微生物法和高效液相色谱法测定注射用阿奇霉素含量的比较
作者：刘葆林
单位：安徽省药品检验所，合肥 230061
关键词：叠氮红霉素；微生物敏感性试验；色谱法；高压液相
安徽医科大学学报报000526
摘要 目的 注射用阿奇霉素尚无部颁标准，比较高效液相色谱(HPLC)法和微生物法测定阿奇霉素含量有无差异及哪一种方法更适于作质量标准。方法 采用微生物效价测定法，以短小芽胞杆菌为检定菌[CMCC(B)-63202]，抗生素浓度范围为5～10 kU.L-1；同时采用HPLC法，以pH4.0的0.07 mol.L-1磷酸二氢钾-乙腈(2∶1)为流动相，检测波长为210 nm，柱温50℃，对注射用阿奇霉素进行含量测定。结果 将上述两法测得的结果进行统计学分析，发现两种方法差异无显著性，而HPLC法测定较为简便。结论 建议测定阿奇霉素含量的质量标准采用HPLC法。
, 百拇医药
中图分类号 R978.15; R446.1; R927.2 文献标识码 A
文章编号 1000-1492(2000)05-0387-02
阿奇霉素临床用药量近年来呈上升趋势。美国药典已收载该品种，其含量测定项下使用的是高效液相色谱(HPLC)法，但是其采用的设备在我国药检部门尚未普及〔1〕。所以我们采用普通的C18柱，pH 4.0的流动相，用HPLC法同时参照卫生部药品标准WS-034(X-002)-97用经典的微生物效价测定法对3批注射用阿奇霉素进行含量测定〔2〕。发现两种方法间差异无显著性。根据中国药典的精神，HPLC法因其具有高效、精确、快速的优点有逐步取代微生物效价法之趋势，因而建议采用HPLC法作为阿奇霉素含量测定的质量标准。
1 微生物法
, 百拇医药 1.1 材料和试验条件
1.1.1 菌种 短小芽胞杆菌[CMCC(B)-63202](Bacillus pumius)。
1.1.2 培养基及培养条件 培养基：抗生素检定培养基Ⅰ(pH 7.8～8.0);缓冲液：灭菌磷酸盐缓冲液(pH 7.8);培养温度时间：35～37℃，14～16 h;抗生素浓度范围：5～10 kU.L-1〔3〕。
1.1.3 仪器 微生物效价测量仪。
1.1.4 试药 淮南六药厂提供注射用阿奇霉素，批号980818、980820、980822。
1.2 方法
1.2.1 线性范围 取阿奇霉素对照品适量，1 mg相当于952 U，加乙醇(10 mg加4 ml)振摇使溶解，加灭菌水制成约为106 U.L-1的溶液作为贮备液，取其适量用缓冲液稀释分别制成5、7、9、10、12、14、16、19、20 kU.L-1的溶液，点样，培养，测得抑菌圈直径。以各浓度的对数为纵坐标，以抑菌圈直径为横坐标作图，得其回归方程为(^)/(Y)＝13.39X+4.18，r＝0.999 6。表明阿奇霉素在5～20 kU.L-1间有良好的线性关系〔4〕。
, 百拇医药
1.2.2 回收率试验 取阿奇霉素对照品适量，加乙醇适量溶解后，加灭菌水制成约106 U.L-1的贮备液。取贮备液适量加入已准确测定含量(约为5×105 U.L-1)的样品溶液(4、5、6 ml)中，混匀，加缓冲液稀释至5～10 kU.L-1。点样，测得对照品回收率为99.52%，RSD＝1.17%，n=3。
1.2.3 精密度试验 取同一批样品，按样品的含量测定项下方法测定其含量，共6次，结果RSD＝0.8%。
1.2.4 样品的含量测定 取本品5瓶，取其内容物混匀。精密称取适量(约相当于阿奇霉素0.25 g)，加灭菌水制成每毫升约含阿奇霉素103 U的溶液。另取阿奇霉素对照品，加乙醇(每10 mg加4 ml)溶解后同法制成10 kU.L-1和5 kU.L-1的对照品溶液，按二剂量法测定，可信限率均不大于7%。
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2 HPLC法
2.1 材料和试验条件
2.1.1 仪器 岛津LC-6A液相色谱仪。
2.1.2 条件 C18柱，流动相0.07 mol.L-1 KH2PO4-CH3CN(2∶1)， pH 4.0，流速1.6×10-3 L.min-1,柱温50℃〔5〕。
2.1.3 试药 同微生物法。
2.2 方法
