脐血造血细胞培养的特性
作者：汪健 祝怀平 孙自敏 吴竞生 戴海明
单位：安徽省立医院中心实验室，合肥 230001
关键词：胎血；造血干细胞；细胞培养
安徽医科大学学报报000506
摘要：目的 培养脐血中具有造血潜能的造血细胞，分析脐血中造血细胞的特性。方法 用密封的采血袋采集脐血，采用羟乙基淀粉一次沉淀法分离有核细胞，用半固体培养体系培养，7天计数红系集落形成单位(CFU-E)，14天后计数红系爆式集落形成单位(BFU-E)、粒单系集落形成单位(CFU-GM)，同时染色分析集落的组成成分。结果 采集34份脐血，平均体积为(99±22)ml；有核细胞数为(0.64～2.59)×109，有核细胞回收率为79.2%±13.7 %，回收的有核细胞绝对值为(1.22±0.43)×109； 平均每份脐血中含有BFU-E (1.39±0.75)×106，CFU-GM(2.15±1.22)×106。结论 脐血富含各期具有造血潜能细胞，每份脐血在有核细胞数和各种集落总数都可以满足成人移植的需求。
, http://www.100md.com
中图分类号：R331.1；R392 文献标识码：A
文章编号：1000-1492(2000)05-0343-03
脐血中有丰富的造血干/祖细胞，在外源特异性生长因子刺激下，可以增殖分化。我们采用羟乙基淀粉一次沉降法分离脐血有核细胞(NC)，甲基纤维素半固体培养脐血集落形成单位，旨在探讨脐血中具有集落形成增殖潜能的造血干/祖细胞量，为脐血移植提供客观指标。
1 材料与方法
1.1 标本来源 脐血来源于本院产科经筛选无急慢性感染及血液学疾患的产妇，新生儿为足月顺产。新生儿娩出后立即断脐，碘酒消毒脐带，行脐静脉穿刺，脐血借宫缩力流入装有28 ml ACD保存液的200 ml采血袋，同时不停的轻轻混匀，直至无脐血流出为止。
1.2 NC分离 将脐血混匀后转移到250 ml滴瓶内，加入1/4量的6%羟乙基淀粉氯化钠注射液(DUPONT PHARMA产品)，充分混匀后悬挂于超净台内，放置45min，吸取上层富含NC悬液3ml，于4℃ 1 000 r.min-1离心8 min，去上清液后重新用5 ml IMDM培养基悬浮细胞，1 000 r.min-1离心洗涤2次，并用含20% FCS的IMDM培养液调整细胞浓度为1×109.L-1供细胞集落培养用。将滴瓶底层红细胞去除，剩余细胞处理后加保存液液氮冻存。
, 百拇医药
1.3 细胞活力染色 NC用台盼蓝染色，计数台盼蓝拒染率。
1.4 NC回收率 NC回收率=[(分离后细胞悬液体积×NC浓度)/(分离前脐血量×NC浓度)]×100%。
1.5 回收的NC绝对值 NC绝对值=分离后细胞悬液体积×NC浓度。
1.6 半固体集落培养
1.6.1 红系集落形成单位(CFU-E)的培养 培养基为Metho CultTMH4330(Stem Cell Technologies INC产品)，主要成份为：0.9%甲基纤维素，30%胎牛血清(FCS)，1%牛血清白蛋白(BSA)，10-4mol.L-1 β-巯基乙醇，2 mmol.L-1 L-谷氨酰胺，3 kU.L-1的促红细胞生成素(EPO)。0.9 ml培养基加入0.1 ml的细胞悬液，充分混匀后转移至35 mm的6孔培养板，于37℃、5% CO2培养箱培养，每个标本重复3孔。适时观察，于第7天计数CFU-E，14天计数红系爆式集落形成单位(BFU-E)。平均每份脐血BFU-E绝对值=(NC总数×平均每孔集落数)÷105。
, 百拇医药
1.6.2 粒单系细胞集落形成单位(CFU-GM)的培养 培养基为Methocult TMGF+H4535(同上)，主要成分有：0.9%甲基纤维素，30% FCS，1% BSA，10-4 mol.L-1 β-巯基乙醇，2 mmol.L-1 L-谷氨酰胺，50 μg.L-1重组人干细胞因子(rhSCF)，20 μg.L-1重组人粒单细胞因子(rhGM-CSF)，20 μg.L-1重组人白细胞介素3(rhIL-3)，20 μg.L-1重组人白细胞介素6(rhIL-6)，20 μg.L-1重组人粒细胞因子(rhG-CSF)。1 ml培养基加入0.1 ml细胞悬液，充分混匀后转移至35 mm的6孔培养板，于37℃、5% CO2培养箱培养，每个标本作3复孔。适时观察，14天计数CFU-GM集落数，根据集落中细胞形态和折光性区分子代集落的性质，并对集落进行瑞氏和姬姆萨混合染色。平均每份脐血CFU-GM总数=(NC总数×平均每孔集落数)÷105。
, 百拇医药
2 结果
2.1 脐血采集结果 34份脐血采集量为60～150 ml，平均(99±22) ml；脐血有核细胞数为(0.64～2.59)×109，平均(1.59±0.6)×109。经羟乙基淀粉一次沉淀法分离，NC回收率为63%～96%，平均(79.2±13.7)%，回收的有核细胞绝对值(1.22±0.43)×109。
2.2 细胞活力染色 NC的台盼蓝拒染率>98%。
