口腔鳞状细胞癌中端粒酶活性的表达
作者：张志宏 张洪福 叶茂昌 祝怀平 戴海明 李志来 陈传俊 张震东
单位：张志宏 叶茂昌 李志来 陈传俊 张震东(安徽省立医院1口腔颌面外科)；祝怀平 戴海明(中心实验室，合肥 230001)
关键词：口腔肿瘤；癌；鳞状细胞
安徽医科大学学报报000607 摘要 目的 了解端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌中的表达情况，并探讨端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌演变过程中的作用。方法 对37例口腔鳞状细胞癌、40例口腔良性肿瘤及12例正常口腔组织，采用聚合酶链反应-酶联免疫吸附法检测其端粒酶活性。结果 口腔鳞状细胞癌组的端粒酶活性阳性率明显高于良性肿瘤组和正常组织组。结论 端粒酶可稳定染色体末端的端粒结构，端粒酶活化在口腔肿瘤恶变过程中起了重要作用；端粒酶可作为判断癌变能力的良好分子生物学标志。
自由词 端粒酶
, 百拇医药
中图分类号 R739.8 文献标识码 A
文章编号 1000-1492(2000)05-0346-03
端粒是真核细胞线形染色体末端的一种特殊结构，具有保护端区、维持染色体完整的作用。随着细胞分裂的不断进行，端粒不断缩短，当缩短到一定长度后，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号发出，细胞就发生衰亡或凋亡。端粒酶是一种能延长端粒末端的核甘酸蛋白酶，由蛋白质和RNA组成，可以其自身RNA为模板，发挥RNA指导的DNA合成作用，向端粒末端添加(TTAGGG)n序列,使端粒延长，延长细胞的寿命甚至使其永生,这就使肿瘤细胞的过度增殖有了可能。因而端粒酶与肿瘤的相关性研究也渐成为肿瘤学、病理学、分子生物学等多学科的研究热点。我们研究了端粒酶与口腔鳞状细胞癌的相关性，以探讨口腔鳞状细胞癌的发生机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1. 1 组织标本 77例口腔颌面部肿瘤组织(鳞状细胞癌37例，良性肿瘤40例)和12例正常组织均取自我院口腔科手术或活检标本，离体后30 min内置-80℃冻存。上述标本取材前未经任何治疗且均经常规病理证实。
1.2 主要试剂 引物(TS 5′-AATCCGAGCAGAGTT-3′在5′端标记生物素，CX 5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3′)，探针(5′-CCCTAACCCTAACCCTAA-3′，在5′端标记地高辛)和Taq酶均为美国Sangon公司产品。POD标记的抗地高辛抗体、裂解液、PCR扩增应用液、杂交液、洗涤液均为德国Boehringer Mannheim公司产品。
1.3 主要仪器 PCR扩增仪，酶标仪，低温离心机。
1.4 方法
1.4.1 端粒酶提取液的制备 ①取冻存组织约2 mm×2 mm×2 mm,迅速充分剪碎后加裂解液200 μl成匀浆状。②冰浴30 min。③4℃，12 000 r*min-1离心20 min，取上清液。
, 百拇医药
1.4.2 端粒酶重复序列扩增 ①取上清液2 μl,加入25 μl的PCR扩增应用液，1 μl的Taq酶，生物素标记的引物TS和CX各2 μl，无菌DEPC水补至50 μl，无菌石蜡油20 μl封盖。②25℃，30 min端粒酶合成端粒重复序列。③94℃，5 min灭活端粒酶。④94℃ 30 s，50℃ 30 s, 72℃ 90 s共30个循环。⑤72℃，10 min延伸。
1.4.3 ELISA检测 ①取5 μl扩增产物加20 μl变性液，室温变性10 min。②加入225 μl含生物素标记探针的杂交液，充分混匀后，取100 μl加至已包被链霉亲和素的微孔板，4℃过夜。③洗涤液洗涤3次,加POD标记的抗地高辛抗体100 μl 37℃ 30 min。④洗涤5次，加含TMB的底物100 μl显色15 min。⑤加终止液硫酸(2 mol*L-1硫酸)终止反应。⑥在酶标仪上测A450 nm和A690 nm值。
, 百拇医药
1.4.4 阳性结果判断 检测标本ΔA=A450nm-A690nm值，若>0.2即定为阳性，反之则为阴性。
1.4.5 统计学处理 采用四格表的χ2检验。
2 结果
口腔颌面部良、恶性肿瘤间端粒酶活性表达对比见表1、2。
表1 各组端粒酶活性检测结果
组别
端粒酶活性阳性数
端粒酶活性
阴性数
合计
, 百拇医药
阳性率
(%)
鳞状细胞癌
28
9
37
75.67*#
