胰岛素毫微球肺部给药对正常大鼠的降血糖作用
作者：沈赞聪 张强 魏树礼
单位：北京医科大学药剂研究室，北京 100083
关键词：胰岛素；投药和剂量；微球体；血糖；药物作用；给药；呼吸
北京医科大学学报990515 摘 要 目的：研究胰岛素毫微球(insulin-loaded nanoparticles, INS-NP)经大鼠肺部给药后的降血糖作用。方法：建立大鼠肺部给药的动物模型，通过葡萄糖氧化酶法测定血糖质量浓度来评价INS-NP 经肺部给药后对大鼠的降血糖作用。结果：大鼠肺部分别给与5、10、20 u.kg-1的INS-NP，以血糖下降至给药前的70%以下所持续的时间(duration below 70% level, DBL70%)为考察指标，5u.kg-1的INS-NP的DBL70%与其对照溶液相近，而10、20 u.kg-1的INS-NP 的DBL70%均明显大于各自的对照溶液。INS-NP肺部给药的相对药理生物利用度达到59.2%。结论：与胰岛素溶液相比，INS-NP经大鼠肺部给药后能显著延长其血糖下降的时间。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R977.15
Hypoglycemic effects of insulin-loaded nanoparticles by
pulmonary delivery to normal rats
SHEN Zan-Cong#， ZHANG Qiang，WEI Shu-Li
(# Department of Pharmaceutics，Beijing Medical University，Beijing 100083)
MeSH Insulin/admin Microspheres Blood glucose/drug eff Drug administration, respiratory routes
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective：To investigate the hypoglycemic effects of insulin-loaded nanoparticles (INS-NP) after pulmonary delivery to rats. Methods：The pulmonary delivery model was established in normal rats. Blood glucose levels were measured using glucose oxidase method (GOD) to evaluate the hypoglycemic effects .Results：After 5， 10， and 20 u.kg-1 of INS-NP were administered from the lung，The duration below 70% level (DBL70%) of 5 u.kg-1 INS-NP was approximately the same as that of its control solution，while 10 u.kg-1 and 20 u.kg-1 INS-NP had greater DBL70% values than their control (INS-SOL) .The relative pharmacological bioavailability of INS-NP reached 59.2%. Conclusion： Pulmonary delivery of INS-NP to rats can significantly prolong the duration of hypoglycemic effect.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:436-438)
目前，胰岛素(Insulin，INS)的非注射给药途径的研究引起人们的广泛关注，由于口服给药研究没有重大的突破，肺部给药途径已经成为人们研究的新焦点[1]。肺部具有吸收表面积大，肽类水解酶活性低，药物容易穿透等特点，为INS等蛋白多肽药物的吸收提供了良好的生理环境。目前国外INS肺部给药制剂研究已进入了临床试验阶段，如INS的气雾剂、喷雾剂、及粉末吸入剂等[2～4]，本文尝试以氰基丙烯酸正丁酯毫微球为载体，以血糖为考察指标，研究INS毫微球(insulin-nanoparticles，INS-NP)经大鼠肺部给药后的降血糖作用，为以后开发INS肺部给药制剂打下基础。此项研究国内外尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
, 百拇医药
INS(徐州生化制药有限公司，26.3 u.mg-1)；氰基丙烯酸正丁酯(BCA)购自西安化工研究所；戊巴比妥钠购自中国医药公司北京采购供应站；乙腈为色谱纯，INS-NP样品根据文献[5]方法制备，浓度分别为10、20、40 u.ml-1，其它试剂均为分析纯。
美国Beckman 公司超速离心机；美国Brookhaven Instruments 公司粒度分析仪；美国AST公司高效液相色谱仪，紫外检测器；大连伊利特公司C18反相柱(250 mm×4.6 mm内径，5 μm)。