2.3 红系集落培养特性 培养第2天就可以观察到细胞分裂，第3天时可形成较小的细胞簇，第4～6天有50个以上细胞组成的致密型集落，显微镜下可以看到呈淡红色已经血红蛋白化的红系集落，以后集落体积增大，爆式集落形成。第8天时肉眼可见红色的红系集落，9～11天达高峰，以后只是集落的体积增大，集落数并没有增多。脐血7天的CFU-E(>8个细胞)平均为(104±48)/1×105 NC，14天的BFU-E(>40个细胞)平均为(75±40)/1×105 NC。BFU-E集落一般较大，由2～8个相互靠近的细胞团块组成，最多时可以由20个以上的细胞团块组成一个集落，集落中细胞折光性较好，平均每份脐血BFU-E绝对值为(1.39±0.75)×106。
, 百拇医药
2.4 CFU-GM集落培养特性 培养的第5天开始有集落形成，以后逐渐增多，8～11天达高峰，此后集落不断增大，总的集落数并不增加。CFU-GM平均为(119±65)/1×105 NC，其子代集落中CFU-GM占(42.4±6.9)%，粒系集落形成单位(CFU-G)占(27.6±7.8)% ，单核巨嗜细胞集落形成单位(CFU-M)占(30.0±8.4)%。计数集落的同时还可以发现部分致密的呈淡红色的集落，经联苯胺和瑞氏染色均证实为红系集落。平均每份脐血CFU-GM绝对值为(2.15±1.22)×106。
3 讨论
目前还缺乏早期造血干细胞定量的检测方法，只能通过细胞表面抗原如：CD34、CD33、CD71、CD45RA、HLA-DR、Thy-1等，以及长期培养启始细胞(LTC-IC)、高增殖潜能集落形成单位检测方法进行检测脐血中造血干/祖细胞的数量和质量。我们应用甲基纤维素半固体培养法分别检测脐血中CFU-E、BFU-E和CFU-GM，以此推测脐血中具有造血潜能的细胞量。红系集落培养体系中EPO支持红系祖细胞定向增殖分化，而CFU-GM培养体系中既有刺激较早期造血细胞的多功能生长因子SCF、IL-3、IL-6，也有定向造血祖细胞生长因子GM-CSF、G-CSF，这样完全可以启动各期的造血细胞，并向粒单系分化。我们的培养结果证实脐血：每份脐血中CFU-GM为(0.4～4.4)×106，平均(2.15 ±1.22)×106 ，与Mitchell等〔1〕的结果相近。粒单系子代集落以混合集落为主，其培养体系中同时也有红系集落生成，说明脐血中存在部分不依赖于EPO增殖分化的红系造血祖细胞。
, 百拇医药
脐血中有丰富的造血干/祖细胞，免疫细胞的免疫不成熟性以及容易产生免疫耐受等特征〔2～4〕，它作为替代骨髓和外周血干细胞移植具有广阔的应用前景。然而限制其广泛移植的主要原因是有限的脐血量和植入率低，正因为如此，直到现在脐血移植主要局限于儿童和一小部分成人〔5〕。临床上脐血移植一般以NC、CFU-GM衡量输注细胞量和造血干细胞的量，并且认为输注后中性粒细胞、血小板恢复时间与输注的NC、CFU-GM、CD34+细胞量密切相关〔6〕。虽然有很多不同移植量的报道〔7～9〕，但输注量的最低阈值尚不清楚。一般移植的NC量为每千克体重(1～4)×107，CFU-GM为每千克体重(1.4～2.4)×104。因此我们的实验结果与文献相比，单份脐血可以满足成人骨髓重建需要，如果同时提高NC回收率、有效地长期保存并且改善脐血造血细胞的植入率〔10〕，会更加拓展脐血的应用范围。
, 百拇医药
Culture characteristics of hematopoietic cells in cord blood
Wang Jian, Zhu Huaiping, Sun Zimin et al
(Central Lab, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001)
Abstract：Objective To cultivate hematopoietic potential cells in cord blood and analyse their characteristics. Methods A sealed blood collection bag was used to gather cord blood, red blood cell was isolated by means of 6% methylcellulose, and semi-solid culture medium was used to cultivate hematopoietic cells. CFU-E were counted after 7 days, BFU-E and CFU-GM was counted after 14 days, meanwhile component of each clone was analysed by dyeing. Results Of 34 cord blood samples, average volume was 99 ml±22 ml, number of nucleated cells was from 0.64×109～2.59×109, recovery number of nuleated cell was 1.22×109±0.43×109, rate of recovery was 79.2%±13.7%， BFU-E and CFU-GM was 1.39×106±0.75×106, 2.15×106±1.22×106, respectively. Conclusion Cord blood is rich of hematopoietic potential cells of all phases and each cord blood has enough nucleated cells, and CFU-E, BFU-E and CFU-GM for transplatation of adults.