良性肿瘤
5
35
40
12.50
正常组织
, http://www.100md.com
0
12
12
0.00
与良性肿瘤组比较：*P<0.01; 与正常组织组比较：#P<0.01
表2 鳞状细胞癌分化程度与端粒酶活性阳性率
组别
例数
端粒酶活性阳性数
端粒酶活性
阳性率(%)
, 百拇医药
高分化鳞状细胞癌
29
22
75.86
中分化鳞状细胞癌
6
5
5/6
低分化鳞状细胞癌
2
1
1/2
3 讨论
, 百拇医药
3.1 端粒酶在细胞癌变中的作用 本次实验结果发现，口腔鳞状细胞癌的端粒酶活性阳性率(75.67%，28/37)显著高于口腔良性肿瘤(12.5%，5/40)和正常组织(0%，0/12)，这提示端粒酶的活性可能与肿瘤的发生发展密切相关。端粒酶是通过何种机制在癌变过程中发挥作用？结合Shay等〔1〕和Harley〔2〕的研究，我们认识到在细胞有丝分裂过程中，伴随着端粒序列的不断丢失，导致端粒长度缩短，当端粒缩短到一定长度时可触发染色体端粒旁的某些基因，或由于缩短后的端粒产生的某些DNA损害信号(可能由抑癌基因pRb和p53介导)，使细胞进入第一致死期M1。当pRb和p53 发生突变或结合了癌基因蛋白如SV40T抗原或E6/ E7蛋白时则细胞可越过M1期继续分裂，绕过M1期的细胞并未彻底获得永生，随细胞继续分裂，端粒继续缩短，直至细胞的许多染色体端粒发生严重缩短，如果此时端粒酶未被激活，细胞就进入第二致死期M2。此时染色体出现各种异常形态，细胞中某些端粒由于太短而失去功能，于是细胞死亡。而少数癌细胞在此阶段可激活端粒酶，通过增加6个重复片断的TTAGGG到端粒末端，弥补端粒的不断缺失,使端粒的长度得到稳定(可以稳定于任何长度)，从而使染色体形态稳定，越过M2期获得永生。另鳞状细胞癌组中高分化鳞状细胞癌、中分化鳞状细胞癌、低分化鳞状细胞癌3组间端粒酶活性阳性率并未逐渐增高，这与Albanell等〔3〕报道的端粒酶活性与细胞分化程度成反比关系的结论不一致，可能我们实验例数中中分化和低分化鳞状细胞癌不够多，尚难以判断端粒酶活性和癌分化程度的关系。
, http://www.100md.com
3.2 端粒酶活性的检测方法 检测端粒酶活性的传统方法是端粒重复序列延伸法和端粒重复序列扩增法(TRAP法)。本实验测定端粒酶活性的方法是采用端粒重复序列扩增法与常规酶联免疫吸附法(ELISA)相结合，即将端粒酶反应产物经PCR扩增，应用ELISA方法进行检测，称之为检测端粒酶活性的PCR-ELISA法。此PCR-ELISA法与前二者相比具有省时、简便、无放射性污染，且灵敏度高的优点。
3.3 端粒酶抑制剂的临床应用前景 肿瘤治疗的理想靶点应是肿瘤生长必需，而不存在于正常细胞的细胞成分。本次实验结果表明端粒酶活性检测阳性率在口腔鳞状细胞癌组织中达75.67%(28/37),而在良性肿瘤和正常组织中端粒酶活性阳性率本实验组仅9.61%(5/52),这就与恶性肿瘤中端粒酶活性的高表达形成鲜明对照，因而使得端粒酶成为肿瘤治疗方面一个具有特异性和普遍性的新靶点。目前抗端粒酶治疗主要有以下两方面：①基因治疗。Feng等〔4〕研究发现，反义人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)可抑制恶性肿瘤细胞端粒酶并导致细胞死亡。用反义hTR转染人Hela细胞，结果发现端粒DNA丢失，并且在增殖23～26个周期以后细胞开始死亡。②逆转录酶抑制剂。端粒酶是一种逆转录酶，因此逆转录酶抑制剂可能作为抗肿瘤药而利用。Yegorov等〔5〕发现逆转录酶抑制剂齐多夫定(AZT)可抑制端粒酶功能。由此可见，抑制端粒酶可能成为一种有发展前途的肿瘤治疗手段。但对端粒酶全酶结构及其活性的调节目前还不清楚，而端粒酶调节机制对于开发抗肿瘤治疗的抑制剂是必不可少的。另外由于人类肿瘤细胞中端粒的稳定虽90%是端粒酶介导的延长〔6〕，但仍有约10%是端粒酶非依赖性途径〔7〕，与DNA重组有关，由于后者的存在限制了端粒酶抑制剂的应用范围，因此，利用药物或其它手段抑制端粒酶活性来治疗肿瘤还需进一步研究。
, 百拇医药
Expression of telomerase activity in oral squamous cell carcinoma
Zhang Zhihong, Zhang Hongfu, Ye Maochang et al
(Dept of Oral and Maxillofacial Surgery, Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
