RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA
作者：袁中玉 王明丽 李京培 陈贵海
单位：袁中玉 王明丽 李京培(安徽医科大学袁中玉 王明丽1微生物教研室，合肥 230032)；陈贵海(第一附属医院神经内科，合肥 230022)
关键词：内皮缩血管肽-1；分析；大脑皮质；聚合酶链反应；小鼠；近交Balb/c
安徽医科大学学报报000525 摘要 目的 建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素-1(ET-1)mRNA的方法。方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法并对实验条件进行优化。建立稳定的检测体系后，对胎鼠大脑皮质ET-1 mRNA进行检测，并以RT-PCR后产物的OD值来反映起初ET-1 mRNA的模板相对含量。结果 在一定Taq DNA酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下，ET-1 mRNA经RT-PCR扩增后产物的OD值与ET-1 mRNA模板量成正比。结论 优化条件后的RT-PCR是检测ET-1 mRNA的一种敏感、简便、特异、可靠的方法。
, 百拇医药
中图分类号 R349.21 文献标识码 A
文章编号 1000-1492(2000)05-0384-03
内皮素-1(Endlthelin-1, ET-1)是1988年由日本学者从猪主动脉上皮细胞中分离提取的一种生物活性肽，是目前所知作用最强的血管收缩剂〔1〕。随后的研究表明〔2〕，在中枢神经系统(CNS)普遍有ET-1存在，而且3/4 ET-1分布在神经细胞内。ET-1作为局部神经肽及神经调节剂对中枢神经系统功能的影响，尤其它在脑损伤后具有刺激胶质细胞增生和迁移、促进受损神经元复性等方面的重要作用而备受关注〔3〕。为进一步研究ET-1作用机制，有必要建立一种敏感、简便的ET-1 mRNA测定方法。据此，我们采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法对先天性感染HCMV胎鼠大脑皮质进行了检测。现将结果报道如下。
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 实验动物 取健康纯系Balb/c小鼠，♀16只，♂16只，均约10周龄，体重约30 g。通过腹腔内注射HCMV AD169株病毒悬液，建立类似人类先天性HCMV感染的动物模型。待雌鼠孕龄为19天时，剖腹取出胎鼠双侧大脑皮质进行RT-PCR。
1.2 主要化学和分子生物学试剂 所用的主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司(SABC)。ET-1及人血β-珠蛋白引物设计参见文献〔1，4〕，由中科院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室合成。
1.3 总RNA的分离 按SABC提供的RT-PCR RNA一步样品处理试剂盒进行。具体过程：将100 mg组织放在研磨器(DEPC处理过)中研成匀浆, 加200 μl变性液和50 μl氯仿∶异戊醇(24∶1),充分混匀后,离心(4℃,14 000 r.min-1)5 min, 将上清转移至另一个新的离心管中, 加入等体积异丙醇,颠倒混匀，离心(4℃,14 000 r.min-1) 10 min, 小心倒去液体，将沉淀用75%乙醇洗一次, 离心(4℃,14 000 r.min-1) 5 min, 弃去上清,自然干燥沉淀，得到的RNA沉淀用TE(pH 8.0)20 μl重悬。该方法提取的产物经国产UV-754紫外分光光度计反复测定3次，其OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。
, 百拇医药
1.4 逆转录 根据SABC提供的RT-PCR酶混合物试剂盒配制以下反应混合物: RT-PCR酶混合物2 μl，20×buffer(无Mg2+)1.5 μl，上、下游引物各0.3 mmol.L-1，25 mmol.L-1 MgCl2 2 μl，10 mmol.L-1 dNTPs 2 μl，模板 10 μl，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积30 μl，铺上液体石蜡30 μl，稍混匀离心后，37℃反转录60 min，得到的cDNA直接进行下一步PCR扩增。
1.5 PCR 基本方法参考文献〔4〕。我们在对影响PCR结果较大的Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶浓度等因素进行优化后，以人血β-珠蛋白DNA为靶基因进行了参比对照实验。在建立稳定的检测体系后，准备以下主混合物：反转录产物15 μl，10×buffer(含15 mmol.L-1 Mg2+) 5.0 μl，上、下游引物各0.3 mmol.L-1，人血β-珠蛋白上、下游引物各0.3 mmol.L-1,人血β-珠蛋白DNA模板 10 μl，Taq DNA聚合酶2 U，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积50 μl，最后加入液体石蜡50 μl，稍混匀稍离心后，置PCR仪中，94℃预变性5 min，然后循环35个周期(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s) 后，在72℃延伸7 min。取10 μl PCR产物，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳45 min。在紫外灯光下观察、拍照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 RT-PCR条件的优化
