指状青霉提取物对大肠杆菌infA基因的致突变研究*
作者：杨胜利 赵国强 于国强 韩绍印 丁兰萍 宋爱云 宫亚欧
单位：杨胜利 于国强 韩绍印 丁兰萍 宋爱云 宫亚欧(河南医科大学食管癌研究室 郑州 450052)；赵国强(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)
关键词：真菌；致突变性；序列分析；大肠杆菌infA
河南医科大学学报990219 摘要 目的：为了研究分离获得的引发桔子霉烂的优势真菌指状青霉提取物的致突变作用。方法：将E.colik12菌株作为诱变对象，利用PCR扩增得到infA基因片段，通过T载体克隆并作序列分析。结果：infA基因片段中有5个点突变存在；推导氨基酸序列有一个氨基酸变异(Lys→Val)。结论：指状青霉提取物可引起E.colik12菌株基因突变。
中图分类号 R1.15
, http://www.100md.com
Mutagenicity of extracts from Penicillium digitatum for E.coli infA
Yang Shengli1)， Zhao Guoqiang2) ，Yu Guoqiang1)，Han Sha oyin1)，Ding Lanping1)，Song Aiyun1)，Gong Ya′ou 1)
1)Department of Esophageal Cancer Research,Henan medical University,Zhengzhou 45 0052 2) Department of Microbiology and Immunology,Henan Medical University,Zhen gzhou 450052
, 百拇医药
Abstract Aim:To research mutagenicity of the extracts from preponderant fungi(Penicillium digitatum) in mildewed oranges.Methods：Using E.coli k12 as mutation target,partial infA gene was amplified by PCR,and the overlapping fragments were cloned into pGEM-T vector.Sequences were determined and then analyzed by computer.Results：There were five points mutation in nucleotide of infA gene,suggesting unique amino acid vasiation(Lys→Val).Conclusion：Penicillium digita tum could cause gene mutation and eating of mildewed fruits should be avoided.
, 百拇医药
Key words funger；mutagenicity；sequence analysis；E.coli infA
指状青霉是引起桔子等水果霉烂的优势真菌[1]，有研究显示指状青霉及其代谢产物具有致突变性[2]。为了更深入地了解指状青霉的遗传毒性，作者利用PCR、T载体克隆及序列分析技术，研究指状青霉提取物对大肠杆菌infA基因的影响，以进一步探讨指状青霉提取物的致突变作用。
1 材料与方法
1.1 指状青霉提取物 从霉烂桔子中分离出来的优势真菌指状青霉，用察氏培养基培养，培养物用三氯甲烷淬取、蒸干、称重，每mg相当25g指状青霉菌培养物，二甲亚砜(DMSO)溶解，4℃保存备用。
1.2 测试菌株 E.colik12由河南医科大学微生物学与免疫学教研室提供。
, 百拇医药
1.3 细菌突变测试 参照Ames实验的细菌诱变及培养方法[3]。分设以下6组：Samp-1生理盐水对照组；Samp-2二甲亚砜溶剂对照组；Samp-3指状青霉提取物60μg实验组；Samp-4指状青霉提取物120 μg实验组；Samp-5指状青霉提取物240μg实验组；Samp-6指状青霉提取物480μg实验组。
1.4 引物设计及合成 参照Cummings报道的infA基因序列M63145[4]，利用OLIGO，PRIMERS等分子生物学软件辅助设计infA引物，上游引物P15’ATGCCCACTCCATTGAAGTC3’，下游引物P25’AGGTTCGGCACATTACTCCG3’(802-1311)，引物扩增长度为510bp，由上海生工生物工程公司合成，引物经PAGE纯化。
1.5 诱变后细菌DNA标本制备 取单个菌落溶100μl盐水中，加30μl裂解液55℃水浴30min，细菌DNA提取参照Sambrook方法[5]，用1×TE 10μl溶解，-20℃保存备用。
, 百拇医药
1.6 PCR扩增 10×TaqBuffer3μl,2.5mmol/L4×dNTP2 μl,Taq酶1U(Promega公司)，P1和P2各1μl，模板5μl，去离子水补足30μl体积；使用PE-480型DNA扩增仪进行扩增，扩增程序为：94℃180s；94℃50s；55℃50s；72℃ 60s。三温循环25圈。
1.7 产物分析 将扩增产物10μl加于体积分数为1.5%琼脂糖凝胶上(含EB0.5μg/ml)，以30V/cm的电压电泳40min，紫外分析仪256nm下观察到510bp处有扩增带即为infA基因扩增产物。