Abstract：Objective To find out the expression of telomerase activity in oral neoplasms and study the effect of telomerase activity in the cancerization progress of oral squamous cell carcinomas. Methods Telomerase activity was examined by telomerase PCR-ELISA assay in 89 cases of fresh oral specimen including 37 cases of oral squamous cell carinoma, 40 cases of oral benign neoplasm， and 12 cases of oral normal tissues. Results The expression of telomerase activity in oral squamous cell carcinomas was higher than in oral benign neoplasms and oral normal tissues. Conclusion Telomerase is a ribonucleoprotein that maintains telomere length. Telomerase activity has important effect in the progress of oral oncogenesis. The telomoease activity may be a good molecular biomarker for observing the cancerization ability of oral neoplasms.
, http://www.100md.com
MeSH：mouth neoplasms; carcinoma, squamous cell
Free words：telomerase
作者简介：张志宏,男,33岁,硕士,主治医师；叶茂昌,男,48岁,主任医师,中华口腔医学会委员
参考文献
1，Shay JW, Wright WE.Educational Book American Society of Clinical Oncology, Thirty-third Annual Meeting,1997：49～56
2，Harley CB.Telomere loss:mitotic clock or genetic time bomb?Mutat Res,1991;256(2):271～282
, 百拇医药
3，Albanell J,Han W,Mellado B et al. Telomerase activity is repressed during differentiation of maturation-sensitive but not resistant human tumor cell lines. Cancer Res, 1996;56(7):1 503～1 508
4，Feng JL, Funk WD,Wang SS et al. The RNA component of human telomerase. Science,1995;269(1):1 236～1 241
5，Yegorov YE, Chernov DN, Akimov SS et al. Reverse transcriptase inhibitors suppress telomerase function and induce senescence-like processes in cultured mouse fibroblasts. FEBS Letter, 1996;389(2):115～118
, http://www.100md.com
6，Shay JW, Wright WE. The reactivation of telomerase in cancer progression. Trends Genet, 1996;12(4):129～135
7，Tracy MB, Lidija M, Silvia B. The telomere lengthing mechanism in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit. Hum Mol Gene, 1997;6(6):921～926
2000-07-06收稿