, 百拇医药
MeSH：fetal blood; hematopoietic stem cells; cell culture
基金项目：安徽省“九五”攻关项目资助课题 (编号： 9613007)
作者简介：汪健，男，29岁，检验师；孙自敏，女，44岁，主任医师，硕士生导师
参考文献
1，Mitchell SC, John E, Wagner JE. Placental and/or umbilical cord blood: An alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood,1997；90(12):4 665～4 678
2，Cohen SB, Madrigal JA. Immunological and functional differences between cord and peripheral blood. Bone Marrow Transplant,1998；21 (Suppl 3):S9～12
, http://www.100md.com
3，Han P, Hodge G, Story C et al. Phenotypic analysis of functional T-lymphocyte subtypes and nutural killer cells in human cord blood: relevance to umbilical cord blood transplantation. Br J Haematol, 1995；89(4):733～740
4，Barbey C, Irion O, Helg C et al.Characterisation of the cytotoxic alloresponse of cord blood. Bone Marrow Transplant，1998；22 (Suppl 1):S26～30
5，Kai S. Cord blood transplantation for adults.Rinsho Byori，1999；(Suppl 110):48～53
, http://www.100md.com
6，Wagner JE. Umbilical cord transplantation. Leukemia, 1998；12 (Suppl 1): S30～32
7，Laporte JP, Lesage S, Portnoi MF et al. Unrelated mismatched cord blood transplantation in patients with hematological malignancies: A single institution experience. Bone Marrow Transplant, 1998；22 (Suppl 1): S76～77
8，Pablo R, Carmelita C, Andromachi S et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med, 1998;339(22):1 565～1 577
, 百拇医药
9，Nishihira H, Ohnuma K, Ikuta K et al. Unrelated umbilical cord-blood stem cell transplantation: A report from Kanagawa Cord Blood Bank.Japan. Int J Hematol,1998;68(2): 193～202
10，裴雪涛，王立生，徐黎 等.脐血CD34+细胞扩增和改善其移植效率的实验研究.中华血液学杂志,1997；18(3):133～136
2000-06-01收稿
2000-09-08修回, 百拇医药
单位：安徽省立医院中心实验室，合肥 230001
关键词：胎血；造血干细胞；细胞培养
安徽医科大学学报报000506
