EB病毒与原发性鼻咽部B细胞性淋巴瘤有关与继发性者无关高子芬
作者：Faith C.S. Ho Alex C.L.Chan Qian Tao Ramond Liang Gopesh Srivastava
单位：高子芬 北京医科大学病理学系，北京 100083；Faith C.S. Ho Alex C.L.Chan Qian Tao Ramond Liang Gopesh Srivastava 香港大学
关键词：淋巴瘤；B细胞；病因学；爱泼斯坦-巴尔病毒；致病力；爱泼斯坦-巴尔病毒；分离和提纯；免疫组织化学；原位杂交
北京医科大学学报990510 摘 要 目的：对19例鼻咽部B细胞性恶性淋巴瘤与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染的相关性进行研究。方法：利用免疫组织化学及原位杂交方法对EBV进行检测，并用免疫组化及原位杂交双染法标记肿瘤细胞，以鉴定EBV阳性的细胞为B淋巴瘤细胞。结果：EBV编码的小mRNA探针(EBER)原位杂交显示，8例原发性鼻咽部B细胞性恶性淋巴瘤中3例绝大多数肿瘤细胞呈阳性表达，1例潜在性膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP-1)阳性。而11例继发性鼻咽部B细胞性恶性淋巴瘤EBER全部为阴性。全部病例进行了LMP-1检测，除1例原发者，全部阴性。 利用EBER-ISH(EBER原位杂交)和免疫组化CD 标记物进行双标记染色证实，EBER和LMP-1阳性细胞为CD 20阳性，CD 45RO阴性。鼻咽部原发性B细胞性恶性淋巴瘤EBV表达4/8，而继发者为0/11。结论：EBV与鼻咽部原发性B细胞恶性淋巴瘤有较高的相关性，而与继发性者无关。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R739.6
Epstein-Barr virus is associated with primary but not secondary nasal B lymphoma
GAO Zi-Fen＃, Faith C.S.HO, Alex C.L.CHAN，Qian TAO, Ramond LIANG, Gopesh SRIVASTAVA
(#Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Lymphoma, B-cell/etiol Epstein-Barr virus/pathogen Epstein-Barr virus/isol Immunohistochemistry In situ hybridization
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective： To study the relationship between nasopharyngeal B-cell lymphoma and Epstein-Barr virus(EBV) infection. Methods： Detection of EBV RNA and latent membrane protein 1(LMP-1) was conducted by immunohistochemistry and in situ hybridization(ISH), using ISH for EBER combined with immunohistochemistry for LMP-1 and CD markers, in order to determine whether the EBV positive cells were tumor cells. Results： 19 nasopharyngeal B lymphoma patients were investigated for EBV, ISH for EBER showed signal over virtually all the tumor cell nuclei in the 3/8 primary nasopharyngeal tumors, 1/8 primary case was EBER negative due to RNA degradation but was LMP1 positive. However, all the 11 secondary nasopharyngeal tumors were EBER negative whilst ISH for β-actin mRNA was positive for all these cases. Using ISH for EBER combined with immunohistochemistry for LMP1 and CD markers, the predominant lineage of EBV+ cells was identified as CD20+CD45RO- in one EBER+ case and one LMP1 case. Our results revealed that EBV was present in the tumor cells of 4/8 primary nasal B-cell lymphomas but not in those of secondary nasopharyngeal tumors. Conclusion:Our findings suggest that EBV is associated with the pathogenesis of primary, but not secondary nasopharyngeal B-cell lymphoma.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:418-421)
EB病毒可以导致传染性单核细胞增生症和组织细胞坏死性淋巴结炎，与鼻咽癌和一部分胃癌也有较强的相关性[1]。而且EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与某些类型的淋巴造血系统恶性肿瘤有关。在地方性Burkitt淋巴瘤的发病中100%病例EBV阳性，在非地方性Burkitt淋巴瘤中EBV的表达仅为5%～20%。近年来由于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的感染，艾滋病病人伴有淋巴瘤时EBV的检出率为40%。在西方国家霍奇金病的R-S细胞中50%的病例EBV阳性[2]，在我国成人检出率约40%，而在儿童将近100%[3，4]。近来的研究证实鼻咽部T/NK型淋巴瘤与EBV有很高的相关性[5]。
不同的研究结果显示T/NK型淋巴瘤与EBV几乎有100%的相关性[5]，然而EBV与鼻咽B细胞恶性淋巴瘤的相关性一直不清，报告的研究结果从1例/10例到2例/3例[6]。我们研究了19例鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与EBV感染的情况，显示原发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与继发性有显著的不同。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病例收集
我们选择了香港大学病理系存档的1985～1994年10年间的鼻腔、鼻咽部和鼻窦部位的19例鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤(表1)。全部病例按照Kiel分型分类。例1和例3以前曾报道过[5]。所有病例均有石蜡包埋组织块，4个病例同时有冰冻组织。
表1 临床特点、肿瘤部位和EBV原位杂交
Table 1 Summary of clinical feature,site of involvement and in situ hybridization for EBV Case no.
