L-精氨酸和牛磺酸对同型半胱氨酸诱导平滑肌细胞增殖的抑制作用
作者：薛林 张钧华 李载权 庞永正 唐朝枢 刘乃奎
单位：薛林 张钧华 李载权 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管研究所；刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所，北京 100034
关键词：
北京医科大学学报990528 动脉粥样硬化是危害人类健康最严重的疾病之一。近年研究发现,高同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)血症是动脉粥样硬化的一个独立的、重要的危险因素。现已证明,它可引起内皮损伤、刺激血管平滑肌细胞增殖、促进胶原形成、诱导血小板聚集,促进动脉粥样硬化形成[1～5]。本工作在培育的大鼠VSMC上,观察牛磺酸及L-精氨酸HCY诱导的VSMC增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 血管平滑肌细胞培育
, 百拇医药
取SD大鼠胸主动脉,按Ross方法分离和传代培养。用体积分数为20%小牛血清的DEME培养液,实验用第4代细胞。
1.2 VSMC3H-TdR掺入
按每孔5×105细胞数接种于24孔板,加体积分数为20%小牛血清的DEME培养液培养24 h,贴壁后换用体积分数为0.5%小牛血清的DEME培养液再培养24 h,然后按下列分组加入不同药物进行实验。(1)对照组:只加PBS;(2)HCY组0.1 mmol.L-1 HCY;(3)L-精氨酸组:10 mmol.L-1 L-精氨酸;(4)TAU组:10 mmol.L-1牛磺酸;(5)HCY+L-Arg, 0.1 mmol.L-1 HCY+5,10, 20 mmol.L-1L-精氨酸;(6)HCY+TAU, 0.1 mmol.L-1 HCY+5,10,20 mmol.L-1牛磺酸;(7)HCY+L-arg+TAU:0.1 mmol.L-1 HCY+5,10 mmol.L-1 L-精氨酸+5,10 mmol.L-1牛磺酸。同时加入37 kBq 3H-TdR培养24 h后加入冷PBS终止反应。在Millipore上经微孔滤膜(0.25 μm)收集并洗净细胞,并用100 g.L-1三氯醋酸处理,滤膜置于闪烁瓶中,加入闪烁液,在液体闪烁计数仪上测量3H的放射活性。
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1.3 材料
SD大鼠由北京医科大学动物实验中心提供;HCY,L-精氨酸,牛磺酸均为Sigma公司产品,3H-TdR购自中国原子能研究所,其余试剂均为国产分析纯。
1.4 统计学处理
每次双平行管操作,实验重复3次,实验数据以
±s表示;one-way ANOVA和组间q检验作统计学处理。
2 结果
0.1 mmol.L-1 HCY可使培养的兔VSMC 3H-TdR掺入增加5.7倍[control:(46±10)×10-3 pmol vs HCY:(310±48)×10-3 pmol, P<0.01],而单纯用L-精氨酸及牛磺酸对VSMC 3H-TdR掺入无影响[control:(46±10)×10-3 pmol vs L-精氨酸:(46±8)×10-3 pmol或牛磺酸(47±6)×10-3 pmol, P<0.05], 但是它们可呈剂量依赖性地抑制HCY诱导的VSMC增殖。5, 10, 20 mmol.L-1 L-精氨酸可分别使HCY诱导的VSMC 3H-TdR掺入降低11%, 35%, 48% (P<0.01); 5,10,20 mmol.L-1牛磺酸可分别使HCY诱导的VSMC 3H-TdR掺入降低11%, 47%, 54% (P<0.01，表1)。合用牛磺酸+L-精氨酸(5, 10 mmol.L-1)可分别使HCY诱导的VSMC 3H-TdR掺入降低59%和65%(P<0.01);合用牛磺酸+L-精氨酸对VSMC增殖的抑制效应大于单纯应用L-精氨酸及牛磺酸组(P<0.01，表1) 。
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表1 牛磺酸和L-精氨酸对HCY诱导的VSMC增殖的影响
Table 1 The influence of L-arginine and taurine on HCY-induced VSMC proliferation c(L-Arg
or TAU)
/mmol.L-1
n(3H-TdR incorporation)/fmol
HCY
HCY+L-Arg
HCY+TAU
, http://www.100md.com HCY+L-
Arg+TAU
5
310±48
276±47
275±45
126±29**##
10
310±48
201±49**
164±37**
108±34**＃
, http://www.100md.com
20
310±48
160±38**
144±47**
TAU, taurine; HCY， 0.01 mmol.L-1, ** P<0.01, vs HCY; # P<0.05, ## P<0.01, vs HCY+L-ARG or HCY+TAU.