1.8 扩增产物的克隆及测序 PCR扩增产物经纯化后，采用Promega公司PCR产物克隆试剂盒，直接与T载体连接，转化入宿主菌XL1-BLUE，挑取白色菌落用PCR鉴定。对阳性菌接种培养，提取质粒，采用Sanger末端终止法，于ABI373自动测序仪进行双链测序。
, 百拇医药 1.9 DNA测序的计算机分析 利用GOLDKEY，DNASIS等软件对6个测出的DNA序列进行分析比较。
2 结果
2.1 靶基因(infA)扩增产物电泳结果 产物经PCR扩增，6个细菌突变测试组的菌株，均得到510bp的靶基因(infA)产物，见图1。
图1 E.colik12infA基因PCR扩增电泳结果
M：相对分子质量标准Marker；A～F：分别为实验组Samp-1～Samp-6的infA基因PCR扩增结果
2.2 infA基因DNA测序结果 Samp-1生理盐水对照组和Samp-2二甲亚砜溶剂对照组未出现变异；指状青霉提取物实验组Samp-3，Samp-4，Samp-5和Samp-6均有变异存在。证实指状青霉提取物能够造成infA基因突变，见图2。
, 百拇医药
图2 实验组的DNA序列与M63145对应部分DNA同源性比较结果
2.3 计算机推导及分析实验组氨基酸序列结果 在6个实验组测出的DNA序列推导出的氨基酸序列中，发现5个碱基位突变，其中4个并未导致相应的氨基酸变异，仅有1个碱基位突变导致相应的氨基酸变异(由Lys变为Val)。见表1和图3。
表1 实验组5个变异点编码氨基酸情况 实验组
第36位
第40位
第67位
第106位
第139位
Samp-1
, http://www.100md.com
AAA-Lys
AAA-Lys
CAG-Gln
AAG-Lys
CGT-Arg
Samp-2
AAA-Lys
AAA-Lys
CAG-Gln
AAG-Lys
CGT-Arg
Samp-3
, 百拇医药
AAG-Lys
AAA-Lys
CAC-Gln
AAG-Lys
CGC-Arg
Samp-4
AAG-Lys
AAG-Lys
CAC-Gln
GAG-Val
CGC-Arg
Samp-5
, http://www.100md.com
AAG-Lys
AAG-Lys
CAC-Gln
GAG-Val
CGC-Arg
Samp-6
AAG-Lys
AAG-Lys
CAC-Gln
GAG-Val
CGC-Arg
按照图3中的氨基酸序列定位
, 百拇医药
图3 Samp-1的DNA序列翻译出氨基酸序列结果
3 讨论
作者采用了现代分子生物学技术，通过待检物作用于细菌，然后对细菌的基因进行核酸序列分析，比较其变化，从而判定待检物是否具有致突变能力。与传统的Ames试验比较，该方法是直接反映出待检物对DNA的致突变作用。由于突变是无方向性的、随机的，因此，从理论上分析，本方法应该比利用细菌回复突变的方法更敏感。本实验在对细菌诱变中，指状青霉提取物的使用量比做Ames试验的用量低2个数量级，结果仍然可以发现有DNA变异的出现。
本试验结果显示，指状青霉提取物可以引起E.colik12菌株infA基因DNA序列5个点突变，其中4个点突变未引起编码氨基酸的变异，提示致突变物导致的基因突变中存在这一现象，即致突变物导致DNA水平上的突变，但由于遗传密码的简并性，在氨基酸水平上可以不显示突变存在。因此，在实际工作中可能存在被检物质致DNA突变作用，而反映到氨基酸水平无改变的被掩盖情况。故作者认为目前使用的某些突变检测试验方法可能存在致突变性漏检的现象。要判定被检物对DNA致突变能力或对DNA损伤作用的最有说服力的实验是DNA序列分析。
, 百拇医药
本实验研究直接在DNA水平再次证实了指状青霉提取物具有致突变作用，由此应引起广大消费者和有关部门的高度重视，以避免误食指状青霉污染的水果及其深加工产品给本人甚至后代的身体健康带来严重危害。
*河南省卫生科研基金资助项目 91036
参考文献
[1] Kenneth BR. A manual of the penicillia. Baltimore:Williams and Wilkins Co,1949,386
[2] 杨胜利，宋爱云，韩绍印，等.霉烂水果优势真菌提取物致突变性研究.河南医科大学学报，1995，30(1)：10
[3] 黄幸纡.细菌回复突变试验.见：黄幸纡，陈星若主编.环境化学物致突变致畸致癌方法.杭州：浙江科学出版社出版，1985.56
, 百拇医药
[4] Cummings HS,Sands JF,Foreman PC，et al. Structure and expression of the infA operon encoding translational initiation factor IF1. Transcriptional control by growth rate. J Biol Chem,1991,266(25):16491
[5] Sambrook J,Fristsch EF,Maniatis T. DNA extractive. In：Sambrook J,Fristsch EF,Maniatis T. Molecular Cloning. 9th eds. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.49
(1999-01-12收稿), 百拇医药
单位：杨胜利 于国强 韩绍印 丁兰萍 宋爱云 宫亚欧(河南医科大学食管癌研究室 郑州 450052)；赵国强(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)