SD大鼠由本校实验动物中心提供。
1.2 实验方法
INS-NP的粒度测定：取INS-NP样品适量，用水稀释后在粒度分析仪上进行测定，经动态光散射处理软件处理，记录并打印测定结果。
, 百拇医药
INS-NP包封率的测定：采用反相高效液相色谱法，流动相为乙腈∶磷酸缓冲液(pH 3.0)体积比为73∶27，检测波长为276 nm，流速1.0 ml.min-1。INS-NP经超速离心35 000 r.min-1 30 min后，取上清液及反应前的INS总液各25 μl进样，从两者在色谱图上的峰高求出未包封的INS的量Xf和INS的总量Xt，以下式计算INS-NP的包封率：
包封率＝(Xt-Xf)/Xt×100%
血糖值测定：采用葡萄糖氧化酶法。酶试剂的配制及标准曲线的建立按文献[6]方法进行。标准曲线方程为：A＝0.3X+0.0023 (r=0.9999)，其中X为血糖水平(g.L-1)，A为505 nm处吸收度测定值。测定时待血样凝固后离心(3 000 r.min-1，15 min)，精密吸取血清20 μl，加酶试剂2.0 ml，按标准曲线制作方法操作，用上述标准曲线计算血糖值。经测定葡萄糖在血清中的高、中、低3种质量浓度的平均回收率分别为101.8%±2.4%，101.2%±0.9%，95.8%±2.2%(n=5)。
, 百拇医药
INS-NP肺部给药降血糖实验：雄性SD大鼠，体重(250±50) g，随机分组，每组5～6只，实验前禁食12 h。动物经腹腔注射戊巴比妥钠40 mg.kg-1进行麻醉，麻醉后将动物仰卧固定，手术暴露出气管，往气管内每200 g体重注入药液100 μl，给药时使动物与水平成90°并维持30 s后，再与水平成30°放置。动物能自主呼吸。按上法分别给动物不同浓度的INS-NP及INS-SOL，另皮下注射5 u.kg-1 INS-SOL作对照，以求算INS-NP的相对药理生物利用度。在不同时间间隔于大鼠尾尖取血0.2 ml，离心取血清20 μl ，按前法测定血糖值。
2 结果
INS-NP的平均粒径为254.7 nm，粒径的多分散性为0.064。INS-NP的平均包封率为79.1%±0.20% (n=3)。
, 百拇医药
正常大鼠肺部给药5、10、20 u.kg-1的INS-SOL和INS-NP，与空白对照相比，均表现出明显的降血糖作用(表1、2)。 以血糖降低至给药前的70%所持续的时间(duration below 70% level , DBL70%)为考察指标，5、10、20 u.kg-1的INS-NP的DBL70%分别为6.7 h，12.7 h，18.1 h；而相应剂量的INS-SOL的DBL70%分别为6.5、6.7、10.6 h。5 u.kg-1的INS-NP的DBL70%与其对照的INS-SOL相近，而10、20 u.kg-1 INS-NP的DBL70%分别比各自对照溶液大6.0 h和7.5 h，随着剂量的增加，INS-NP的长效作用更加显著。
, 百拇医药 表1 不同剂量的INS-SOL经大鼠肺部给药后对血糖变化的影响(%，
±s)
Table 1 Blood glucose level changes after pulmonary delivery of different doses of INS-SOL to normal rats (%，±s) t/h
Control
5 u.kg-1
10 u.kg-1
, 百拇医药
20 u.kg-1
0
100.0
100.0
100.0
100.0
1
98.7±5.7
70±9
69±7**
66.2±4.7**
, 百拇医药
2
96.2±3.5
45±9***
41±9**
23.8±4.6***
4
99.6±2.1
22±8***
20±9**
6.7±2.2***
6
, 百拇医药
93.3±4.2
39±17**
40±8**
4.3±1.6***
8
82.6±6.5
80±8
74±11
20.2±13.8***
12
72.3±9.3
, http://www.100md.com
/
/
74.4±9.2
n=5-6； control， PBS (pH=7.0) without insulin； * P<0.05,** P<0.01, *** P<0.001， vs control.表2 不同剂量的INS-NP经大鼠肺部给药后对血糖变化的影响(%,±s)
Table 2 Blood glucose level changes after pulmonary delivery of different doses of INS-NP to normal rats (%,±s) t/h
, 百拇医药
Control
5 u.kg-1
10 u.kg-1
20 u.kg-1
0
100.0
100.0
100.0
100.0
2
96.2±3.5
, 百拇医药
68±10**
47±12**
51±13**
4
99.6±2.1
47±10***
30±10***
28±9***
8
82.6±6.5
69±11
, 百拇医药
40±13***
14±13***
12
72.3±9.3
83±12
62±14*
25±19***
16
/
/
79±17
44±16***