2.2.1 线性范围 精密称取阿奇霉素对照品适量，加乙腈(100 mg加5 ml)溶解，加流动相稀释至2 000 mg.L-1左右的溶液作为贮备液，分别取此贮备液适量加流动相制成600、800、1 000、1 200、1 500、1 700、1 900 mg.L-1的一系列溶液。脱气，进样，测峰面积。以各浓度的对数为纵坐标，以峰面积为横坐标作图，得回归方程
=28.49X+75.40，r=0.999 6，n=7，说明阿奇霉素在600～1 900 mg.L-1间有良好的线性关系。
, 百拇医药
2.2.2 回收率试验 取上述2 000 mg.L-1的贮备液4、5、6 ml分别加入已准确测定含量(1 000 mg.L-1)的样品溶液4、5、6 ml中混匀稀释至25 ml，脱气，滤过，进样。测得对照品的平均回收率为99.01%，RSD=0.81%，n=3。
2.2.3 精密度试验 取同一批样品，按样品的含量测定项下方法测定其含量，共6次，结果RSD=1.1%。
2.2.4 样品的含量测定 精密称取微生物法的含量测定项下的混匀内容物适量(约相当于阿奇霉素40 mg)，加乙腈(100 mg加5 ml)溶解后，加流动相至50 ml，摇匀，脱气，滤过，取滤液进样。测定峰面积。同法测定对照品峰面积(免滤过)。计算。
3 结果与讨论
, 百拇医药 3.1 3个批号样品分别做4份平行，结果见表1。
据两个标本差异显著性方差检验(F检验)〔6〕：
∴两法差异不显著
同法求得F2=1.47，F3=1.27
均3.3；0.05
所以，可以得出结论,微生物效价法和HPLC法对注射用阿奇霉素的含量测定差异无显著性。
表1 注射用阿奇霉素含量(单位：mg)
批号
, 百拇医药
微生物法含量
高压液相法含量
980818
250-4.9
250-0.6
250-2.1
250-5.5
250+0.7
250+4.6
250-1.1
250-3.1
980820
, 百拇医药
250-1.1
250+1.1
250-3.9
250-0.6
250-5.3
250-3.8
250+0.1
250-0.6
980822
250-2.5
250+3.0
250+3.2
, 百拇医药
250-2.5
250-4.4
250-1.5
250-3.3
250-4.0
3.2 微生物效价测定法是部颁阿奇霉素标准WS-034(X-022)-97所采用的方法,该法较直接地反映了阿奇霉素对细菌的作用。本法缺点是费时，操作较HPLC法繁杂。
3.3 HPLC法具有高效、准确、快速的特点。所以建议采用HPLC法作为阿奇霉素的含量测定的质量标准和鉴别项的质量标准之一。
Comparison of microbial assay and HPLC in detecting azithromycin
, 百拇医药
Liu Baolin
(Anhui Institute for Drug Control, Hefei 230061)
Abstract Objective To compare microbial assay and HPLC in detecting azithromycin for injection to find which is more suitable for the quality standard. Methods In microbial method, bacillus pumius [CMCCB(B)-63202] as detecting bacteria, antibiotic concentration was between 5～10 kU.L-1. In HPLC C18 column and pH 4.0 was used， and 0.07 mol.L-1 monobasic potassium phosphate-acetonitrile as mobil phase, with uv wavelength at 210 nm. Results No significant difference was found in the results measured between two methods through F-test, while HPLC is considered to be simpler and quicker. Conclusion It is suggested that HPLC serves as a standard method to detect the contents of azithromycin.