2000-09-13修回, 百拇医药
单位：张志宏 叶茂昌 李志来 陈传俊 张震东(安徽省立医院1口腔颌面外科)；祝怀平 戴海明(中心实验室，合肥 230001)
关键词：口腔肿瘤；癌；鳞状细胞
安徽医科大学学报报000607 摘要 目的 了解端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌中的表达情况，并探讨端粒酶活性在口腔鳞状细胞癌演变过程中的作用。方法 对37例口腔鳞状细胞癌、40例口腔良性肿瘤及12例正常口腔组织，采用聚合酶链反应-酶联免疫吸附法检测其端粒酶活性。结果 口腔鳞状细胞癌组的端粒酶活性阳性率明显高于良性肿瘤组和正常组织组。结论 端粒酶可稳定染色体末端的端粒结构，端粒酶活化在口腔肿瘤恶变过程中起了重要作用；端粒酶可作为判断癌变能力的良好分子生物学标志。
自由词 端粒酶
, 百拇医药
中图分类号 R739.8 文献标识码 A
文章编号 1000-1492(2000)05-0346-03
端粒是真核细胞线形染色体末端的一种特殊结构，具有保护端区、维持染色体完整的作用。随着细胞分裂的不断进行，端粒不断缩短，当缩短到一定长度后，细胞染色体即失去稳定性，阻止细胞进一步分裂的信号发出，细胞就发生衰亡或凋亡。端粒酶是一种能延长端粒末端的核甘酸蛋白酶，由蛋白质和RNA组成，可以其自身RNA为模板，发挥RNA指导的DNA合成作用，向端粒末端添加(TTAGGG)n序列,使端粒延长，延长细胞的寿命甚至使其永生,这就使肿瘤细胞的过度增殖有了可能。因而端粒酶与肿瘤的相关性研究也渐成为肿瘤学、病理学、分子生物学等多学科的研究热点。我们研究了端粒酶与口腔鳞状细胞癌的相关性，以探讨口腔鳞状细胞癌的发生机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1. 1 组织标本 77例口腔颌面部肿瘤组织(鳞状细胞癌37例，良性肿瘤40例)和12例正常组织均取自我院口腔科手术或活检标本，离体后30 min内置-80℃冻存。上述标本取材前未经任何治疗且均经常规病理证实。
1.2 主要试剂 引物(TS 5′-AATCCGAGCAGAGTT-3′在5′端标记生物素，CX 5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3′)，探针(5′-CCCTAACCCTAACCCTAA-3′，在5′端标记地高辛)和Taq酶均为美国Sangon公司产品。POD标记的抗地高辛抗体、裂解液、PCR扩增应用液、杂交液、洗涤液均为德国Boehringer Mannheim公司产品。
1.3 主要仪器 PCR扩增仪，酶标仪，低温离心机。
1.4 方法
1.4.1 端粒酶提取液的制备 ①取冻存组织约2 mm×2 mm×2 mm,迅速充分剪碎后加裂解液200 μl成匀浆状。②冰浴30 min。③4℃，12 000 r*min-1离心20 min，取上清液。
, 百拇医药
1.4.2 端粒酶重复序列扩增 ①取上清液2 μl,加入25 μl的PCR扩增应用液，1 μl的Taq酶，生物素标记的引物TS和CX各2 μl，无菌DEPC水补至50 μl，无菌石蜡油20 μl封盖。②25℃，30 min端粒酶合成端粒重复序列。③94℃，5 min灭活端粒酶。④94℃ 30 s，50℃ 30 s, 72℃ 90 s共30个循环。⑤72℃，10 min延伸。
1.4.3 ELISA检测 ①取5 μl扩增产物加20 μl变性液，室温变性10 min。②加入225 μl含生物素标记探针的杂交液，充分混匀后，取100 μl加至已包被链霉亲和素的微孔板，4℃过夜。③洗涤液洗涤3次,加POD标记的抗地高辛抗体100 μl 37℃ 30 min。④洗涤5次，加含TMB的底物100 μl显色15 min。⑤加终止液硫酸(2 mol*L-1硫酸)终止反应。⑥在酶标仪上测A450 nm和A690 nm值。
, 百拇医药
1.4.4 阳性结果判断 检测标本ΔA=A450nm-A690nm值，若>0.2即定为阳性，反之则为阴性。
1.4.5 统计学处理 采用四格表的χ2检验。
2 结果
口腔颌面部良、恶性肿瘤间端粒酶活性表达对比见表1、2。
表1 各组端粒酶活性检测结果
组别
端粒酶活性阳性数
端粒酶活性
阴性数
合计
, 百拇医药
阳性率
(%)
鳞状细胞癌
28
9
37
75.67*#
良性肿瘤
5
35
40
12.50
正常组织
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0
12
12
0.00