2.1.1 Taq DNA聚合酶浓度对PCR结果的影响 在一定的反应体系中，随着Taq DNA聚合酶浓度在一定范围的增加，特异性扩增产物也相应增加，但若再增加酶的浓度，特异性扩增产物并不随之增加，反而出现明显的非特异性扩增。我们选择最佳浓度为4×104 U.L-1反应体系。
2.1.2 Mg2+浓度对PCR结果的影响 在一定的反应体系中，Mg2+浓度过低，特异性扩增产物少且出现引物二聚体，Mg2+浓度过高，特异性扩增产物反而减少。最适Mg2+浓度在1.5～2.0 mmol.L-1之间。
, 百拇医药
2.1.3 引物浓度对PCR结果的影响 引物浓度过低，特异性扩增产物较少，而太高的引物又会产生明显的引物二聚体。我们所建立的反应体系中，引物的最适浓度在0.2～0.3 mmol.L-1。
2.2 RT-PCR结果 在建立稳定的PCR检测体系后，取不同量的模板进行扩增。对于PCR产物来说，由于所有的条件均是同等的，因此它们的DNA浓度(OD260×稀释倍数×50/1 000)〔5〕在一定程度上反映原组织中ET-1 mRNA的量，我们测定的结果(表1)可见，随着模板量的增加，其RT-PCR产物的量也相应增加。
表1 不同ET-1 mRNA模板量扩增结果(g.L-1)
模板量(ml)
n
±s
, 百拇医药
F值
P值
0.0
10
0.00
20.038 5
0.000 1
1.0
10
0.027±0.004
5.0
10
0.084±0.007
, 百拇医药
10.0
10
0.183±0.016
3 讨论
mRNA的测定是分子生物学研究中一个常用的方法，主要有Northern Blot、原位杂交、RNA酶保护分析、RT-PCR等几种方法。但由于mRNA含量较少，且在转膜等操作时极易降解，因此对只含有极少量特异mRNA的组织和样品测定较困难；RNA酶保护分析虽然灵敏、准确，但操作复杂，价格昂贵；含内参物的RT-PCR则有简便、快速、灵敏、能定性兼定量之优点，所以它常常被用于这方面的研究。
将mRNA反转录成cDNA可采用的引物有3种，即反向引物、随机引物(hexamer)和Oligo dT。随机引物是4种核苷酸的随机排列组合六聚体，从理论上讲是比较好的，但实际应用时反转率并不高；Oligo dT可与绝大多数真核mRNA的Poly(A)尾配对，转录率较高，但由于Poly(A) RNA只占总RNA群体的1%～4%，此时得到的cDNA在数量上比前者要小；反向引物是一段与目标RNA互补的寡核苷酸序列，它是最特异的引发方法。
, http://www.100md.com
特异性、有效性和忠实性是反映PCR扩增效率的3个指标〔5〕，它们是相互矛盾的统一体，因而在建立PCR反应时，就应根据自己实验的具体情况权衡利弊，优化反应条件。本研究是对细胞的均一群体某个特定序列进行分析，因而PCR的产量和特异性更为重要。为此，我们以人血β-珠蛋白为模板，对引物浓度、Tag DNA聚合酶浓度和Mg2+浓度这些对PCR结果影响较为重要者进行优化，结果可见三者均有一合适的作用浓度范围。我们采用Tag DNA聚合酶浓度4×104 U.L-1、Mg2+浓度在1.5～2.0 mmol.L-1、引物浓度在0.2～0.3 mmol.L-1等条件下，系统能稳定扩增ET-1 mRNA，且最终的产物量与模板量密切相关。
本实验是直接对ET-1 mRNA进行相对定量，在建立稳定的检测体系后，PCR产物的OD值可以反映原标本中的模板相应量。此法简单、稳定，无须特殊的设备。以空白对照调零来测定OD值，排除了系统误差，使结果相对准确。
, 百拇医药
RT-PCR for analysis of endothelin-1 mRNA in fetal mouse cortex
Yuan Zhongyu, Wang Mingli, Li Jingpei et al
(Dept of Microbiology, Anhui Medical Univeristy, Hefei 230032)
Abstract Objective To establish a method to determine the pathogenic roles of endothelin-1(ET-1) mRNA in fetal mouse cortex following congenital human cytomegalovirus(HCMV) infection. Methods After the conditions used in reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) were optimized, ET-1 mRNA at gene transcripition level was analysed. ET-1 mRNA quantity was determined by the OD value of PCR product. Results Under the concentration of Taq DNA polymerase, the OD value of RT-PCR product was correlated with the amount of ET-1 mRNA templet. Conclusion RT-PCR is very sensitive, simple, specific and credible in determining ET-1 mRNA.
