中药复方香龙散(含药血清)诱导人胃癌细胞凋亡的研究*
作者：杨勤建 雷良蔚 潘希雄 李 波 郑从义
单位：杨勤建 雷良蔚 潘希雄 李 波 湖北中医学院 430061； 郑从义 武汉大学 430072
关键词：香龙散/中药；血清药理学；人胃癌细胞株；细胞凋亡
湖北中医学院学报/990124
摘要 目的 探讨中药复方香龙散诱导人胃癌细胞(HS-746T)凋亡的作用。方法 在中医辨证论治理论指导下，根据胃癌多为“痰瘀毒气凝于中焦”的病理特点，选用半夏、天龙、九香虫、白术等组成香龙散方，通过血清药理学方法，选择不同浓度的含药兔血清与人胃癌细胞共同孵育24h、36h、48h后，应用倒置相差显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪对细胞生长状况和凋亡形态、凋亡率及细胞周期分布进行观察、检测。结果 人胃癌细胞经含中药兔血清作用，由贴壁生长而逐渐脱落，外形变圆，体积缩小，折光性增强；荧光镜下见细胞核碎裂，裂解为大小不等的凋亡小体；流式细胞仪检测显现典型的细胞凋亡峰，以5%含药血清作用36h凋亡峰最为明显，凋亡率为37.02%。而无含药血清培养液对人胃癌细胞无诱导凋亡作用。结论：中药复方香龙散通过血清药理学方法可诱导人胃癌细胞的凋亡，这可能是其抗肿瘤的分子机制之一。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R735.2
肿瘤的发生、发展与细胞凋亡密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡将是抗肿瘤药物的新靶点[1]。有研究资料表明[2]：许多中药具有诱导肿瘤细胞凋亡作用，但多为单味中药某种成分提取物，而且是直接与肿瘤细胞作用，并不能完全反映中药的抗肿瘤作用的复杂过程。本实验根据中医对胃癌的发病临床症状和病理认识，选择化痰行气、健脾消积的药物组成香龙散方，通过血清药理学方法，初步观察了其诱导人胃癌细胞(HS-746T)凋亡的作用。结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物和药物
日本大耳白兔，雄性，体重2.5kg～3kg，由同济医大实验动物学部提供。人胃癌细胞株(HS-746T)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。香龙散方由半夏、天龙、九香虫、白术等中药组成，生药由湖北省药材公司饮片厂提供，按工艺制成每ml含生药5g的浸膏备用。DMEM培养液、胎牛血清、胰酶由美国Gibco公司提供；二苯酰胺Hoechst 33258、硫柳汞thsmersol，由美国Sigma公司提供。PI染色剂，由美国BD公司提供。
, 百拇医药
1.2 仪器
倒置相差显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司)、流式细胞仪FACSort(美国BD公司)、CO2培养箱DODEL2300型(美国Shellab公司)。
1.3 含药血清制备
以纯种雄性日本大耳白兔5只，每日给予含香龙散浸膏10g/kg灌胃。10日后，于最后1次灌药后lh(灌药前禁食、不禁水12h)，乙醚麻醉，颈动脉采血，无菌分离血清，经56°C、30min灭活处理后，置-20°C冰箱保存备用。
1.4 人胃癌细胞培养
将传代的人胃癌细胞(HS-746T)接种于含100μg/ml青、链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液中(下同)，细胞浓度为2×104/ml，置于含5%CO2、37°C温度培养箱中培养。培养24h至细胞生长旺盛后，去培养液，分别加入含药血清5%、10%浓度的培养液各5ml(另设无含药血清对照 CK)，置培养箱中培养24h，去含药血清培养液，再加入不含药血清的DMEM培养液分别培养24h、36h、48h(简称5%24h、10%24h、5%36h、10%36h、5%48h、10%48h)。