Sex/Age
Site of tumor
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Diagnosis
Neoplastic cells
EBER+
β-actin
Primary
1
F/66
NP@
ML
IB
-*
-
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M/52
NP@+T LN L
ML
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ML
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ND
4
M/3
NP@
ML
B
95%
ND
5
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ML
BL
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M/61
N@ +LN
ML
P
90%
ND
7
F/62
NP@
ML
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LC
-
+
8
M/59
NP@ +LN
ML
CB
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+
Secondary
9
M/63
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NP@ +T LN S
ML
LB
-
+
10
M/70
NP@ +T LN
ML
CB
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+
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M/85
NP@
ML
CB
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M/60
NP@
ML
LC
-
+
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13
M/71
NP@
ML
LP
-
+
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F/26
NP@
ML
LP
-
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+
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M/36
NS@
ML
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+
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M/88
NP@+ Palate
ML
CB
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-
+
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F/61
NP@ +T N LN
ML
CB
-
+
18
M/53
NP@ +LN T
ML
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CB-CC
-
+
19
M/69
NP@ +LN
ML
IB
-
+
@，biopsy site； *，case with RNA degradation but LMP-1(+)； %，refers to total tumor cells； +，positive； -，negtive， F，female； M，male； N，nose； NP，nesopharynx； T，tosil； LN，lymph node； NS，nasal sinus； S，spleen； ML，malignant lymphoma； IB，immunoblastic； LB，lymphoblastic； CB，centroblastic； B，Burkitt's； BL，Burkitt like； CC，centrocytic； LC，lymphocytic； P，plasmacytoma； LP，lymphoplasmacytic； ND，not done。1.2 原位杂交(in situ hybridization, ISH)
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EBV编码的RNA(EBV encorded RNA, EBER)(YO17，Dako)和BHLF-1(Y018)为氢化荧光素异硫氰浓盐(fluorescein isothiocyanates, FITC)标记的寡核苷酸探针。EBER阴性病例用β-actin mRNA(X3302,Dako)检测组织RNA的存在情况。ISH方法参照Dako提供的方法进行，用3 mg.L-1的蛋白酶K200 μl消化切片，在37℃下杂交2 h，BCIP/NBT显色，阳性信号为细胞核呈蓝紫色，每组实验设EBV感染的细胞系B95-8为阳性对照，阴性为TBS(tris-NaCl buffer solution)取代探针。甲基绿复染核。
1.3 免疫组化
应用单克隆抗体CSI-4 检测LMP-1[体积比(下同)1∶10]、PE2检测EBNA2(1∶5)和BZ1检测ZEBRA(1∶10)。抗体为M. Rowe(Birmingham UK)馈赠。用SABC法在石蜡切片上检测EBV蛋白产物，DAB显色。APAAP法进行冰冻切片免疫组化染色。石蜡切片进行潜在膜蛋白(Latent memberane protein 1,LMP-1)检测需经过0.01 mol.L-1的枸橼酸三钠的微波预处理。
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1.4 双标记染色
先用SABC法进行UCHL-1(DaKo 1∶100)和L26(DaKo 1∶100)的染色，进行瘤细胞的克隆标记，然后进行EBV-ISH双染，但不需复染核。
2 结果
2.1 临床特点和组织学分型
我们将全部病例根据肿瘤部位分成2组，即原发瘤组(例1～8)和继发瘤(例9～19)组。原发瘤组的定义是鼻咽部为肿瘤的首先累及部位，而继发性者是指鼻咽部为转移部位(原发瘤位于淋巴结或其他淋巴器官，转移至鼻咽部)。