摘要：目的 培养脐血中具有造血潜能的造血细胞，分析脐血中造血细胞的特性。方法 用密封的采血袋采集脐血，采用羟乙基淀粉一次沉淀法分离有核细胞，用半固体培养体系培养，7天计数红系集落形成单位(CFU-E)，14天后计数红系爆式集落形成单位(BFU-E)、粒单系集落形成单位(CFU-GM)，同时染色分析集落的组成成分。结果 采集34份脐血，平均体积为(99±22)ml；有核细胞数为(0.64～2.59)×109，有核细胞回收率为79.2%±13.7 %，回收的有核细胞绝对值为(1.22±0.43)×109； 平均每份脐血中含有BFU-E (1.39±0.75)×106，CFU-GM(2.15±1.22)×106。结论 脐血富含各期具有造血潜能细胞，每份脐血在有核细胞数和各种集落总数都可以满足成人移植的需求。
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中图分类号：R331.1；R392 文献标识码：A
文章编号：1000-1492(2000)05-0343-03
脐血中有丰富的造血干/祖细胞，在外源特异性生长因子刺激下，可以增殖分化。我们采用羟乙基淀粉一次沉降法分离脐血有核细胞(NC)，甲基纤维素半固体培养脐血集落形成单位，旨在探讨脐血中具有集落形成增殖潜能的造血干/祖细胞量，为脐血移植提供客观指标。
1 材料与方法
1.1 标本来源 脐血来源于本院产科经筛选无急慢性感染及血液学疾患的产妇，新生儿为足月顺产。新生儿娩出后立即断脐，碘酒消毒脐带，行脐静脉穿刺，脐血借宫缩力流入装有28 ml ACD保存液的200 ml采血袋，同时不停的轻轻混匀，直至无脐血流出为止。
1.2 NC分离 将脐血混匀后转移到250 ml滴瓶内，加入1/4量的6%羟乙基淀粉氯化钠注射液(DUPONT PHARMA产品)，充分混匀后悬挂于超净台内，放置45min，吸取上层富含NC悬液3ml，于4℃ 1 000 r.min-1离心8 min，去上清液后重新用5 ml IMDM培养基悬浮细胞，1 000 r.min-1离心洗涤2次，并用含20% FCS的IMDM培养液调整细胞浓度为1×109.L-1供细胞集落培养用。将滴瓶底层红细胞去除，剩余细胞处理后加保存液液氮冻存。
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1.3 细胞活力染色 NC用台盼蓝染色，计数台盼蓝拒染率。
1.4 NC回收率 NC回收率=[(分离后细胞悬液体积×NC浓度)/(分离前脐血量×NC浓度)]×100%。
1.5 回收的NC绝对值 NC绝对值=分离后细胞悬液体积×NC浓度。
1.6 半固体集落培养
1.6.1 红系集落形成单位(CFU-E)的培养 培养基为Metho CultTMH4330(Stem Cell Technologies INC产品)，主要成份为：0.9%甲基纤维素，30%胎牛血清(FCS)，1%牛血清白蛋白(BSA)，10-4mol.L-1 β-巯基乙醇，2 mmol.L-1 L-谷氨酰胺，3 kU.L-1的促红细胞生成素(EPO)。0.9 ml培养基加入0.1 ml的细胞悬液，充分混匀后转移至35 mm的6孔培养板，于37℃、5% CO2培养箱培养，每个标本重复3孔。适时观察，于第7天计数CFU-E，14天计数红系爆式集落形成单位(BFU-E)。平均每份脐血BFU-E绝对值=(NC总数×平均每孔集落数)÷105。
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1.6.2 粒单系细胞集落形成单位(CFU-GM)的培养 培养基为Methocult TMGF+H4535(同上)，主要成分有：0.9%甲基纤维素，30% FCS，1% BSA，10-4 mol.L-1 β-巯基乙醇，2 mmol.L-1 L-谷氨酰胺，50 μg.L-1重组人干细胞因子(rhSCF)，20 μg.L-1重组人粒单细胞因子(rhGM-CSF)，20 μg.L-1重组人白细胞介素3(rhIL-3)，20 μg.L-1重组人白细胞介素6(rhIL-6)，20 μg.L-1重组人粒细胞因子(rhG-CSF)。1 ml培养基加入0.1 ml细胞悬液，充分混匀后转移至35 mm的6孔培养板，于37℃、5% CO2培养箱培养，每个标本作3复孔。适时观察，14天计数CFU-GM集落数，根据集落中细胞形态和折光性区分子代集落的性质，并对集落进行瑞氏和姬姆萨混合染色。平均每份脐血CFU-GM总数=(NC总数×平均每孔集落数)÷105。
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2 结果
2.1 脐血采集结果 34份脐血采集量为60～150 ml，平均(99±22) ml；脐血有核细胞数为(0.64～2.59)×109，平均(1.59±0.6)×109。经羟乙基淀粉一次沉淀法分离，NC回收率为63%～96%，平均(79.2±13.7)%，回收的有核细胞绝对值(1.22±0.43)×109。
2.2 细胞活力染色 NC的台盼蓝拒染率>98%。