, http://www.100md.com
MeSH azithromycin; microbial sensitivity tests; chromatography, high pressure ligquid
作者简介：刘葆林，男，28岁，主管药师
参考文献
1 卫生部药品质量标准. WS-034(X-022)-97
2 中国药典. 1995, 二部: 附录70
3 张治锬. 抗生素药品检验. 北京:人民卫生出版社， 1987:17，34
4 关倩明. HPLC法测定阿齐霉素的含量. 药物分析杂志，1998；18(5):300～302
5 USP. XXⅢ. 1995:152
1999-12-28收稿
2000-06-13修回, http://www.100md.com
单位：安徽省药品检验所，合肥 230061
关键词：叠氮红霉素；微生物敏感性试验；色谱法；高压液相
安徽医科大学学报报000526
摘要 目的 注射用阿奇霉素尚无部颁标准，比较高效液相色谱(HPLC)法和微生物法测定阿奇霉素含量有无差异及哪一种方法更适于作质量标准。方法 采用微生物效价测定法，以短小芽胞杆菌为检定菌[CMCC(B)-63202]，抗生素浓度范围为5～10 kU.L-1；同时采用HPLC法，以pH4.0的0.07 mol.L-1磷酸二氢钾-乙腈(2∶1)为流动相，检测波长为210 nm，柱温50℃，对注射用阿奇霉素进行含量测定。结果 将上述两法测得的结果进行统计学分析，发现两种方法差异无显著性，而HPLC法测定较为简便。结论 建议测定阿奇霉素含量的质量标准采用HPLC法。
, 百拇医药
中图分类号 R978.15; R446.1; R927.2 文献标识码 A
文章编号 1000-1492(2000)05-0387-02
阿奇霉素临床用药量近年来呈上升趋势。美国药典已收载该品种，其含量测定项下使用的是高效液相色谱(HPLC)法，但是其采用的设备在我国药检部门尚未普及〔1〕。所以我们采用普通的C18柱，pH 4.0的流动相，用HPLC法同时参照卫生部药品标准WS-034(X-002)-97用经典的微生物效价测定法对3批注射用阿奇霉素进行含量测定〔2〕。发现两种方法间差异无显著性。根据中国药典的精神，HPLC法因其具有高效、精确、快速的优点有逐步取代微生物效价法之趋势，因而建议采用HPLC法作为阿奇霉素含量测定的质量标准。
1 微生物法
, 百拇医药 1.1 材料和试验条件
1.1.1 菌种 短小芽胞杆菌[CMCC(B)-63202](Bacillus pumius)。
1.1.2 培养基及培养条件 培养基：抗生素检定培养基Ⅰ(pH 7.8～8.0);缓冲液：灭菌磷酸盐缓冲液(pH 7.8);培养温度时间：35～37℃，14～16 h;抗生素浓度范围：5～10 kU.L-1〔3〕。
1.1.3 仪器 微生物效价测量仪。
1.1.4 试药 淮南六药厂提供注射用阿奇霉素，批号980818、980820、980822。
1.2 方法
1.2.1 线性范围 取阿奇霉素对照品适量，1 mg相当于952 U，加乙醇(10 mg加4 ml)振摇使溶解，加灭菌水制成约为106 U.L-1的溶液作为贮备液，取其适量用缓冲液稀释分别制成5、7、9、10、12、14、16、19、20 kU.L-1的溶液，点样，培养，测得抑菌圈直径。以各浓度的对数为纵坐标，以抑菌圈直径为横坐标作图，得其回归方程为(^)/(Y)＝13.39X+4.18，r＝0.999 6。表明阿奇霉素在5～20 kU.L-1间有良好的线性关系〔4〕。
, 百拇医药
1.2.2 回收率试验 取阿奇霉素对照品适量，加乙醇适量溶解后，加灭菌水制成约106 U.L-1的贮备液。取贮备液适量加入已准确测定含量(约为5×105 U.L-1)的样品溶液(4、5、6 ml)中，混匀，加缓冲液稀释至5～10 kU.L-1。点样，测得对照品回收率为99.52%，RSD＝1.17%，n=3。
1.2.3 精密度试验 取同一批样品，按样品的含量测定项下方法测定其含量，共6次，结果RSD＝0.8%。
1.2.4 样品的含量测定 取本品5瓶，取其内容物混匀。精密称取适量(约相当于阿奇霉素0.25 g)，加灭菌水制成每毫升约含阿奇霉素103 U的溶液。另取阿奇霉素对照品，加乙醇(每10 mg加4 ml)溶解后同法制成10 kU.L-1和5 kU.L-1的对照品溶液，按二剂量法测定，可信限率均不大于7%。
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2 HPLC法
2.1 材料和试验条件
2.1.1 仪器 岛津LC-6A液相色谱仪。
2.1.2 条件 C18柱，流动相0.07 mol.L-1 KH2PO4-CH3CN(2∶1)， pH 4.0，流速1.6×10-3 L.min-1,柱温50℃〔5〕。
2.1.3 试药 同微生物法。
2.2 方法
2.2.1 线性范围 精密称取阿奇霉素对照品适量，加乙腈(100 mg加5 ml)溶解，加流动相稀释至2 000 mg.L-1左右的溶液作为贮备液，分别取此贮备液适量加流动相制成600、800、1 000、1 200、1 500、1 700、1 900 mg.L-1的一系列溶液。脱气，进样，测峰面积。以各浓度的对数为纵坐标，以峰面积为横坐标作图，得回归方程
