薄片段走至透析袋后，作反向电泳约55s。然后在紫外灯下回收cDNA片段约500μl。分别加等体积酚、氯仿抽提，在沉淀中加入3molNaCl10μl，2倍无水酒精沉淀。离心后将沉淀真空抽干，融于20μlTE(pH8.0)。
1.2.6 cDNA片段序列测定：将回收的DNA片段连接至PUC18载体，并转化到感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒DNA。选择合适的酶切位点，将DNA切成三个小片段分别进行测序分析[4，5]。
2 结果与讨论
2.1 HUVEC的分离培养及活化
HUVEC在培养约数小时后，开始贴壁生长，细胞由圆形继之伸展成梭形，完全贴壁后呈扁平多边形，核槽圆形位于中央，相邻细胞接触紧密。
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近年来研究发现，内皮细胞参与抗体多种生理生化、病理生理、免疫反应等过程，是一类具有多种功能的细胞。但人内皮细胞的体外培养较动物内皮细胞难度更大，要求条件较高。诸如消化分离时间，培养基的性质，辅助内皮细胞贴壁的生长基质以及促进内皮细胞生长的因子等等，均能影响内皮细胞的存活及功能。若培养12h后，细胞仍为圆形并悬浮，则培养失败。作者的经验为：①在掌握好消化分离时间及酶浓度的基础上，用PBS或生理盐水代替脐带Buffer冲洗，亦同样能获得贴壁生长的脐静脉内皮细胞；②用自制鼠尾胶原代替明胶或Fibronectin,后者价格较昂贵，但内皮细胞生长时必需此类生长基质，以改善细胞的附着和细胞生长表面的性质，利于细胞贴壁生长。本实验表明，用鼠尾胶原代替上述成分，也可取得相同效果。方法为取大鼠尾巴一根，酒精消毒后剪成小段，抽出尾腱并剪碎，浸于体积分数为0.1%醋酸溶液，48h后离心吸取上清液，均匀涂至培养皿中，将其置超净台晾干后使用；③文献报道，人内皮细胞培养时需加入内皮细胞生长因子或肝素，或用人血清(而非小牛血清)。否则细胞难于存活，结果表明，未加这些成分，内皮细胞也可存活并传2～3代，但培养基中FeS浓度需150～200g/L。
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HUVEC存活后，需经某些炎症因子、细胞因子等激活，方能表达和释放E-Selectin。一般在刺激2～4h后达高峰。24h降至基线水平。本实验同时用TNFα和IL-1刺激，2.5h后收集细胞，效果极佳。
2.2 E-Selectin cDNA扩增及功能 PCR扩增后电泳测定，见一大小约1.9kb的片段，与Selectin 1 898bp的3′非翻译区相符[5]。测定结果示该cDNA与国外文献报道略有差异[6，7]，即53位G→A；655位T→C而导致氨基酸的改变(亮氨酸→脯氨酸)，1914～1916位缺失AGC(丝氨酸)。
E-SelectincDNA全长3.85kb，由116bp的5′的非翻译区，1830bp的连续开放阅读框，1898bp的3′的非翻译区组成[6]，结构与功能相关性研究表明其分子中lectin区和EGF区在细胞粘附过程中具有重要作用，许多阻滞粘附的单抗识别抗原决定簇位于此区内[3]。最初发现E-Selectin可促使中性粒细胞与活化的内皮细胞粘附。进而研究证实，它也能结合单核细胞，记忆T细胞亚群，嗜酸及嗜碱性粒细胞、血液树突状淋巴样细胞，前T细胞及成人T细胞、白血病细胞。E-Selectin在炎症、感染、损伤性疾病时增高。肿瘤患者如乳腺癌、卵巢癌、胃肠道癌，Hodgkin′s病和T细胞淋巴瘤等均有增高。它与T细胞白血病易转移至肝、脾、肺等器官密切相关。最新研究发现，Kaposi′s肉瘤细胞可表达E-Selectin等粘附分子，致使白细胞聚集于患病部位。急性疟疾、糖尿病患者、动脉炎、硬皮病和红斑狼疮患者等，血液中可溶性E-Selectin水平也有不同程度的升高。
, 百拇医药
目前对E-Selectin的研究集中于：①明确ECG区在粘附和迁移中的作用，建立一系列针对E-Selectin功能性抗原决定簇和非功能性决定簇的McAb，将有助于此项研究；②在构建E-Selectin三维模型的基础上，将结构与功能研究的重点集中在设计以糖配体为基础的E-Selectinslex结合的抑制剂上，期望此类药物将成为Selectin介导的炎症反应的最有效的抑制剂。因此，克隆E-Selectin cDNA，对于制备单抗及DNA探针，进而用于临床诊断和治疗上述疾病，均具有极为重要的实际意义。
参考文献
[1] 马民慧.E-Selectin结构与功能研究进展.国外医学.输血及血液分册，1995，18(3)：162
[2] Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. J Clinical Investigation,1973,52(11):2745
, http://www.100md.com
[3] Pigott R,Needham LA,Edwards RM,et al. Structural and functional studies of the endothelial activation antigen ELIAM1 using a panel of monoclonal antibodies. J Immunology,1991,147(1):130