3 讨论
HCY是甲硫氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸。VSMC增殖是动脉粥样硬化的一个主要病理特征。Tsai等[4]报道HCY可通过MAPK、核内癌基因和细胞周期调控蛋白信息传导途径刺激VSMC增殖。此外,大量的文献显示,牛磺酸和L-精氨酸有抑制VSMC增殖的作用,因此,本工作观察了牛磺酸及L-精氨酸对HCY诱导的VSMC增殖的抑制作用。
, http://www.100md.com
我们首次发现L-精氨酸及牛磺酸可呈剂量依赖性地抑制HCY诱导的VSMC增殖。有关L-精氨酸及牛磺酸抑制HCY诱导VSMC增殖的机制尚不清楚。L-精氨酸是一种碱性氨基酸,它是NO合成的前体,可通过NO抑制VSMC增殖、扩张血管、抑制血小板聚集。有人报道,NO与HCY作用形成巯基亚硝酸盐,后者可扩张血管,抑制血小板聚集[5]。牛磺酸也是一种含硫氨基酸,它具有稳定细胞膜,调节钙稳态,抑制VSMC增殖等多种生物学效应[6，7]。已有文献报道,牛磺酸可抑制内皮素,血管紧张素Ⅱ等多种因素引起的VSMC增殖[7]。
混合应用牛磺酸和L-精氨酸具有协同或叠加抑制作用，这与我们在内皮剥脱模型上的研究结果类似。L-精氨酸和牛磺酸均是机体的内源性物质,即使补充很大剂量,亦无毒副作用;且均是小分子物质,无抗原性,各种途径给药均可,且价廉易得。因此,探讨L-精氨酸、牛磺酸及其混合液抑制HCY诱导VSMC增殖的机制,以及对动脉粥样硬化的治疗是非常有价值的,值得深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Harker LA， Ross R, Slichter ST， et al. Homocysteine-induced arterosclerosis. The role of endothelial cell injury and platelet response in its genesis. J Clin Invest, 1976,58:713-741
2 Velend PM, Refsum H. Plasma homocysteine, a risk for vascular disease:Plasma levels in health, disease and drug therapy. J Lab Med, 1989, 114:473-501
3 Malinow MR. Hyperhomocyst(e)inema: a common and easily reversible risk factor occlusive atherosclerosis. Circulation, 1990, 81:2004-2006
, 百拇医药
4 Tsai JC, Perrele MA, Yoshizumi M, et al. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6369-6374
5 Dalton ML, Gadson PF, Wrenn RW. Homocysteine signal cascade: production of phospholipids, activation of protein kinase C, and the induction of c-fos and c-myb in smooth cells. FASEB J, 1997, 11:701-711
6 Huxtable RJ. Physiological action of taurine. Physiol Rev, 1992, 72:101-163
7 牛大地,张居馨,迟学栋，等.牛磺酸抑制大鼠平滑肌细胞增殖.北京医科大学学报, 1993,24:225-227
(1998-08-27收稿), 百拇医药
单位：薛林 张钧华 李载权 庞永正 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管研究所；刘乃奎 北京医科大学心血管基础研究所，北京 100034
关键词：
北京医科大学学报990528 动脉粥样硬化是危害人类健康最严重的疾病之一。近年研究发现,高同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)血症是动脉粥样硬化的一个独立的、重要的危险因素。现已证明,它可引起内皮损伤、刺激血管平滑肌细胞增殖、促进胶原形成、诱导血小板聚集,促进动脉粥样硬化形成[1～5]。本工作在培育的大鼠VSMC上,观察牛磺酸及L-精氨酸HCY诱导的VSMC增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 血管平滑肌细胞培育
, 百拇医药
取SD大鼠胸主动脉,按Ross方法分离和传代培养。用体积分数为20%小牛血清的DEME培养液,实验用第4代细胞。
1.2 VSMC3H-TdR掺入
按每孔5×105细胞数接种于24孔板,加体积分数为20%小牛血清的DEME培养液培养24 h,贴壁后换用体积分数为0.5%小牛血清的DEME培养液再培养24 h,然后按下列分组加入不同药物进行实验。(1)对照组:只加PBS;(2)HCY组0.1 mmol.L-1 HCY;(3)L-精氨酸组:10 mmol.L-1 L-精氨酸;(4)TAU组:10 mmol.L-1牛磺酸;(5)HCY+L-Arg, 0.1 mmol.L-1 HCY+5,10, 20 mmol.L-1L-精氨酸;(6)HCY+TAU, 0.1 mmol.L-1 HCY+5,10,20 mmol.L-1牛磺酸;(7)HCY+L-arg+TAU:0.1 mmol.L-1 HCY+5,10 mmol.L-1 L-精氨酸+5,10 mmol.L-1牛磺酸。同时加入37 kBq 3H-TdR培养24 h后加入冷PBS终止反应。在Millipore上经微孔滤膜(0.25 μm)收集并洗净细胞,并用100 g.L-1三氯醋酸处理,滤膜置于闪烁瓶中,加入闪烁液,在液体闪烁计数仪上测量3H的放射活性。
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1.3 材料
SD大鼠由北京医科大学动物实验中心提供;HCY,L-精氨酸,牛磺酸均为Sigma公司产品,3H-TdR购自中国原子能研究所,其余试剂均为国产分析纯。