关键词：真菌；致突变性；序列分析；大肠杆菌infA
河南医科大学学报990219 摘要 目的：为了研究分离获得的引发桔子霉烂的优势真菌指状青霉提取物的致突变作用。方法：将E.colik12菌株作为诱变对象，利用PCR扩增得到infA基因片段，通过T载体克隆并作序列分析。结果：infA基因片段中有5个点突变存在；推导氨基酸序列有一个氨基酸变异(Lys→Val)。结论：指状青霉提取物可引起E.colik12菌株基因突变。
中图分类号 R1.15
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Mutagenicity of extracts from Penicillium digitatum for E.coli infA
Yang Shengli1)， Zhao Guoqiang2) ，Yu Guoqiang1)，Han Sha oyin1)，Ding Lanping1)，Song Aiyun1)，Gong Ya′ou 1)
1)Department of Esophageal Cancer Research,Henan medical University,Zhengzhou 45 0052 2) Department of Microbiology and Immunology,Henan Medical University,Zhen gzhou 450052
, 百拇医药
Abstract Aim:To research mutagenicity of the extracts from preponderant fungi(Penicillium digitatum) in mildewed oranges.Methods：Using E.coli k12 as mutation target,partial infA gene was amplified by PCR,and the overlapping fragments were cloned into pGEM-T vector.Sequences were determined and then analyzed by computer.Results：There were five points mutation in nucleotide of infA gene,suggesting unique amino acid vasiation(Lys→Val).Conclusion：Penicillium digita tum could cause gene mutation and eating of mildewed fruits should be avoided.
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Key words funger；mutagenicity；sequence analysis；E.coli infA
指状青霉是引起桔子等水果霉烂的优势真菌[1]，有研究显示指状青霉及其代谢产物具有致突变性[2]。为了更深入地了解指状青霉的遗传毒性，作者利用PCR、T载体克隆及序列分析技术，研究指状青霉提取物对大肠杆菌infA基因的影响，以进一步探讨指状青霉提取物的致突变作用。
1 材料与方法
1.1 指状青霉提取物 从霉烂桔子中分离出来的优势真菌指状青霉，用察氏培养基培养，培养物用三氯甲烷淬取、蒸干、称重，每mg相当25g指状青霉菌培养物，二甲亚砜(DMSO)溶解，4℃保存备用。
1.2 测试菌株 E.colik12由河南医科大学微生物学与免疫学教研室提供。
, 百拇医药
1.3 细菌突变测试 参照Ames实验的细菌诱变及培养方法[3]。分设以下6组：Samp-1生理盐水对照组；Samp-2二甲亚砜溶剂对照组；Samp-3指状青霉提取物60μg实验组；Samp-4指状青霉提取物120 μg实验组；Samp-5指状青霉提取物240μg实验组；Samp-6指状青霉提取物480μg实验组。
1.4 引物设计及合成 参照Cummings报道的infA基因序列M63145[4]，利用OLIGO，PRIMERS等分子生物学软件辅助设计infA引物，上游引物P15’ATGCCCACTCCATTGAAGTC3’，下游引物P25’AGGTTCGGCACATTACTCCG3’(802-1311)，引物扩增长度为510bp，由上海生工生物工程公司合成，引物经PAGE纯化。
1.5 诱变后细菌DNA标本制备 取单个菌落溶100μl盐水中，加30μl裂解液55℃水浴30min，细菌DNA提取参照Sambrook方法[5]，用1×TE 10μl溶解，-20℃保存备用。
, 百拇医药
1.6 PCR扩增 10×TaqBuffer3μl,2.5mmol/L4×dNTP2 μl,Taq酶1U(Promega公司)，P1和P2各1μl，模板5μl，去离子水补足30μl体积；使用PE-480型DNA扩增仪进行扩增，扩增程序为：94℃180s；94℃50s；55℃50s；72℃ 60s。三温循环25圈。
1.7 产物分析 将扩增产物10μl加于体积分数为1.5%琼脂糖凝胶上(含EB0.5μg/ml)，以30V/cm的电压电泳40min，紫外分析仪256nm下观察到510bp处有扩增带即为infA基因扩增产物。