, http://www.100md.com
MeSH endlthelin-1/analysis; cerebral cortex; polymerase chain reaction; mice, inbred Balb/c
基金项目:安徽省自然科学基金资助课题(编号:95-医-18)
作者简介：袁中玉，男，34岁，硕士；王明丽，女，45岁，教授，硕士生导师
参考文献
1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988;332(6 163):411～415
2 Giaid A, Gibson SJ, Ibrahim NBN et al.Eendothelin-1, an endothelium-derived peptide, is expressed in neurons of the human spinal cord and dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86(8):7 634～7 638
, 百拇医药
3 Maccumber MW, Ross CA, Snydeer SH. Endothelin in brain:recepter, mitogenesis and biosynthesis in glial cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990;87(9):2 359～2 363
4 迪芬巴赫 CW，德维克斯勒GS. PCR技术实验指南. 第1版，北京：科学出版社， 1998:71(49)：207～208
5 奥斯伯F，布冷伦特R，金斯顿RE 等.精编分子生物学实验指南. 第1版，北京：科学出版社， 1998:31
6 Diviacco S, Norio P, Zentilin L et al.A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates.Gene,1992;122(2):313～320
2000-06-28收稿
2000-08-21修回, http://www.100md.com
单位：袁中玉 王明丽 李京培(安徽医科大学袁中玉 王明丽1微生物教研室，合肥 230032)；陈贵海(第一附属医院神经内科，合肥 230022)
关键词：内皮缩血管肽-1；分析；大脑皮质；聚合酶链反应；小鼠；近交Balb/c
安徽医科大学学报报000525 摘要 目的 建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素-1(ET-1)mRNA的方法。方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法并对实验条件进行优化。建立稳定的检测体系后，对胎鼠大脑皮质ET-1 mRNA进行检测，并以RT-PCR后产物的OD值来反映起初ET-1 mRNA的模板相对含量。结果 在一定Taq DNA酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下，ET-1 mRNA经RT-PCR扩增后产物的OD值与ET-1 mRNA模板量成正比。结论 优化条件后的RT-PCR是检测ET-1 mRNA的一种敏感、简便、特异、可靠的方法。
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中图分类号 R349.21 文献标识码 A
文章编号 1000-1492(2000)05-0384-03
内皮素-1(Endlthelin-1, ET-1)是1988年由日本学者从猪主动脉上皮细胞中分离提取的一种生物活性肽，是目前所知作用最强的血管收缩剂〔1〕。随后的研究表明〔2〕，在中枢神经系统(CNS)普遍有ET-1存在，而且3/4 ET-1分布在神经细胞内。ET-1作为局部神经肽及神经调节剂对中枢神经系统功能的影响，尤其它在脑损伤后具有刺激胶质细胞增生和迁移、促进受损神经元复性等方面的重要作用而备受关注〔3〕。为进一步研究ET-1作用机制，有必要建立一种敏感、简便的ET-1 mRNA测定方法。据此，我们采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法对先天性感染HCMV胎鼠大脑皮质进行了检测。现将结果报道如下。
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 实验动物 取健康纯系Balb/c小鼠，♀16只，♂16只，均约10周龄，体重约30 g。通过腹腔内注射HCMV AD169株病毒悬液，建立类似人类先天性HCMV感染的动物模型。待雌鼠孕龄为19天时，剖腹取出胎鼠双侧大脑皮质进行RT-PCR。
1.2 主要化学和分子生物学试剂 所用的主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司(SABC)。ET-1及人血β-珠蛋白引物设计参见文献〔1，4〕，由中科院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室合成。