, http://www.100md.com
1.5 将培养皿在倒置相差显微镜下作活体细胞形态的观察。
1.6 荧光染色细胞的制备
收集培养24h、36h、48h的细胞，离心去上清。一部分加入含甲醇、冰乙酸的固定液固定，反复二次，每次5min，离心去固定液后，取细胞沉淀液玻璃滴片，室温下干燥，加二苯酰胺荧光液染色lh(避光)，三蒸水反复冲洗3次，置常温下自然干燥，甘油封片，Olympus荧光显微镜(10×20倍)下作细胞凋亡的形态学观察。
1.7 流式细胞仪检测细胞的制备
将另一部分细胞沉淀液用PBS冲洗2次，在震荡状态下缓慢滴入75%乙醇2ml左右，过夜，用PSS冲洗，调至终浓度为1ml，加RNA酶10～15ul,37°C水浴30min，加PI染色剂(避光)染色30min，作流式细胞仪检测。每份样品检测 10000个以上细胞。
, 百拇医药
2 结果
2.1 人胃癌细胞活体生长形态观察
经含药血清处理24h后，再加培养液培养12h～24h，即可见胃癌细胞由贴壁而脱落，浮悬于培养液中，细胞数量少，细胞形态变圆，体积缩小，核固缩出现，核颜色加深，折光性增强；培养24h～48h的脱落细胞更加增多；无含药血清培养液培养的胃癌细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，生长良好，相邻细胞生长融合成片。
2.2 荧光染色后的细胞核形态观察
荧光显微镜下见不同浓度含药血清处理的人胃癌细胞在24h、36h、48h时间段中均有部分细胞碎裂，呈大小不等、形态不规则的碎片或呈梅花状，此即为典型的细胞凋亡形态，其中以含药血清5%培养液36h的凋亡细胞最多；无含药血清培养液培养的人胃癌细胞细胞核均完整，未见有凋亡形态的细胞核。
, http://www.100md.com
2.3 流式细胞仪检测凋亡细胞
不同含药血清浓度处理36h～48h的人胃癌细胞均在DNA直方图上出现细胞凋亡峰，其中以5%36h处理的凋亡峰在DNA直方图上表现最为典型，对照组和经含药血清24h处理的细胞无凋亡峰。各组凋亡率经处理统计见附表。
附表 各组细胞凋亡率比较(%)
CK
5%24h
10%24h
5%36h
10%36h
5%48h
, http://www.100md.com
10%48h
凋 亡率
3.65
3.52
4.42
37.02
27.29
26.72
28.11
2.4 细胞同期分析
经5%香龙散含药血清作用24h组，可见G1期细胞为12.49%，S期细胞34.30%，G2期细胞为53.30%，而对照组分别为46.68%、28.10%、25.22%。G1期细胞数逐渐减少，G2期细胞逐渐增多，大部分细胞阻滞在S期或G2期，抑制了癌细胞的分裂。
, http://www.100md.com
3 讨论
3.1 近年来，已发现有部分中药提取物能诱导细胞凋亡，如紫杉醇、榄香烯乳、氧化砷、槲皮素等，但均为药物在体外与细胞直接作用，由于中药粗制剂的杂质成分、各种电解质或鞣质成分及不同酸碱度的干扰等，都会对培养细胞的生理活性造成一定的影响，其结果似不能完全说明中药服用后在体内的复杂作用，更不能等同于中药复方的复杂作用。日本学者田代真一在对中药的研究体系进行探讨过程中，发明了血清药理学的实验方法[3]，即将中药复方制剂通过动物灌胃，药物有效成分经胃肠吸收进入机体血液循环，在一定时间内采取血液，分离其血清，再以此血清加入到体外细胞培养体系，观察其药理作用，分析其所含药物的有效成分。这种方法排除了在体外实验中药物直接与细胞作用的各种干扰因素，较接近药物在体内环境中产生的药理效应的真实过程。本实验选用具有健脾化痰、行气散结等作用的半夏、天龙、白术、九香虫等组成复方“香龙散”，通过血清药理学方法成功地诱导了人胃癌细胞的凋亡，从形态学和流式细胞仪检测均呈现明显的凋亡特征，表明中药复方具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
, 百拇医药