, 百拇医药
24
/
/
/
106±16
n=5-6； control， PBS (pH=7.0) without insulin； * P<0.05,** P<0.01, *** P<0.001， vs control. 采用梯形法计算血糖曲线上面积(area over the curve，AOC)来评价INS-NP的药理生物利用度(pharmacological bioavailability)[7]，以皮下注射5 u.kg-1 INS-SOL作为对照(表3)，结果表明INS-NP肺部给药的相对生物利用度达到59.2% 。
, 百拇医药
表3 5 u.kg-1 INS-NP 经大鼠肺部给药及皮下注射后对血糖水平的影响(%，±s)
Table 3 Blood glucose changes after pulmonary and subcutaneous administrations of 5 u.kg-1 INS-NP to normal rats. (%，±s) t/h
Control
INS-NP 5 u.kg-1
i.t.
, http://www.100md.com
s.c.
0
100.0
100.0
100.0
2
96.2±3.5
68±10
45.1±4.8
4
99.6±2.1
47±10
26.2±2.3
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6
93.3±4.2
51±13
23.5±2.6
8
82.6±6.5
69±11
24.8±5.1
12
72.3±9.3
83±12
74.6±4.1
n=5; i.t., intratracheal administration; s.c., subcutaneous injection; control, PBS (pH=7.0) i.t. without insulin.
, 百拇医药
3 讨论
本研究表明INS-NP确实能延长大鼠血糖下降的时间，以20 u.kg-1的剂量给药后16 h，血糖仍处于较低水平(低于50%)。这可以从两个方面的得到解释：一方面，以氰基丙烯酸正丁酯为材料制备出的INS-NP，INS被吸附或包裹到载体上，其释放受到了阻滞，表现出缓释作用[7]。另一方面，小于1 μm的粒子在肺部被巨噬细胞吞噬而进入淋巴组织，从而延长了INS在体内的作用时间。本文制备的INS-NP粒径细小(254.7 nm)，粒径分布均匀，不易沉积在肺深处引起其它副作用。
目前国外开发的INS肺部给药制剂多偏重于速释方面的研究，近来Edwards等报道以PLGA为载体制备的INS PLGA缓释微球，在正常大鼠体内的降血糖时间能长达96 h之多[8]。本文制备的以氰基丙烯酸树酯为载体的INS-NP降血糖作用时间达到12 h以上，也有显著的缓释作用。氰基丙烯酸树酯曾经作为口服INS载体研究[5、7]，但尚未见其应用于肺部给药方面的报道。
, 百拇医药
Edwards等报道的INS生物利用度达到98.5%[8]，本文制备的INS-NP经肺部给药的生物利用度也接近60%，可见INS在肺部的吸收是十分显著的。相对于生物利用度很低(<1%)的口服给药途径而言，INS的肺部给药途径的研究有着良好的前景。
注：天然药物与仿生药物国家重点实验室资助课题。
参考文献
1 Robert F. Drug delivery takes a deep breath. Science, 1997，277: 1199-1200
2 Beth LL, Angeliki G, Adams GK. Preliminary study of the efficacy of insulin aerosol delivered by oral inhalation in diabetic patients. JAMA,1993, 269(16): 2106-2109
, 百拇医药
3 Jenkle JH, Karlberg BE. intrapulmonary administration of insulin to healthy volunteers. J Intern Med, 1996，240: 93-98
4 Robert AG, Sherwyn LS, Michael H, et al. Pharmacological reproducibility of inhaled human insulin premeal dosing in patients with type 2 diabetes mellitus (NIDDM). Diabetes, 1998，47(Suppl): 388
5 Damge C, Vranckx H, Balschmidt P， et al. Poly(alkylcyanoacry-
late)nanospheres for oral administration of insulin. J Pharm Sci, 1997, 86(12): 1403-1409
, 百拇医药
6 徐叔云，卞如濂，陈 修，主编. 药理实验方法学. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1991.1272-1274