[4] 胡美茹，汲言山，马民慧，等.E-SelectincDNA克隆和表达.中国免疫学杂志，1995，11(4)：201
[5] 胡美茹，汲言山，舒翠玲，等.E-选择素cDNA克隆和表达.中国免疫学杂志，1996，12(3)：143
[6] Bevilacqua MP,Stengelin M,Gimbrone MA,et al. ELAM1:an inducible recepter for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectin. Science,1989,243(3):1 160
[7] Hession C,Osborn L,Goff D,et al. ELAM1:Derect expression cloning and functional interaction. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(3):1 673
(1998-08-31收稿), 百拇医药
单位：马民慧(河南医科大学组织学与胚胎学教研室 郑州 450052)；汲言山 胡美茹 沈倍奋(军事医学科学院基础所分子免疫室 北京 100850)
关键词：人脐静脉内皮细胞；粘附分子，E-选择素；cDNA
河南医科大学学报990221 摘要 目的：为探讨E-选择素结构与功能的关系。方法：采用人脐静脉内皮细胞，经分离培养及激活后，提取总RNA，用M-MLV逆转录酶将其转录成cDNA第一链，设计引物行PCR扩增。结果：其产物经电泳测定为1.9kb的片段，即E-选择素cDNA的全长编码区。先将cDNA连接至PUC-18载体并转化至JM-109中，提取质粒DNA。再将E-选择素酶切为3个片段进行序列测定，显示人脐静脉内皮细胞E-选择素与文献报道略有差异：即53位G→A；655位T→C而导致氨基酸的改变(亮氨酸→脯氨酸)；1914～1916位缺失AGC(丝氨酸)。结论：为进一步研究E-选择素结构与功能的关系，制备探针与单克隆抗体打下基础。
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中图分类号 R339.28
Molecular cloning of E-selectin from human umbilical vein Endothelial cells
Ma Minhui1)，Ji Yanshan2)，Hu Meiru2) ，Shen Beifen2)
1)Department Histology & Embryology of Henan Medical University,Zhengzhou 450052 2)Department Molecular Immunology,Institute of Basic Medicine ,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850
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Abstract Aim:To study relationship between E-selectin structure and its function.Methods:Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were is olated,cultered and activated.Furthermore,RNA was extracted and reverse-transcripted to the cDNA first chain with M-MLA reverse transcriptase.A pair of primers was designed for the PCR.Results:The amplified product was a 1.9kb segment through the electroporesis determination that was the encode domain cDNA of E-selectin.The cDNA was ligated into the vector PUC-18 and transformed into JM-109.The plasmid DNA was extracted and cut-up into three segments with endonuclease to sequence the DNA.E-selectin cDNA differed slightly from that reported before.Conclusion:This study has established the basis for further studying the structure frunction relationship of E-selectin and preparing the probe and monoclone an tibody.