3.2 本研究发现香龙散含药血清作用于人胃癌细胞诱导的细胞凋亡，主要是作用于癌细胞的DNA复制期，即S期和G2期，以5%含药血清浓度处理24h～36h的阻滞最为明显，从而抑制了胃癌细胞的分裂增殖；同时还发现香龙散含药血清持续作用于人胃癌细胞较长时间并未出现明显的凋亡细胞，而只作用24h后再更换无含药血清培养基培养24h～36h，细胞则出现明显的凋亡形态改变，提示香龙散含药血清诱导的人胃癌细胞凋亡与药物浓度无直接关系。
3.3 香龙散是根据肿瘤临床所见多为“脾虚痰瘀、浊气凝结”的病理特点而组方选药，方中半夏、天龙虽有抗肿瘤作用[4]，但均未见到其可诱导肿瘤细胞凋亡的报道。本实验结果表明根据中医理论对胃癌的病理特点而组方用药，可诱导人胃癌细胞凋亡，并发现了半夏、天龙的抗肿瘤作用机理与诱导肿瘤细胞的凋亡有密切关系。中药复方诱导凋亡的作用机理复杂，复方也不同于单味中药作用的叠加，是多种化学成分多靶作用的结果，但诱导凋亡的药物成分为何?是药物直接作用，或其它因素作用，尚有待于深入研究。
, http://www.100md.com
3.4 细胞凋亡是一种主动的有较多基因参与调控的细胞自杀过程，例如P53、p16、C-myc、bcl-2、bax等相关基因均参与凋亡的调控。在本实验所诱导的人胃癌细胞凋亡，可能与影响癌细胞生长调控的基因表达有关，其作用机理还不清楚，本研究正在更深入地进行中。
本实验得到同济医科大学附属同济医院分子医学中心的大力协助，表示衷心的感谢!
参 考 文 献
1.黄镜，孙燕. 肿瘤药物治疗的新靶点：凋亡. 中国新药杂志，1997，6(6)：412
2.杨勤建，中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展. 湖北中医杂志，1998，20(1)：53
3.张君豪，陈可冀.血清药理学在中药及复方研究中应用的评价. 中国中西医结合杂志，1996，16(3)∶131
4.杨仓良，程方，高渌纹等.剧毒中药古今用.北京：中国医药科技出版社，1991.191-202
* 湖北省教委资助项目[鄂教科技(1993)031号文：A024号]
收稿日期：1998-12-20, 百拇医药
单位：杨勤建 雷良蔚 潘希雄 李 波 湖北中医学院 430061； 郑从义 武汉大学 430072
关键词：香龙散/中药；血清药理学；人胃癌细胞株；细胞凋亡
湖北中医学院学报/990124
摘要 目的 探讨中药复方香龙散诱导人胃癌细胞(HS-746T)凋亡的作用。方法 在中医辨证论治理论指导下，根据胃癌多为“痰瘀毒气凝于中焦”的病理特点，选用半夏、天龙、九香虫、白术等组成香龙散方，通过血清药理学方法，选择不同浓度的含药兔血清与人胃癌细胞共同孵育24h、36h、48h后，应用倒置相差显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪对细胞生长状况和凋亡形态、凋亡率及细胞周期分布进行观察、检测。结果 人胃癌细胞经含中药兔血清作用，由贴壁生长而逐渐脱落，外形变圆，体积缩小，折光性增强；荧光镜下见细胞核碎裂，裂解为大小不等的凋亡小体；流式细胞仪检测显现典型的细胞凋亡峰，以5%含药血清作用36h凋亡峰最为明显，凋亡率为37.02%。而无含药血清培养液对人胃癌细胞无诱导凋亡作用。结论：中药复方香龙散通过血清药理学方法可诱导人胃癌细胞的凋亡，这可能是其抗肿瘤的分子机制之一。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R735.2
肿瘤的发生、发展与细胞凋亡密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡将是抗肿瘤药物的新靶点[1]。有研究资料表明[2]：许多中药具有诱导肿瘤细胞凋亡作用，但多为单味中药某种成分提取物，而且是直接与肿瘤细胞作用，并不能完全反映中药的抗肿瘤作用的复杂过程。本实验根据中医对胃癌的发病临床症状和病理认识，选择化痰行气、健脾消积的药物组成香龙散方，通过血清药理学方法，初步观察了其诱导人胃癌细胞(HS-746T)凋亡的作用。结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物和药物