临床情况见表1，其中14例男性，5例女性，平均年龄59岁(3～88岁)，性别和年龄有明显差异。19例病例有8例原发于鼻咽部(占42%)，累及部位有鼻腔(3例)和咽部(5例)，其中3例伴有颈部淋巴结的转移(第2、6、8例)，11例为继发性鼻咽部淋巴瘤，除1例位于鼻窦外，其余都位于鼻咽部，其中6例伴有其他淋巴器官和淋巴结的累及。
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19例中13例为高度恶性淋巴瘤，包括有免疫母细胞性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、中心母细胞性淋巴瘤、伯基特和伯基特样淋巴瘤。6例是低度恶性，包括有淋巴浆细胞样淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤(图1)。
图1 原发性浆细胞瘤 显示肿瘤细胞单一性，有浆细胞的分化，核偏位，中等量嗜硷性胞浆。细胞有轻到中度异型性。 HE×400
Figure 1 A case of nasal primary plasmacytoma showing monotonous population of cells with plasmacytic differentiation, eccentric nuclei, perinuclear hof and moderate amount of basophilic cytoplasm,the cells show mild to moderate degree of pleomorphism. HE×40
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2.2 原位杂交
在8例原发性鼻咽B细胞恶性淋巴瘤中3例肿瘤细胞EBER阳性(图2)，而所有继发性者均为阴性。所有阴性病例用β-actin探针进行原位杂交，除1例外均为阳性，证实石蜡包埋组织中RNA足以用原位杂交检测。在EBER+病例中，阳性信号位于胞核，约70%～95%的瘤细胞为阳性。EBER阳性细胞为中等到大细胞，单形或多形性核。并可见少数EBER阳性的小淋巴细胞(每个组织切片5个以下)。在2例原发性和5例继发性鼻咽B细胞恶性淋巴瘤瘤细胞EBER-，少数反应性淋巴细胞EBER+。所有病例BHLF1阴性。
图2 原发性浆细胞瘤 EBER原位杂交90%以上的肿瘤细胞核阳性。 ISH×200
Figure 2 ISH for EBER RNA in nasal primary plasmacytoma ，over 90% neoplastic cells show positive. ISH×200
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2.3 EBV蛋白表达
LMP-1单染在4例EBV阳性原发鼻咽部B细胞恶性淋巴瘤中1例阳性(例1)，继发性组均为阴性。阳性对照为已知LMP-1+的HD病例，R-S细胞为阳性细胞。EBNA2和ZEBRA两组病例均无表达，EBNA2阳性对照为Raji细胞系，ZEBRA阳性对照为B95-8细胞系。
2.4 EBV阳性病例的双标记结果
EBER原位杂交阳性病例进行了CD标记物(CD 20,CD 45RO)的免疫组化染色，绝大多数EBER阳性细胞CD20阳性(图3)，CD 45RO阴性。也可见少数EBER阳性细胞CD 20阴性(图4)，CD 45RO阳性，形态学上可以辨认出来是背景的小淋巴细胞，1例浆细胞瘤EBER阳性细胞CD 20阴性。
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图3 伯基特淋巴瘤 EBV-ISH和L 26免疫组织化学双染，EBV+/L26+阳性的肿瘤细胞占95%以上。 (ISH+IH)×400
Figure 3 ISH and IH double staining for Burkitt's lymphoma,showing more than 95% tumor cells EBV+/L26+. (ISH+IH)×400
图4 继发性中心母细胞性淋巴瘤 EBV-ISH和L 26免疫组织化学双染，L26阳性的肿瘤细胞EBER-, EBER+的小淋巴细胞是反应性T 淋巴细胞。 (ISH+IH)×400
Figure 4 ISH and IH double staining for secondary nasal B cell Lymphoma,showing L26+ tumor cells EBV(-),only a few EBV (+) small cells are reactive T lymhpomacyte. (ISH+IH)×40
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双染结果显示，几乎所有LMP-1+细胞均为CD20+，CD45RO-(表2)。
表2 原发性EBV阳性鼻咽B细胞淋巴瘤肿瘤细胞EBV基因表达和双标记结果
Table 2 EBV gene expression and double-staining identify the lineag of EBV+ tumor cells in primary EBV+ nasal B lymphoma Case no
ISH
IH
Double staining
EBER+cell
BHLF1
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LMP-1
ZEBRA
EBNA2
L26/EBV
UCHL1/EBV
1
-*
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+
NS
NS
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NS
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+/EBER+
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-/EBER+
-/EBER+
*，case with RNA degradation； +，positive； -，negative； %，refer to total tumor cells； NS，not satisfactory.