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Key words HUVEC;adhesion molecules;E-selectin;cDNA
E-选择素(E-selectin)是由体内激活的微静脉内皮细胞产生的细胞表面糖蛋白。实验证明在体内经炎症因子、细胞因子等的刺激，大血管内皮也可表达。E-selectin是近年来发现的粘附分子选择素家族三成员(L-selectin由白细胞表达；P-selectin由血小板表达；E-selectin由内皮细胞表达)之一，在炎症、损伤、肿瘤转移、器官发生等病理及生理过程中具有重要作用[1]。作者用人脐静脉内皮细胞作为HUVEC细胞来源，体外分离培养后，提取E-selectin总RNA，克隆cDNA。为进一步研究其结构与功能的关系，制备DNA探针与单克隆抗体打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料 HUVEC(取自北京永定路医院产房足月产新生儿脐带)。胶原酶Ⅰ型(SigmaCO130)，IL-V1，TNFα(军科院三所四室)。M199培养基(Sigma)。反转录试剂盒(Promega),DNA合成仪(ADI391A，USA)，PCR扩增仪及紫外分光光度仪。
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1.2 方法
1.2.1 HUVEC的收集、培养和活化[2，3]：将新生儿脐带(6h内，无菌)静脉插管，用脐带Buffer(0.14mol/LNaCl,0.004mol/LKCl，0.001mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4、0.011mol/L葡萄糖)或1×PBS冲洗，体积分数为0.1%胶原酶灌注，37℃10～15min取消化液。PBS洗后离心。将细胞重悬于150g/LFeS-M199中，置涂胶的6孔培养皿中，37℃体积分数为5%CO2条件下培养。48h后，细胞贴壁，生长良好，加入重组TNFα10μg/ml,IL-120U/ml2.5h。继之用体积分数为0.25%胰酶消化，37℃10min,将细胞Buffer或PBS洗后置-70℃存放。
1.2.2 HUVEC总DNA提取：取冻存的内皮细胞(1×106以上)，加D溶液(4mol/L异硫氰酸胍，2.5mmol/L枸橼酸钠，体积分数为0.5%肌醇，2-硫基乙醇)500ml，充分打匀。依次加入100μl2mol/L的NaAc(pH4.0)、500μl水平衡酚、200μl氯仿，混匀后冰浴20min离心，弃上清。体积分数为70%酒精洗，再加160μlD溶液打匀沉淀，加等体积异丙醇，混匀后置-70℃沉淀。弃上清，酒清洗后真空抽干。
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1.2.3 RNA反转录-PCR扩增cDNA:反转录体系(为HUVEC RNA 11μl，5×Buffer 4μl，RNassin 1μl，OLig(dT)151μl,10mol/L dNTP 2μl,m-MLVRTose1μl)混匀后在PCR仪上行反转录。反应时间为37℃5min，42℃5min,42℃55min,70℃10min。
PCR扩增体系为：反转录混合物5μl，10×Buffer10μl，25mol/LMgCl6ml，2.5mol/l dNTP 8μl,20mmol/L上下游引物各4μl，消毒去离子水62.5μl，95℃变性6min后加入TagDNA聚合酶0.5μl，矿物油60μl，反应时间为94℃ 1min,55℃1min,72℃2.5min,35个周期。PCR所用引物为作者自行合成。上游引物：TCATGATTGCTTCACAGTTTCTCTCAGC；下游引物：GGAACTAGAGGGATACACTGAAGTTTAAG。
1.2.4 PCR产物电泳鉴定：10g/L琼脂糖凝胶，1×TBE电泳缓冲液，PCR产物5μl。50mA,70V,电泳1h。
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1.2.5 PCR产物(cDNA片段)电泳回收：将扩增产物电泳(70V)2h。在片段前方切一宽2mm槽，填入透析薄膜，继续电泳(100V)。薄片段走至透析袋后，作反向电泳约55s。然后在紫外灯下回收cDNA片段约500μl。分别加等体积酚、氯仿抽提，在沉淀中加入3molNaCl10μl，2倍无水酒精沉淀。离心后将沉淀真空抽干，融于20μlTE(pH8.0)。
1.2.6 cDNA片段序列测定：将回收的DNA片段连接至PUC18载体，并转化到感受态大肠杆菌JM109中，提取质粒DNA。选择合适的酶切位点，将DNA切成三个小片段分别进行测序分析[4，5]。
2 结果与讨论
2.1 HUVEC的分离培养及活化
HUVEC在培养约数小时后，开始贴壁生长，细胞由圆形继之伸展成梭形，完全贴壁后呈扁平多边形，核槽圆形位于中央，相邻细胞接触紧密。