1.8 扩增产物的克隆及测序 PCR扩增产物经纯化后，采用Promega公司PCR产物克隆试剂盒，直接与T载体连接，转化入宿主菌XL1-BLUE，挑取白色菌落用PCR鉴定。对阳性菌接种培养，提取质粒，采用Sanger末端终止法，于ABI373自动测序仪进行双链测序。
, 百拇医药 1.9 DNA测序的计算机分析 利用GOLDKEY，DNASIS等软件对6个测出的DNA序列进行分析比较。
2 结果
2.1 靶基因(infA)扩增产物电泳结果 产物经PCR扩增，6个细菌突变测试组的菌株，均得到510bp的靶基因(infA)产物，见图1。
图1 E.colik12infA基因PCR扩增电泳结果
M：相对分子质量标准Marker；A～F：分别为实验组Samp-1～Samp-6的infA基因PCR扩增结果
2.2 infA基因DNA测序结果 Samp-1生理盐水对照组和Samp-2二甲亚砜溶剂对照组未出现变异；指状青霉提取物实验组Samp-3，Samp-4，Samp-5和Samp-6均有变异存在。证实指状青霉提取物能够造成infA基因突变，见图2。
, 百拇医药
图2 实验组的DNA序列与M63145对应部分DNA同源性比较结果
2.3 计算机推导及分析实验组氨基酸序列结果 在6个实验组测出的DNA序列推导出的氨基酸序列中，发现5个碱基位突变，其中4个并未导致相应的氨基酸变异，仅有1个碱基位突变导致相应的氨基酸变异(由Lys变为Val)。见表1和图3。
表1 实验组5个变异点编码氨基酸情况 实验组
第36位
第40位
第67位
第106位
第139位
Samp-1
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AAA-Lys
AAA-Lys
CAG-Gln
AAG-Lys
CGT-Arg
Samp-2
AAA-Lys
AAA-Lys
CAG-Gln
AAG-Lys
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AAG-Lys
AAA-Lys
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AAG-Lys
CGC-Arg
Samp-4
AAG-Lys
AAG-Lys
CAC-Gln
GAG-Val
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Samp-5
, http://www.100md.com
AAG-Lys
AAG-Lys
CAC-Gln
GAG-Val
CGC-Arg
Samp-6
AAG-Lys
AAG-Lys
CAC-Gln
GAG-Val
CGC-Arg
按照图3中的氨基酸序列定位
, 百拇医药
图3 Samp-1的DNA序列翻译出氨基酸序列结果
3 讨论
作者采用了现代分子生物学技术，通过待检物作用于细菌，然后对细菌的基因进行核酸序列分析，比较其变化，从而判定待检物是否具有致突变能力。与传统的Ames试验比较，该方法是直接反映出待检物对DNA的致突变作用。由于突变是无方向性的、随机的，因此，从理论上分析，本方法应该比利用细菌回复突变的方法更敏感。本实验在对细菌诱变中，指状青霉提取物的使用量比做Ames试验的用量低2个数量级，结果仍然可以发现有DNA变异的出现。
本试验结果显示，指状青霉提取物可以引起E.colik12菌株infA基因DNA序列5个点突变，其中4个点突变未引起编码氨基酸的变异，提示致突变物导致的基因突变中存在这一现象，即致突变物导致DNA水平上的突变，但由于遗传密码的简并性，在氨基酸水平上可以不显示突变存在。因此，在实际工作中可能存在被检物质致DNA突变作用，而反映到氨基酸水平无改变的被掩盖情况。故作者认为目前使用的某些突变检测试验方法可能存在致突变性漏检的现象。要判定被检物对DNA致突变能力或对DNA损伤作用的最有说服力的实验是DNA序列分析。
, 百拇医药
本实验研究直接在DNA水平再次证实了指状青霉提取物具有致突变作用，由此应引起广大消费者和有关部门的高度重视，以避免误食指状青霉污染的水果及其深加工产品给本人甚至后代的身体健康带来严重危害。
*河南省卫生科研基金资助项目 91036
参考文献
[1] Kenneth BR. A manual of the penicillia. Baltimore:Williams and Wilkins Co,1949,386
[2] 杨胜利，宋爱云，韩绍印，等.霉烂水果优势真菌提取物致突变性研究.河南医科大学学报，1995，30(1)：10
[3] 黄幸纡.细菌回复突变试验.见：黄幸纡，陈星若主编.环境化学物致突变致畸致癌方法.杭州：浙江科学出版社出版，1985.56
, 百拇医药
[4] Cummings HS,Sands JF,Foreman PC，et al. Structure and expression of the infA operon encoding translational initiation factor IF1. Transcriptional control by growth rate. J Biol Chem,1991,266(25):16491
[5] Sambrook J,Fristsch EF,Maniatis T. DNA extractive. In：Sambrook J,Fristsch EF,Maniatis T. Molecular Cloning. 9th eds. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.49
(1999-01-12收稿), 百拇医药