1.4 统计学处理
每次双平行管操作,实验重复3次,实验数据以
±s表示;one-way ANOVA和组间q检验作统计学处理。2 结果
0.1 mmol.L-1 HCY可使培养的兔VSMC 3H-TdR掺入增加5.7倍[control:(46±10)×10-3 pmol vs HCY:(310±48)×10-3 pmol, P<0.01],而单纯用L-精氨酸及牛磺酸对VSMC 3H-TdR掺入无影响[control:(46±10)×10-3 pmol vs L-精氨酸:(46±8)×10-3 pmol或牛磺酸(47±6)×10-3 pmol, P<0.05], 但是它们可呈剂量依赖性地抑制HCY诱导的VSMC增殖。5, 10, 20 mmol.L-1 L-精氨酸可分别使HCY诱导的VSMC 3H-TdR掺入降低11%, 35%, 48% (P<0.01); 5,10,20 mmol.L-1牛磺酸可分别使HCY诱导的VSMC 3H-TdR掺入降低11%, 47%, 54% (P<0.01，表1)。合用牛磺酸+L-精氨酸(5, 10 mmol.L-1)可分别使HCY诱导的VSMC 3H-TdR掺入降低59%和65%(P<0.01);合用牛磺酸+L-精氨酸对VSMC增殖的抑制效应大于单纯应用L-精氨酸及牛磺酸组(P<0.01，表1) 。
, http://www.100md.com
表1 牛磺酸和L-精氨酸对HCY诱导的VSMC增殖的影响
Table 1 The influence of L-arginine and taurine on HCY-induced VSMC proliferation c(L-Arg
or TAU)
/mmol.L-1
n(3H-TdR incorporation)/fmol
HCY
HCY+L-Arg
HCY+TAU
, http://www.100md.com HCY+L-
Arg+TAU
5
310±48
276±47
275±45
126±29**##
10
310±48
201±49**
164±37**
108±34**＃
, http://www.100md.com
20
310±48
160±38**
144±47**
TAU, taurine; HCY， 0.01 mmol.L-1, ** P<0.01, vs HCY; # P<0.05, ## P<0.01, vs HCY+L-ARG or HCY+TAU.
3 讨论
HCY是甲硫氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸。VSMC增殖是动脉粥样硬化的一个主要病理特征。Tsai等[4]报道HCY可通过MAPK、核内癌基因和细胞周期调控蛋白信息传导途径刺激VSMC增殖。此外,大量的文献显示,牛磺酸和L-精氨酸有抑制VSMC增殖的作用,因此,本工作观察了牛磺酸及L-精氨酸对HCY诱导的VSMC增殖的抑制作用。
, http://www.100md.com
我们首次发现L-精氨酸及牛磺酸可呈剂量依赖性地抑制HCY诱导的VSMC增殖。有关L-精氨酸及牛磺酸抑制HCY诱导VSMC增殖的机制尚不清楚。L-精氨酸是一种碱性氨基酸,它是NO合成的前体,可通过NO抑制VSMC增殖、扩张血管、抑制血小板聚集。有人报道,NO与HCY作用形成巯基亚硝酸盐,后者可扩张血管,抑制血小板聚集[5]。牛磺酸也是一种含硫氨基酸,它具有稳定细胞膜,调节钙稳态,抑制VSMC增殖等多种生物学效应[6，7]。已有文献报道,牛磺酸可抑制内皮素,血管紧张素Ⅱ等多种因素引起的VSMC增殖[7]。
混合应用牛磺酸和L-精氨酸具有协同或叠加抑制作用，这与我们在内皮剥脱模型上的研究结果类似。L-精氨酸和牛磺酸均是机体的内源性物质,即使补充很大剂量,亦无毒副作用;且均是小分子物质,无抗原性,各种途径给药均可,且价廉易得。因此,探讨L-精氨酸、牛磺酸及其混合液抑制HCY诱导VSMC增殖的机制,以及对动脉粥样硬化的治疗是非常有价值的,值得深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Harker LA， Ross R, Slichter ST， et al. Homocysteine-induced arterosclerosis. The role of endothelial cell injury and platelet response in its genesis. J Clin Invest, 1976,58:713-741
2 Velend PM, Refsum H. Plasma homocysteine, a risk for vascular disease:Plasma levels in health, disease and drug therapy. J Lab Med, 1989, 114:473-501
3 Malinow MR. Hyperhomocyst(e)inema: a common and easily reversible risk factor occlusive atherosclerosis. Circulation, 1990, 81:2004-2006
, 百拇医药
4 Tsai JC, Perrele MA, Yoshizumi M, et al. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6369-6374
5 Dalton ML, Gadson PF, Wrenn RW. Homocysteine signal cascade: production of phospholipids, activation of protein kinase C, and the induction of c-fos and c-myb in smooth cells. FASEB J, 1997, 11:701-711
6 Huxtable RJ. Physiological action of taurine. Physiol Rev, 1992, 72:101-163
7 牛大地,张居馨,迟学栋，等.牛磺酸抑制大鼠平滑肌细胞增殖.北京医科大学学报, 1993,24:225-227
(1998-08-27收稿), 百拇医药