1.3 总RNA的分离 按SABC提供的RT-PCR RNA一步样品处理试剂盒进行。具体过程：将100 mg组织放在研磨器(DEPC处理过)中研成匀浆, 加200 μl变性液和50 μl氯仿∶异戊醇(24∶1),充分混匀后,离心(4℃,14 000 r.min-1)5 min, 将上清转移至另一个新的离心管中, 加入等体积异丙醇,颠倒混匀，离心(4℃,14 000 r.min-1) 10 min, 小心倒去液体，将沉淀用75%乙醇洗一次, 离心(4℃,14 000 r.min-1) 5 min, 弃去上清,自然干燥沉淀，得到的RNA沉淀用TE(pH 8.0)20 μl重悬。该方法提取的产物经国产UV-754紫外分光光度计反复测定3次，其OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。
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1.4 逆转录 根据SABC提供的RT-PCR酶混合物试剂盒配制以下反应混合物: RT-PCR酶混合物2 μl，20×buffer(无Mg2+)1.5 μl，上、下游引物各0.3 mmol.L-1，25 mmol.L-1 MgCl2 2 μl，10 mmol.L-1 dNTPs 2 μl，模板 10 μl，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积30 μl，铺上液体石蜡30 μl，稍混匀离心后，37℃反转录60 min，得到的cDNA直接进行下一步PCR扩增。
1.5 PCR 基本方法参考文献〔4〕。我们在对影响PCR结果较大的Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶浓度等因素进行优化后，以人血β-珠蛋白DNA为靶基因进行了参比对照实验。在建立稳定的检测体系后，准备以下主混合物：反转录产物15 μl，10×buffer(含15 mmol.L-1 Mg2+) 5.0 μl，上、下游引物各0.3 mmol.L-1，人血β-珠蛋白上、下游引物各0.3 mmol.L-1,人血β-珠蛋白DNA模板 10 μl，Taq DNA聚合酶2 U，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积50 μl，最后加入液体石蜡50 μl，稍混匀稍离心后，置PCR仪中，94℃预变性5 min，然后循环35个周期(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s) 后，在72℃延伸7 min。取10 μl PCR产物，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳45 min。在紫外灯光下观察、拍照。
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2 结果
2.1 RT-PCR条件的优化
2.1.1 Taq DNA聚合酶浓度对PCR结果的影响 在一定的反应体系中，随着Taq DNA聚合酶浓度在一定范围的增加，特异性扩增产物也相应增加，但若再增加酶的浓度，特异性扩增产物并不随之增加，反而出现明显的非特异性扩增。我们选择最佳浓度为4×104 U.L-1反应体系。
2.1.2 Mg2+浓度对PCR结果的影响 在一定的反应体系中，Mg2+浓度过低，特异性扩增产物少且出现引物二聚体，Mg2+浓度过高，特异性扩增产物反而减少。最适Mg2+浓度在1.5～2.0 mmol.L-1之间。
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2.1.3 引物浓度对PCR结果的影响 引物浓度过低，特异性扩增产物较少，而太高的引物又会产生明显的引物二聚体。我们所建立的反应体系中，引物的最适浓度在0.2～0.3 mmol.L-1。
2.2 RT-PCR结果 在建立稳定的PCR检测体系后，取不同量的模板进行扩增。对于PCR产物来说，由于所有的条件均是同等的，因此它们的DNA浓度(OD260×稀释倍数×50/1 000)〔5〕在一定程度上反映原组织中ET-1 mRNA的量，我们测定的结果(表1)可见，随着模板量的增加，其RT-PCR产物的量也相应增加。
表1 不同ET-1 mRNA模板量扩增结果(g.L-1)
模板量(ml)
n
±s, 百拇医药
F值
P值
0.0
10
0.00
20.038 5
0.000 1
1.0
10
0.027±0.004
5.0
10
0.084±0.007
, 百拇医药
10.0
10
0.183±0.016
3 讨论
mRNA的测定是分子生物学研究中一个常用的方法，主要有Northern Blot、原位杂交、RNA酶保护分析、RT-PCR等几种方法。但由于mRNA含量较少，且在转膜等操作时极易降解，因此对只含有极少量特异mRNA的组织和样品测定较困难；RNA酶保护分析虽然灵敏、准确，但操作复杂，价格昂贵；含内参物的RT-PCR则有简便、快速、灵敏、能定性兼定量之优点，所以它常常被用于这方面的研究。
将mRNA反转录成cDNA可采用的引物有3种，即反向引物、随机引物(hexamer)和Oligo dT。随机引物是4种核苷酸的随机排列组合六聚体，从理论上讲是比较好的，但实际应用时反转率并不高；Oligo dT可与绝大多数真核mRNA的Poly(A)尾配对，转录率较高，但由于Poly(A) RNA只占总RNA群体的1%～4%，此时得到的cDNA在数量上比前者要小；反向引物是一段与目标RNA互补的寡核苷酸序列，它是最特异的引发方法。