日本大耳白兔，雄性，体重2.5kg～3kg，由同济医大实验动物学部提供。人胃癌细胞株(HS-746T)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。香龙散方由半夏、天龙、九香虫、白术等中药组成，生药由湖北省药材公司饮片厂提供，按工艺制成每ml含生药5g的浸膏备用。DMEM培养液、胎牛血清、胰酶由美国Gibco公司提供；二苯酰胺Hoechst 33258、硫柳汞thsmersol，由美国Sigma公司提供。PI染色剂，由美国BD公司提供。
, 百拇医药
1.2 仪器
倒置相差显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司)、流式细胞仪FACSort(美国BD公司)、CO2培养箱DODEL2300型(美国Shellab公司)。
1.3 含药血清制备
以纯种雄性日本大耳白兔5只，每日给予含香龙散浸膏10g/kg灌胃。10日后，于最后1次灌药后lh(灌药前禁食、不禁水12h)，乙醚麻醉，颈动脉采血，无菌分离血清，经56°C、30min灭活处理后，置-20°C冰箱保存备用。
1.4 人胃癌细胞培养
将传代的人胃癌细胞(HS-746T)接种于含100μg/ml青、链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液中(下同)，细胞浓度为2×104/ml，置于含5%CO2、37°C温度培养箱中培养。培养24h至细胞生长旺盛后，去培养液，分别加入含药血清5%、10%浓度的培养液各5ml(另设无含药血清对照 CK)，置培养箱中培养24h，去含药血清培养液，再加入不含药血清的DMEM培养液分别培养24h、36h、48h(简称5%24h、10%24h、5%36h、10%36h、5%48h、10%48h)。
, http://www.100md.com
1.5 将培养皿在倒置相差显微镜下作活体细胞形态的观察。
1.6 荧光染色细胞的制备
收集培养24h、36h、48h的细胞，离心去上清。一部分加入含甲醇、冰乙酸的固定液固定，反复二次，每次5min，离心去固定液后，取细胞沉淀液玻璃滴片，室温下干燥，加二苯酰胺荧光液染色lh(避光)，三蒸水反复冲洗3次，置常温下自然干燥，甘油封片，Olympus荧光显微镜(10×20倍)下作细胞凋亡的形态学观察。
1.7 流式细胞仪检测细胞的制备
将另一部分细胞沉淀液用PBS冲洗2次，在震荡状态下缓慢滴入75%乙醇2ml左右，过夜，用PSS冲洗，调至终浓度为1ml，加RNA酶10～15ul,37°C水浴30min，加PI染色剂(避光)染色30min，作流式细胞仪检测。每份样品检测 10000个以上细胞。
, 百拇医药
2 结果
2.1 人胃癌细胞活体生长形态观察
经含药血清处理24h后，再加培养液培养12h～24h，即可见胃癌细胞由贴壁而脱落，浮悬于培养液中，细胞数量少，细胞形态变圆，体积缩小，核固缩出现，核颜色加深，折光性增强；培养24h～48h的脱落细胞更加增多；无含药血清培养液培养的胃癌细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，生长良好，相邻细胞生长融合成片。
2.2 荧光染色后的细胞核形态观察
荧光显微镜下见不同浓度含药血清处理的人胃癌细胞在24h、36h、48h时间段中均有部分细胞碎裂，呈大小不等、形态不规则的碎片或呈梅花状，此即为典型的细胞凋亡形态，其中以含药血清5%培养液36h的凋亡细胞最多；无含药血清培养液培养的人胃癌细胞细胞核均完整，未见有凋亡形态的细胞核。
, http://www.100md.com
2.3 流式细胞仪检测凋亡细胞
不同含药血清浓度处理36h～48h的人胃癌细胞均在DNA直方图上出现细胞凋亡峰，其中以5%36h处理的凋亡峰在DNA直方图上表现最为典型，对照组和经含药血清24h处理的细胞无凋亡峰。各组凋亡率经处理统计见附表。