7 张 强，丁继军，魏树礼，等. 口服胰岛素毫微球的特性及降血糖作用. 北京医科大学学报, 1998，30(3): 239-241
8 Edwards DA, Hanes J,Caponetti G， et al. Large porous particles for pulmonary drug delivery. Science, 1997，276: 1868-1871
(1998-11-17收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学药剂研究室，北京 100083
关键词：胰岛素；投药和剂量；微球体；血糖；药物作用；给药；呼吸
北京医科大学学报990515 摘 要 目的：研究胰岛素毫微球(insulin-loaded nanoparticles, INS-NP)经大鼠肺部给药后的降血糖作用。方法：建立大鼠肺部给药的动物模型，通过葡萄糖氧化酶法测定血糖质量浓度来评价INS-NP 经肺部给药后对大鼠的降血糖作用。结果：大鼠肺部分别给与5、10、20 u.kg-1的INS-NP，以血糖下降至给药前的70%以下所持续的时间(duration below 70% level, DBL70%)为考察指标，5u.kg-1的INS-NP的DBL70%与其对照溶液相近，而10、20 u.kg-1的INS-NP 的DBL70%均明显大于各自的对照溶液。INS-NP肺部给药的相对药理生物利用度达到59.2%。结论：与胰岛素溶液相比，INS-NP经大鼠肺部给药后能显著延长其血糖下降的时间。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R977.15
Hypoglycemic effects of insulin-loaded nanoparticles by
pulmonary delivery to normal rats
SHEN Zan-Cong#， ZHANG Qiang，WEI Shu-Li
(# Department of Pharmaceutics，Beijing Medical University，Beijing 100083)
MeSH Insulin/admin Microspheres Blood glucose/drug eff Drug administration, respiratory routes
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective：To investigate the hypoglycemic effects of insulin-loaded nanoparticles (INS-NP) after pulmonary delivery to rats. Methods：The pulmonary delivery model was established in normal rats. Blood glucose levels were measured using glucose oxidase method (GOD) to evaluate the hypoglycemic effects .Results：After 5， 10， and 20 u.kg-1 of INS-NP were administered from the lung，The duration below 70% level (DBL70%) of 5 u.kg-1 INS-NP was approximately the same as that of its control solution，while 10 u.kg-1 and 20 u.kg-1 INS-NP had greater DBL70% values than their control (INS-SOL) .The relative pharmacological bioavailability of INS-NP reached 59.2%. Conclusion： Pulmonary delivery of INS-NP to rats can significantly prolong the duration of hypoglycemic effect.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:436-438)
目前，胰岛素(Insulin，INS)的非注射给药途径的研究引起人们的广泛关注，由于口服给药研究没有重大的突破，肺部给药途径已经成为人们研究的新焦点[1]。肺部具有吸收表面积大，肽类水解酶活性低，药物容易穿透等特点，为INS等蛋白多肽药物的吸收提供了良好的生理环境。目前国外INS肺部给药制剂研究已进入了临床试验阶段，如INS的气雾剂、喷雾剂、及粉末吸入剂等[2～4]，本文尝试以氰基丙烯酸正丁酯毫微球为载体，以血糖为考察指标，研究INS毫微球(insulin-nanoparticles，INS-NP)经大鼠肺部给药后的降血糖作用，为以后开发INS肺部给药制剂打下基础。此项研究国内外尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
, 百拇医药