2.3 红系集落培养特性 培养第2天就可以观察到细胞分裂，第3天时可形成较小的细胞簇，第4～6天有50个以上细胞组成的致密型集落，显微镜下可以看到呈淡红色已经血红蛋白化的红系集落，以后集落体积增大，爆式集落形成。第8天时肉眼可见红色的红系集落，9～11天达高峰，以后只是集落的体积增大，集落数并没有增多。脐血7天的CFU-E(>8个细胞)平均为(104±48)/1×105 NC，14天的BFU-E(>40个细胞)平均为(75±40)/1×105 NC。BFU-E集落一般较大，由2～8个相互靠近的细胞团块组成，最多时可以由20个以上的细胞团块组成一个集落，集落中细胞折光性较好，平均每份脐血BFU-E绝对值为(1.39±0.75)×106。
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2.4 CFU-GM集落培养特性 培养的第5天开始有集落形成，以后逐渐增多，8～11天达高峰，此后集落不断增大，总的集落数并不增加。CFU-GM平均为(119±65)/1×105 NC，其子代集落中CFU-GM占(42.4±6.9)%，粒系集落形成单位(CFU-G)占(27.6±7.8)% ，单核巨嗜细胞集落形成单位(CFU-M)占(30.0±8.4)%。计数集落的同时还可以发现部分致密的呈淡红色的集落，经联苯胺和瑞氏染色均证实为红系集落。平均每份脐血CFU-GM绝对值为(2.15±1.22)×106。
3 讨论
目前还缺乏早期造血干细胞定量的检测方法，只能通过细胞表面抗原如：CD34、CD33、CD71、CD45RA、HLA-DR、Thy-1等，以及长期培养启始细胞(LTC-IC)、高增殖潜能集落形成单位检测方法进行检测脐血中造血干/祖细胞的数量和质量。我们应用甲基纤维素半固体培养法分别检测脐血中CFU-E、BFU-E和CFU-GM，以此推测脐血中具有造血潜能的细胞量。红系集落培养体系中EPO支持红系祖细胞定向增殖分化，而CFU-GM培养体系中既有刺激较早期造血细胞的多功能生长因子SCF、IL-3、IL-6，也有定向造血祖细胞生长因子GM-CSF、G-CSF，这样完全可以启动各期的造血细胞，并向粒单系分化。我们的培养结果证实脐血：每份脐血中CFU-GM为(0.4～4.4)×106，平均(2.15 ±1.22)×106 ，与Mitchell等〔1〕的结果相近。粒单系子代集落以混合集落为主，其培养体系中同时也有红系集落生成，说明脐血中存在部分不依赖于EPO增殖分化的红系造血祖细胞。
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脐血中有丰富的造血干/祖细胞，免疫细胞的免疫不成熟性以及容易产生免疫耐受等特征〔2～4〕，它作为替代骨髓和外周血干细胞移植具有广阔的应用前景。然而限制其广泛移植的主要原因是有限的脐血量和植入率低，正因为如此，直到现在脐血移植主要局限于儿童和一小部分成人〔5〕。临床上脐血移植一般以NC、CFU-GM衡量输注细胞量和造血干细胞的量，并且认为输注后中性粒细胞、血小板恢复时间与输注的NC、CFU-GM、CD34+细胞量密切相关〔6〕。虽然有很多不同移植量的报道〔7～9〕，但输注量的最低阈值尚不清楚。一般移植的NC量为每千克体重(1～4)×107，CFU-GM为每千克体重(1.4～2.4)×104。因此我们的实验结果与文献相比，单份脐血可以满足成人骨髓重建需要，如果同时提高NC回收率、有效地长期保存并且改善脐血造血细胞的植入率〔10〕，会更加拓展脐血的应用范围。
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Culture characteristics of hematopoietic cells in cord blood
Wang Jian, Zhu Huaiping, Sun Zimin et al
(Central Lab, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001)
Abstract：Objective To cultivate hematopoietic potential cells in cord blood and analyse their characteristics. Methods A sealed blood collection bag was used to gather cord blood, red blood cell was isolated by means of 6% methylcellulose, and semi-solid culture medium was used to cultivate hematopoietic cells. CFU-E were counted after 7 days, BFU-E and CFU-GM was counted after 14 days, meanwhile component of each clone was analysed by dyeing. Results Of 34 cord blood samples, average volume was 99 ml±22 ml, number of nucleated cells was from 