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近年来研究发现，内皮细胞参与抗体多种生理生化、病理生理、免疫反应等过程，是一类具有多种功能的细胞。但人内皮细胞的体外培养较动物内皮细胞难度更大，要求条件较高。诸如消化分离时间，培养基的性质，辅助内皮细胞贴壁的生长基质以及促进内皮细胞生长的因子等等，均能影响内皮细胞的存活及功能。若培养12h后，细胞仍为圆形并悬浮，则培养失败。作者的经验为：①在掌握好消化分离时间及酶浓度的基础上，用PBS或生理盐水代替脐带Buffer冲洗，亦同样能获得贴壁生长的脐静脉内皮细胞；②用自制鼠尾胶原代替明胶或Fibronectin,后者价格较昂贵，但内皮细胞生长时必需此类生长基质，以改善细胞的附着和细胞生长表面的性质，利于细胞贴壁生长。本实验表明，用鼠尾胶原代替上述成分，也可取得相同效果。方法为取大鼠尾巴一根，酒精消毒后剪成小段，抽出尾腱并剪碎，浸于体积分数为0.1%醋酸溶液，48h后离心吸取上清液，均匀涂至培养皿中，将其置超净台晾干后使用；③文献报道，人内皮细胞培养时需加入内皮细胞生长因子或肝素，或用人血清(而非小牛血清)。否则细胞难于存活，结果表明，未加这些成分，内皮细胞也可存活并传2～3代，但培养基中FeS浓度需150～200g/L。
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HUVEC存活后，需经某些炎症因子、细胞因子等激活，方能表达和释放E-Selectin。一般在刺激2～4h后达高峰。24h降至基线水平。本实验同时用TNFα和IL-1刺激，2.5h后收集细胞，效果极佳。
2.2 E-Selectin cDNA扩增及功能 PCR扩增后电泳测定，见一大小约1.9kb的片段，与Selectin 1 898bp的3′非翻译区相符[5]。测定结果示该cDNA与国外文献报道略有差异[6，7]，即53位G→A；655位T→C而导致氨基酸的改变(亮氨酸→脯氨酸)，1914～1916位缺失AGC(丝氨酸)。
E-SelectincDNA全长3.85kb，由116bp的5′的非翻译区，1830bp的连续开放阅读框，1898bp的3′的非翻译区组成[6]，结构与功能相关性研究表明其分子中lectin区和EGF区在细胞粘附过程中具有重要作用，许多阻滞粘附的单抗识别抗原决定簇位于此区内[3]。最初发现E-Selectin可促使中性粒细胞与活化的内皮细胞粘附。进而研究证实，它也能结合单核细胞，记忆T细胞亚群，嗜酸及嗜碱性粒细胞、血液树突状淋巴样细胞，前T细胞及成人T细胞、白血病细胞。E-Selectin在炎症、感染、损伤性疾病时增高。肿瘤患者如乳腺癌、卵巢癌、胃肠道癌，Hodgkin′s病和T细胞淋巴瘤等均有增高。它与T细胞白血病易转移至肝、脾、肺等器官密切相关。最新研究发现，Kaposi′s肉瘤细胞可表达E-Selectin等粘附分子，致使白细胞聚集于患病部位。急性疟疾、糖尿病患者、动脉炎、硬皮病和红斑狼疮患者等，血液中可溶性E-Selectin水平也有不同程度的升高。
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目前对E-Selectin的研究集中于：①明确ECG区在粘附和迁移中的作用，建立一系列针对E-Selectin功能性抗原决定簇和非功能性决定簇的McAb，将有助于此项研究；②在构建E-Selectin三维模型的基础上，将结构与功能研究的重点集中在设计以糖配体为基础的E-Selectinslex结合的抑制剂上，期望此类药物将成为Selectin介导的炎症反应的最有效的抑制剂。因此，克隆E-Selectin cDNA，对于制备单抗及DNA探针，进而用于临床诊断和治疗上述疾病，均具有极为重要的实际意义。
参考文献
[1] 马民慧.E-Selectin结构与功能研究进展.国外医学.输血及血液分册，1995，18(3)：162
[2] Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. J Clinical Investigation,1973,52(11):2745
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[3] Pigott R,Needham LA,Edwards RM,et al. Structural and functional studies of the endothelial activation antigen ELIAM1 using a panel of monoclonal antibodies. J Immunology,1991,147(1):130
[4] 胡美茹，汲言山，马民慧，等.E-SelectincDNA克隆和表达.中国免疫学杂志，1995，11(4)：201
[5] 胡美茹，汲言山，舒翠玲，等.E-选择素cDNA克隆和表达.中国免疫学杂志，1996，12(3)：143
[6] Bevilacqua MP,Stengelin M,Gimbrone MA,et al. ELAM1:an inducible recepter for neutrophils related to complement regulatory proteins and lectin. Science,1989,243(3):1 160
[7] Hession C,Osborn L,Goff D,et al. ELAM1:Derect expression cloning and functional interaction. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(3):1 673
(1998-08-31收稿), 百拇医药