=28.49X+75.40，r=0.999 6，n=7，说明阿奇霉素在600～1 900 mg.L-1间有良好的线性关系。, 百拇医药
2.2.2 回收率试验 取上述2 000 mg.L-1的贮备液4、5、6 ml分别加入已准确测定含量(1 000 mg.L-1)的样品溶液4、5、6 ml中混匀稀释至25 ml，脱气，滤过，进样。测得对照品的平均回收率为99.01%，RSD=0.81%，n=3。
2.2.3 精密度试验 取同一批样品，按样品的含量测定项下方法测定其含量，共6次，结果RSD=1.1%。
2.2.4 样品的含量测定 精密称取微生物法的含量测定项下的混匀内容物适量(约相当于阿奇霉素40 mg)，加乙腈(100 mg加5 ml)溶解后，加流动相至50 ml，摇匀，脱气，滤过，取滤液进样。测定峰面积。同法测定对照品峰面积(免滤过)。计算。
3 结果与讨论
, 百拇医药 3.1 3个批号样品分别做4份平行，结果见表1。
据两个标本差异显著性方差检验(F检验)〔6〕：
∴两法差异不显著
同法求得F2=1.47，F3=1.27
均
所以，可以得出结论,微生物效价法和HPLC法对注射用阿奇霉素的含量测定差异无显著性。
表1 注射用阿奇霉素含量(单位：mg)
批号
, 百拇医药
微生物法含量
高压液相法含量
980818
250-4.9
250-0.6
250-2.1
250-5.5
250+0.7
250+4.6
250-1.1
250-3.1
980820
, 百拇医药
250-1.1
250+1.1
250-3.9
250-0.6
250-5.3
250-3.8
250+0.1
250-0.6
980822
250-2.5
250+3.0
250+3.2
, 百拇医药
250-2.5
250-4.4
250-1.5
250-3.3
250-4.0
3.2 微生物效价测定法是部颁阿奇霉素标准WS-034(X-022)-97所采用的方法,该法较直接地反映了阿奇霉素对细菌的作用。本法缺点是费时，操作较HPLC法繁杂。
3.3 HPLC法具有高效、准确、快速的特点。所以建议采用HPLC法作为阿奇霉素的含量测定的质量标准和鉴别项的质量标准之一。
Comparison of microbial assay and HPLC in detecting azithromycin
, 百拇医药
Liu Baolin
(Anhui Institute for Drug Control, Hefei 230061)
Abstract Objective To compare microbial assay and HPLC in detecting azithromycin for injection to find which is more suitable for the quality standard. Methods In microbial method, bacillus pumius [CMCCB(B)-63202] as detecting bacteria, antibiotic concentration was between 5～10 kU.L-1. In HPLC C18 column and pH 4.0 was used， and 0.07 mol.L-1 monobasic potassium phosphate-acetonitrile as mobil phase, with uv wavelength at 210 nm. Results No significant difference was found in the results measured between two methods through F-test, while HPLC is considered to be simpler and quicker. Conclusion It is suggested that HPLC serves as a standard method to detect the contents of azithromycin.
, http://www.100md.com
MeSH azithromycin; microbial sensitivity tests; chromatography, high pressure ligquid
作者简介：刘葆林，男，28岁，主管药师
参考文献
1 卫生部药品质量标准. WS-034(X-022)-97
2 中国药典. 1995, 二部: 附录70
3 张治锬. 抗生素药品检验. 北京:人民卫生出版社， 1987:17，34
4 关倩明. HPLC法测定阿齐霉素的含量. 药物分析杂志，1998；18(5):300～302
5 USP. XXⅢ. 1995:152
1999-12-28收稿
2000-06-13修回, http://www.100md.com