与良性肿瘤组比较：*P<0.01; 与正常组织组比较：#P<0.01
表2 鳞状细胞癌分化程度与端粒酶活性阳性率
组别
例数
端粒酶活性阳性数
端粒酶活性
阳性率(%)
, 百拇医药
高分化鳞状细胞癌
29
22
75.86
中分化鳞状细胞癌
6
5
5/6
低分化鳞状细胞癌
2
1
1/2
3 讨论
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3.1 端粒酶在细胞癌变中的作用 本次实验结果发现，口腔鳞状细胞癌的端粒酶活性阳性率(75.67%，28/37)显著高于口腔良性肿瘤(12.5%，5/40)和正常组织(0%，0/12)，这提示端粒酶的活性可能与肿瘤的发生发展密切相关。端粒酶是通过何种机制在癌变过程中发挥作用？结合Shay等〔1〕和Harley〔2〕的研究，我们认识到在细胞有丝分裂过程中，伴随着端粒序列的不断丢失，导致端粒长度缩短，当端粒缩短到一定长度时可触发染色体端粒旁的某些基因，或由于缩短后的端粒产生的某些DNA损害信号(可能由抑癌基因pRb和p53介导)，使细胞进入第一致死期M1。当pRb和p53 发生突变或结合了癌基因蛋白如SV40T抗原或E6/ E7蛋白时则细胞可越过M1期继续分裂，绕过M1期的细胞并未彻底获得永生，随细胞继续分裂，端粒继续缩短，直至细胞的许多染色体端粒发生严重缩短，如果此时端粒酶未被激活，细胞就进入第二致死期M2。此时染色体出现各种异常形态，细胞中某些端粒由于太短而失去功能，于是细胞死亡。而少数癌细胞在此阶段可激活端粒酶，通过增加6个重复片断的TTAGGG到端粒末端，弥补端粒的不断缺失,使端粒的长度得到稳定(可以稳定于任何长度)，从而使染色体形态稳定，越过M2期获得永生。另鳞状细胞癌组中高分化鳞状细胞癌、中分化鳞状细胞癌、低分化鳞状细胞癌3组间端粒酶活性阳性率并未逐渐增高，这与Albanell等〔3〕报道的端粒酶活性与细胞分化程度成反比关系的结论不一致，可能我们实验例数中中分化和低分化鳞状细胞癌不够多，尚难以判断端粒酶活性和癌分化程度的关系。
, http://www.100md.com
3.2 端粒酶活性的检测方法 检测端粒酶活性的传统方法是端粒重复序列延伸法和端粒重复序列扩增法(TRAP法)。本实验测定端粒酶活性的方法是采用端粒重复序列扩增法与常规酶联免疫吸附法(ELISA)相结合，即将端粒酶反应产物经PCR扩增，应用ELISA方法进行检测，称之为检测端粒酶活性的PCR-ELISA法。此PCR-ELISA法与前二者相比具有省时、简便、无放射性污染，且灵敏度高的优点。
3.3 端粒酶抑制剂的临床应用前景 肿瘤治疗的理想靶点应是肿瘤生长必需，而不存在于正常细胞的细胞成分。本次实验结果表明端粒酶活性检测阳性率在口腔鳞状细胞癌组织中达75.67%(28/37),而在良性肿瘤和正常组织中端粒酶活性阳性率本实验组仅9.61%(5/52),这就与恶性肿瘤中端粒酶活性的高表达形成鲜明对照，因而使得端粒酶成为肿瘤治疗方面一个具有特异性和普遍性的新靶点。目前抗端粒酶治疗主要有以下两方面：①基因治疗。Feng等〔4〕研究发现，反义人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)可抑制恶性肿瘤细胞端粒酶并导致细胞死亡。用反义hTR转染人Hela细胞，结果发现端粒DNA丢失，并且在增殖23～26个周期以后细胞开始死亡。②逆转录酶抑制剂。端粒酶是一种逆转录酶，因此逆转录酶抑制剂可能作为抗肿瘤药而利用。Yegorov等〔5〕发现逆转录酶抑制剂齐多夫定(AZT)可抑制端粒酶功能。由此可见，抑制端粒酶可能成为一种有发展前途的肿瘤治疗手段。但对端粒酶全酶结构及其活性的调节目前还不清楚，而端粒酶调节机制对于开发抗肿瘤治疗的抑制剂是必不可少的。另外由于人类肿瘤细胞中端粒的稳定虽90%是端粒酶介导的延长〔6〕，但仍有约10%是端粒酶非依赖性途径〔7〕，与DNA重组有关，由于后者的存在限制了端粒酶抑制剂的应用范围，因此，利用药物或其它手段抑制端粒酶活性来治疗肿瘤还需进一步研究。
, 百拇医药
Expression of telomerase activity in oral squamous cell carcinoma
Zhang Zhihong, Zhang Hongfu, Ye Maochang et al
(Dept of Oral and Maxillofacial Surgery, Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