0.64×109～2.59×109, recovery number of nuleated cell was 1.22×109±0.43×109, rate of recovery was 79.2%±13.7%， BFU-E and CFU-GM was 1.39×106±0.75×106, 2.15×106±1.22×106, respectively. Conclusion Cord blood is rich of hematopoietic potential cells of all phases and each cord blood has enough nucleated cells, and CFU-E, BFU-E and CFU-GM for transplatation of adults.
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MeSH：fetal blood; hematopoietic stem cells; cell culture
基金项目：安徽省“九五”攻关项目资助课题 (编号： 9613007)
作者简介：汪健，男，29岁，检验师；孙自敏，女，44岁，主任医师，硕士生导师
参考文献
1，Mitchell SC, John E, Wagner JE. Placental and/or umbilical cord blood: An alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood,1997；90(12):4 665～4 678
2，Cohen SB, Madrigal JA. Immunological and functional differences between cord and peripheral blood. Bone Marrow Transplant,1998；21 (Suppl 3):S9～12
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3，Han P, Hodge G, Story C et al. Phenotypic analysis of functional T-lymphocyte subtypes and nutural killer cells in human cord blood: relevance to umbilical cord blood transplantation. Br J Haematol, 1995；89(4):733～740
4，Barbey C, Irion O, Helg C et al.Characterisation of the cytotoxic alloresponse of cord blood. Bone Marrow Transplant，1998；22 (Suppl 1):S26～30
5，Kai S. Cord blood transplantation for adults.Rinsho Byori，1999；(Suppl 110):48～53
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6，Wagner JE. Umbilical cord transplantation. Leukemia, 1998；12 (Suppl 1): S30～32
7，Laporte JP, Lesage S, Portnoi MF et al. Unrelated mismatched cord blood transplantation in patients with hematological malignancies: A single institution experience. Bone Marrow Transplant, 1998；22 (Suppl 1): S76～77
8，Pablo R, Carmelita C, Andromachi S et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med, 1998;339(22):1 565～1 577
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9，Nishihira H, Ohnuma K, Ikuta K et al. Unrelated umbilical cord-blood stem cell transplantation: A report from Kanagawa Cord Blood Bank.Japan. Int J Hematol,1998;68(2): 193～202
10，裴雪涛，王立生，徐黎 等.脐血CD34+细胞扩增和改善其移植效率的实验研究.中华血液学杂志,1997；18(3):133～136
2000-06-01收稿
2000-09-08修回, 百拇医药