3 讨论
EBER原位杂交是检测肿瘤中EBV感染的很敏感的方法，并可用于福尔马林固定，石蜡包埋的组织，比敏感的PCR方法更具定位的优越性。我们的结果显示，19例鼻咽部B细胞恶性淋巴瘤4例EBER或LMP-1阳性，包括3例弥漫性大细胞淋巴瘤(免疫母细胞性，中心母细胞性和Burkitt淋巴瘤)和1例中等细胞性淋巴瘤(浆细胞瘤)。Weiss[7]报道的鼻窦B细胞性恶性淋巴瘤EBV40%阳性，与我们的报道相似，比John[6]报道的阳性率高。与几乎100%与EBV的相关的鼻咽部T/NK细胞淋巴瘤相比[8，9]，鼻咽部B细胞恶性淋巴瘤与EBV的相关性较低。双标记染色证实了EBV阳性细胞是肿瘤性细胞。3例EBER阳性病例均无LMP-1的表达，与地方性Burkitt淋巴瘤相似，是潜在性I型；1例有LMP-1表达无EBNA2表达是潜在性II型，此组研究与文献报道一致。有趣的是所有EBV阳性的病例均为原发性肿瘤(4/8例，50%)，而所有继发者EBV均为阴性。这个结果显示EBV与原发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤有较强的相关性，而与继发者无相关性，相似结果目前尚无报道。
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双标记染色我们发现大多数EBV阳性细胞显示CD 20阳性证实为肿瘤细胞，并非所有EBV+的细胞CD20表达，EBV+/CD20+的细胞约占EBV+细胞的80%，且所有EBV + 的细胞相似于从形态上辨认的肿瘤细胞，可以理解为EBV阳性的细胞有CD 标记物的丢失。
本文研究中，我们发现4例EBV+的病例中1例为原发于鼻腔的浆细胞瘤并伴有颈部淋巴结转移，但非多发性骨髓瘤。此例EBV+的肿瘤细胞大于70%，尽管EBV+的肿瘤细胞CD20阴性，但典型的组织学形态完全可以分型。复习文献显示6例EBV+的浆细胞瘤中，多数是移植后的、多发性髓外浆细胞瘤或多发性骨髓瘤[10，11]，1例曾经是HD，本次为浆细胞瘤[12]，所有病例均为非鼻咽部。
本文研究结果显示，原发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与EBV有关，但不如鼻咽T/NK与EBV相关性强，更重要的是我们的结果显示继发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与EBV无相关性。这一结果提示EBV在原发性和继发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤的发病上作用可能不同。
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注：香港大学Crucher foundation资助课题。
参考文献
1 Tokunaga M, Land CE, Uemura Y, et al. Epstein-Barr virus in gastric carcinoma. AM J Pathol， 1993,143:1 250-1 254
2 Armstrong AA, Weiss LM, Gallagher A, et al. Criterira for the definition of Epstein-Barr virus association in Hodgkin's disease. Leukemia， 1992,6:869-874
3 Zhou XG, Hamilton-Dutoit SJ, Yan QH, et al. The association between Epstein- Barr virus and Chinese Hodgkin's disease. Int J Cancer， 1993,55(3):359-363
, 百拇医药
4 李佩娟，周小鸽，刘淑荣，等.82例小儿霍奇金病与EB病毒相关的研究.中华病理学杂志， 1994，23(4)：224-226
5 Tao Q, Ho FCS, Loke SL, et al. Epstein-Barr virus is located in the tumor cells of nasal lymphomas of NK,T or B cell type. Int J Cancer 1995, 60:315-320
6 Chan JKC, Yip TTC, Tsang WYW, et al. Detection of Epstein-Barr virus RNA in malignant lymphomas of the upper aerodigestive tract. AM J Surg Pathol. 1994, 18(90):938-946
7 Weiss LM, Jaffe ES, Liu XF, et al. Detection and localization of Epstein-Barr virus genomes in angioimmunoblastic lymphadenopathy and angioimmunoblastic lymphadenopathy-like lymphoma. Blood， 1992, 79:1 789-1 795
, 百拇医药
8 Arber DA, Weiss LM, Albujar PF, et al. Nasal lymphomas in Peru. High incidence of T-cell immunophenotype and Epstein-Barr virus infection. AM J Surg Pathol， 1993,17(4):392-399