, http://www.100md.com
特异性、有效性和忠实性是反映PCR扩增效率的3个指标〔5〕，它们是相互矛盾的统一体，因而在建立PCR反应时，就应根据自己实验的具体情况权衡利弊，优化反应条件。本研究是对细胞的均一群体某个特定序列进行分析，因而PCR的产量和特异性更为重要。为此，我们以人血β-珠蛋白为模板，对引物浓度、Tag DNA聚合酶浓度和Mg2+浓度这些对PCR结果影响较为重要者进行优化，结果可见三者均有一合适的作用浓度范围。我们采用Tag DNA聚合酶浓度4×104 U.L-1、Mg2+浓度在1.5～2.0 mmol.L-1、引物浓度在0.2～0.3 mmol.L-1等条件下，系统能稳定扩增ET-1 mRNA，且最终的产物量与模板量密切相关。
本实验是直接对ET-1 mRNA进行相对定量，在建立稳定的检测体系后，PCR产物的OD值可以反映原标本中的模板相应量。此法简单、稳定，无须特殊的设备。以空白对照调零来测定OD值，排除了系统误差，使结果相对准确。
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RT-PCR for analysis of endothelin-1 mRNA in fetal mouse cortex
Yuan Zhongyu, Wang Mingli, Li Jingpei et al
(Dept of Microbiology, Anhui Medical Univeristy, Hefei 230032)
Abstract Objective To establish a method to determine the pathogenic roles of endothelin-1(ET-1) mRNA in fetal mouse cortex following congenital human cytomegalovirus(HCMV) infection. Methods After the conditions used in reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) were optimized, ET-1 mRNA at gene transcripition level was analysed. ET-1 mRNA quantity was determined by the OD value of PCR product. Results Under the concentration of Taq DNA polymerase, the OD value of RT-PCR product was correlated with the amount of ET-1 mRNA templet. Conclusion RT-PCR is very sensitive, simple, specific and credible in determining ET-1 mRNA.
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MeSH endlthelin-1/analysis; cerebral cortex; polymerase chain reaction; mice, inbred Balb/c
基金项目:安徽省自然科学基金资助课题(编号:95-医-18)
作者简介：袁中玉，男，34岁，硕士；王明丽，女，45岁，教授，硕士生导师
参考文献
1 Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988;332(6 163):411～415
2 Giaid A, Gibson SJ, Ibrahim NBN et al.Eendothelin-1, an endothelium-derived peptide, is expressed in neurons of the human spinal cord and dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86(8):7 634～7 638
, 百拇医药
3 Maccumber MW, Ross CA, Snydeer SH. Endothelin in brain:recepter, mitogenesis and biosynthesis in glial cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990;87(9):2 359～2 363
4 迪芬巴赫 CW，德维克斯勒GS. PCR技术实验指南. 第1版，北京：科学出版社， 1998:71(49)：207～208
5 奥斯伯F，布冷伦特R，金斯顿RE 等.精编分子生物学实验指南. 第1版，北京：科学出版社， 1998:31
6 Diviacco S, Norio P, Zentilin L et al.A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates.Gene,1992;122(2):313～320
2000-06-28收稿
2000-08-21修回, http://www.100md.com