Abstract：Objective To find out the expression of telomerase activity in oral neoplasms and study the effect of telomerase activity in the cancerization progress of oral squamous cell carcinomas. Methods Telomerase activity was examined by telomerase PCR-ELISA assay in 89 cases of fresh oral specimen including 37 cases of oral squamous cell carinoma, 40 cases of oral benign neoplasm， and 12 cases of oral normal tissues. Results The expression of telomerase activity in oral squamous cell carcinomas was higher than in oral benign neoplasms and oral normal tissues. Conclusion Telomerase is a ribonucleoprotein that maintains telomere length. Telomerase activity has important effect in the progress of oral oncogenesis. The telomoease activity may be a good molecular biomarker for observing the cancerization ability of oral neoplasms.
, http://www.100md.com
MeSH：mouth neoplasms; carcinoma, squamous cell
Free words：telomerase
作者简介：张志宏,男,33岁,硕士,主治医师；叶茂昌,男,48岁,主任医师,中华口腔医学会委员
参考文献
1，Shay JW, Wright WE.Educational Book American Society of Clinical Oncology, Thirty-third Annual Meeting,1997：49～56
2，Harley CB.Telomere loss:mitotic clock or genetic time bomb?Mutat Res,1991;256(2):271～282
, 百拇医药
3，Albanell J,Han W,Mellado B et al. Telomerase activity is repressed during differentiation of maturation-sensitive but not resistant human tumor cell lines. Cancer Res, 1996;56(7):1 503～1 508
4，Feng JL, Funk WD,Wang SS et al. The RNA component of human telomerase. Science,1995;269(1):1 236～1 241
5，Yegorov YE, Chernov DN, Akimov SS et al. Reverse transcriptase inhibitors suppress telomerase function and induce senescence-like processes in cultured mouse fibroblasts. FEBS Letter, 1996;389(2):115～118
, http://www.100md.com
6，Shay JW, Wright WE. The reactivation of telomerase in cancer progression. Trends Genet, 1996;12(4):129～135
7，Tracy MB, Lidija M, Silvia B. The telomere lengthing mechanism in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit. Hum Mol Gene, 1997;6(6):921～926
2000-07-06收稿
2000-09-13修回, 百拇医药