INS(徐州生化制药有限公司，26.3 u.mg-1)；氰基丙烯酸正丁酯(BCA)购自西安化工研究所；戊巴比妥钠购自中国医药公司北京采购供应站；乙腈为色谱纯，INS-NP样品根据文献[5]方法制备，浓度分别为10、20、40 u.ml-1，其它试剂均为分析纯。
美国Beckman 公司超速离心机；美国Brookhaven Instruments 公司粒度分析仪；美国AST公司高效液相色谱仪，紫外检测器；大连伊利特公司C18反相柱(250 mm×4.6 mm内径，5 μm)。
SD大鼠由本校实验动物中心提供。
1.2 实验方法
INS-NP的粒度测定：取INS-NP样品适量，用水稀释后在粒度分析仪上进行测定，经动态光散射处理软件处理，记录并打印测定结果。
, 百拇医药
INS-NP包封率的测定：采用反相高效液相色谱法，流动相为乙腈∶磷酸缓冲液(pH 3.0)体积比为73∶27，检测波长为276 nm，流速1.0 ml.min-1。INS-NP经超速离心35 000 r.min-1 30 min后，取上清液及反应前的INS总液各25 μl进样，从两者在色谱图上的峰高求出未包封的INS的量Xf和INS的总量Xt，以下式计算INS-NP的包封率：
包封率＝(Xt-Xf)/Xt×100%
血糖值测定：采用葡萄糖氧化酶法。酶试剂的配制及标准曲线的建立按文献[6]方法进行。标准曲线方程为：A＝0.3X+0.0023 (r=0.9999)，其中X为血糖水平(g.L-1)，A为505 nm处吸收度测定值。测定时待血样凝固后离心(3 000 r.min-1，15 min)，精密吸取血清20 μl，加酶试剂2.0 ml，按标准曲线制作方法操作，用上述标准曲线计算血糖值。经测定葡萄糖在血清中的高、中、低3种质量浓度的平均回收率分别为101.8%±2.4%，101.2%±0.9%，95.8%±2.2%(n=5)。
, 百拇医药
INS-NP肺部给药降血糖实验：雄性SD大鼠，体重(250±50) g，随机分组，每组5～6只，实验前禁食12 h。动物经腹腔注射戊巴比妥钠40 mg.kg-1进行麻醉，麻醉后将动物仰卧固定，手术暴露出气管，往气管内每200 g体重注入药液100 μl，给药时使动物与水平成90°并维持30 s后，再与水平成30°放置。动物能自主呼吸。按上法分别给动物不同浓度的INS-NP及INS-SOL，另皮下注射5 u.kg-1 INS-SOL作对照，以求算INS-NP的相对药理生物利用度。在不同时间间隔于大鼠尾尖取血0.2 ml，离心取血清20 μl ，按前法测定血糖值。
2 结果
INS-NP的平均粒径为254.7 nm，粒径的多分散性为0.064。INS-NP的平均包封率为79.1%±0.20% (n=3)。
, 百拇医药
正常大鼠肺部给药5、10、20 u.kg-1的INS-SOL和INS-NP，与空白对照相比，均表现出明显的降血糖作用(表1、2)。 以血糖降低至给药前的70%所持续的时间(duration below 70% level , DBL70%)为考察指标，5、10、20 u.kg-1的INS-NP的DBL70%分别为6.7 h，12.7 h，18.1 h；而相应剂量的INS-SOL的DBL70%分别为6.5、6.7、10.6 h。5 u.kg-1的INS-NP的DBL70%与其对照的INS-SOL相近，而10、20 u.kg-1 INS-NP的DBL70%分别比各自对照溶液大6.0 h和7.5 h，随着剂量的增加，INS-NP的长效作用更加显著。
, 百拇医药 表1 不同剂量的INS-SOL经大鼠肺部给药后对血糖变化的影响(%，
±s)Table 1 Blood glucose level changes after pulmonary delivery of different doses of INS-SOL to normal rats (%，
±s) t/hControl
5 u.kg-1
10 u.kg-1
, 百拇医药
20 u.kg-1
0
100.0
100.0
100.0
100.0
1
98.7±5.7
70±9
69±7**
66.2±4.7**
, 百拇医药
2
96.2±3.5
45±9***
41±9**
23.8±4.6***
4
99.6±2.1
22±8***
20±9**
6.7±2.2***
6
, 百拇医药
93.3±4.2
39±17**
40±8**
4.3±1.6***
8
82.6±6.5
80±8
74±11
20.2±13.8***
12
72.3±9.3
, http://www.100md.com
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74.4±9.2
n=5-6； control， PBS (pH=7.0) without insulin； * P<0.05,** P<0.01, *** P<0.001， vs control.表2 不同剂量的INS-NP经大鼠肺部给药后对血糖变化的影响(%,
±s)Table 2 Blood glucose level changes after pulmonary delivery of different doses of INS-NP to normal rats (%,
±s) t/h, 百拇医药
Control