附表 各组细胞凋亡率比较(%)
CK
5%24h
10%24h
5%36h
10%36h
5%48h
, http://www.100md.com
10%48h
凋 亡率
3.65
3.52
4.42
37.02
27.29
26.72
28.11
2.4 细胞同期分析
经5%香龙散含药血清作用24h组，可见G1期细胞为12.49%，S期细胞34.30%，G2期细胞为53.30%，而对照组分别为46.68%、28.10%、25.22%。G1期细胞数逐渐减少，G2期细胞逐渐增多，大部分细胞阻滞在S期或G2期，抑制了癌细胞的分裂。
, http://www.100md.com
3 讨论
3.1 近年来，已发现有部分中药提取物能诱导细胞凋亡，如紫杉醇、榄香烯乳、氧化砷、槲皮素等，但均为药物在体外与细胞直接作用，由于中药粗制剂的杂质成分、各种电解质或鞣质成分及不同酸碱度的干扰等，都会对培养细胞的生理活性造成一定的影响，其结果似不能完全说明中药服用后在体内的复杂作用，更不能等同于中药复方的复杂作用。日本学者田代真一在对中药的研究体系进行探讨过程中，发明了血清药理学的实验方法[3]，即将中药复方制剂通过动物灌胃，药物有效成分经胃肠吸收进入机体血液循环，在一定时间内采取血液，分离其血清，再以此血清加入到体外细胞培养体系，观察其药理作用，分析其所含药物的有效成分。这种方法排除了在体外实验中药物直接与细胞作用的各种干扰因素，较接近药物在体内环境中产生的药理效应的真实过程。本实验选用具有健脾化痰、行气散结等作用的半夏、天龙、白术、九香虫等组成复方“香龙散”，通过血清药理学方法成功地诱导了人胃癌细胞的凋亡，从形态学和流式细胞仪检测均呈现明显的凋亡特征，表明中药复方具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
, 百拇医药
3.2 本研究发现香龙散含药血清作用于人胃癌细胞诱导的细胞凋亡，主要是作用于癌细胞的DNA复制期，即S期和G2期，以5%含药血清浓度处理24h～36h的阻滞最为明显，从而抑制了胃癌细胞的分裂增殖；同时还发现香龙散含药血清持续作用于人胃癌细胞较长时间并未出现明显的凋亡细胞，而只作用24h后再更换无含药血清培养基培养24h～36h，细胞则出现明显的凋亡形态改变，提示香龙散含药血清诱导的人胃癌细胞凋亡与药物浓度无直接关系。
3.3 香龙散是根据肿瘤临床所见多为“脾虚痰瘀、浊气凝结”的病理特点而组方选药，方中半夏、天龙虽有抗肿瘤作用[4]，但均未见到其可诱导肿瘤细胞凋亡的报道。本实验结果表明根据中医理论对胃癌的病理特点而组方用药，可诱导人胃癌细胞凋亡，并发现了半夏、天龙的抗肿瘤作用机理与诱导肿瘤细胞的凋亡有密切关系。中药复方诱导凋亡的作用机理复杂，复方也不同于单味中药作用的叠加，是多种化学成分多靶作用的结果，但诱导凋亡的药物成分为何?是药物直接作用，或其它因素作用，尚有待于深入研究。
, http://www.100md.com
3.4 细胞凋亡是一种主动的有较多基因参与调控的细胞自杀过程，例如P53、p16、C-myc、bcl-2、bax等相关基因均参与凋亡的调控。在本实验所诱导的人胃癌细胞凋亡，可能与影响癌细胞生长调控的基因表达有关，其作用机理还不清楚，本研究正在更深入地进行中。
本实验得到同济医科大学附属同济医院分子医学中心的大力协助，表示衷心的感谢!
参 考 文 献
1.黄镜，孙燕. 肿瘤药物治疗的新靶点：凋亡. 中国新药杂志，1997，6(6)：412
2.杨勤建，中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展. 湖北中医杂志，1998，20(1)：53
3.张君豪，陈可冀.血清药理学在中药及复方研究中应用的评价. 中国中西医结合杂志，1996，16(3)∶131
4.杨仓良，程方，高渌纹等.剧毒中药古今用.北京：中国医药科技出版社，1991.191-202
* 湖北省教委资助项目[鄂教科技(1993)031号文：A024号]
收稿日期：1998-12-20, 百拇医药