5 u.kg-1
10 u.kg-1
20 u.kg-1
0
100.0
100.0
100.0
100.0
2
96.2±3.5
, 百拇医药
68±10**
47±12**
51±13**
4
99.6±2.1
47±10***
30±10***
28±9***
8
82.6±6.5
69±11
, 百拇医药
40±13***
14±13***
12
72.3±9.3
83±12
62±14*
25±19***
16
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79±17
44±16***
, 百拇医药
24
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106±16
n=5-6； control， PBS (pH=7.0) without insulin； * P<0.05,** P<0.01, *** P<0.001， vs control. 采用梯形法计算血糖曲线上面积(area over the curve，AOC)来评价INS-NP的药理生物利用度(pharmacological bioavailability)[7]，以皮下注射5 u.kg-1 INS-SOL作为对照(表3)，结果表明INS-NP肺部给药的相对生物利用度达到59.2% 。
, 百拇医药
表3 5 u.kg-1 INS-NP 经大鼠肺部给药及皮下注射后对血糖水平的影响(%，
±s)Table 3 Blood glucose changes after pulmonary and subcutaneous administrations of 5 u.kg-1 INS-NP to normal rats. (%，
±s) t/hControl
INS-NP 5 u.kg-1
i.t.
, http://www.100md.com
s.c.
0
100.0
100.0
100.0
2
96.2±3.5
68±10
45.1±4.8
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99.6±2.1
47±10
26.2±2.3
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6
93.3±4.2
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23.5±2.6
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82.6±6.5
69±11
24.8±5.1
12
72.3±9.3
83±12
74.6±4.1
n=5; i.t., intratracheal administration; s.c., subcutaneous injection; control, PBS (pH=7.0) i.t. without insulin.
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3 讨论
本研究表明INS-NP确实能延长大鼠血糖下降的时间，以20 u.kg-1的剂量给药后16 h，血糖仍处于较低水平(低于50%)。这可以从两个方面的得到解释：一方面，以氰基丙烯酸正丁酯为材料制备出的INS-NP，INS被吸附或包裹到载体上，其释放受到了阻滞，表现出缓释作用[7]。另一方面，小于1 μm的粒子在肺部被巨噬细胞吞噬而进入淋巴组织，从而延长了INS在体内的作用时间。本文制备的INS-NP粒径细小(254.7 nm)，粒径分布均匀，不易沉积在肺深处引起其它副作用。
目前国外开发的INS肺部给药制剂多偏重于速释方面的研究，近来Edwards等报道以PLGA为载体制备的INS PLGA缓释微球，在正常大鼠体内的降血糖时间能长达96 h之多[8]。本文制备的以氰基丙烯酸树酯为载体的INS-NP降血糖作用时间达到12 h以上，也有显著的缓释作用。氰基丙烯酸树酯曾经作为口服INS载体研究[5、7]，但尚未见其应用于肺部给药方面的报道。
, 百拇医药
Edwards等报道的INS生物利用度达到98.5%[8]，本文制备的INS-NP经肺部给药的生物利用度也接近60%，可见INS在肺部的吸收是十分显著的。相对于生物利用度很低(<1%)的口服给药途径而言，INS的肺部给药途径的研究有着良好的前景。
注：天然药物与仿生药物国家重点实验室资助课题。
参考文献
1 Robert F. Drug delivery takes a deep breath. Science, 1997，277: 1199-1200
2 Beth LL, Angeliki G, Adams GK. Preliminary study of the efficacy of insulin aerosol delivered by oral inhalation in diabetic patients. JAMA,1993, 269(16): 2106-2109
, 百拇医药
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(1998-11-17收稿), 百拇医药