9 Zhou XG, Hamilton-Dutoit SJ, Yan QH, et al. High frequency of Epstein-Barr virus in Chinese peripheral T-cell lymphoma. Histopathol， 1994, 24:115-122
10 Joseph G, Barler GL, Ruan B, et al. Posttransplantation plasma cell dyscrasias. Cancer， 1994,74:1 959-1 964
, http://www.100md.com
11 Schemankewitz E, Hammami A, Stahl R, et al. Multiple extramedullary plasmacytomas following orthotopic liver transplantation in a pateint on cyclosporine therapy. Transplantation， 1990,49:1 019-1 022
12 Kingma DW, Medeiros LJ, Barletta J, et al. Epstein-Barr virus is infrequently identified in non-Hodgkin's lymphomas associated with Hodgkin's disease. AM J Surg Pathol， 1994,18(1):48-61
(1998-11-02收稿), 百拇医药
单位：高子芬 北京医科大学病理学系，北京 100083；Faith C.S. Ho Alex C.L.Chan Qian Tao Ramond Liang Gopesh Srivastava 香港大学
关键词：淋巴瘤；B细胞；病因学；爱泼斯坦-巴尔病毒；致病力；爱泼斯坦-巴尔病毒；分离和提纯；免疫组织化学；原位杂交
北京医科大学学报990510 摘 要 目的：对19例鼻咽部B细胞性恶性淋巴瘤与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染的相关性进行研究。方法：利用免疫组织化学及原位杂交方法对EBV进行检测，并用免疫组化及原位杂交双染法标记肿瘤细胞，以鉴定EBV阳性的细胞为B淋巴瘤细胞。结果：EBV编码的小mRNA探针(EBER)原位杂交显示，8例原发性鼻咽部B细胞性恶性淋巴瘤中3例绝大多数肿瘤细胞呈阳性表达，1例潜在性膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP-1)阳性。而11例继发性鼻咽部B细胞性恶性淋巴瘤EBER全部为阴性。全部病例进行了LMP-1检测，除1例原发者，全部阴性。 利用EBER-ISH(EBER原位杂交)和免疫组化CD 标记物进行双标记染色证实，EBER和LMP-1阳性细胞为CD 20阳性，CD 45RO阴性。鼻咽部原发性B细胞性恶性淋巴瘤EBV表达4/8，而继发者为0/11。结论：EBV与鼻咽部原发性B细胞恶性淋巴瘤有较高的相关性，而与继发性者无关。
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中国图书资料分类法分类号 R739.6
Epstein-Barr virus is associated with primary but not secondary nasal B lymphoma
GAO Zi-Fen＃, Faith C.S.HO, Alex C.L.CHAN，Qian TAO, Ramond LIANG, Gopesh SRIVASTAVA
(#Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Lymphoma, B-cell/etiol Epstein-Barr virus/pathogen Epstein-Barr virus/isol Immunohistochemistry In situ hybridization
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ABSTRACT Objective： To study the relationship between nasopharyngeal B-cell lymphoma and Epstein-Barr virus(EBV) infection. Methods： Detection of EBV RNA and latent membrane protein 1(LMP-1) was conducted by immunohistochemistry and in situ hybridization(ISH), using ISH for EBER combined with immunohistochemistry for LMP-1 and CD markers, in order to determine whether the EBV positive cells were tumor cells. Results： 19 nasopharyngeal B lymphoma patients were investigated for EBV, ISH for EBER showed signal over virtually all the tumor cell nuclei in the 3/8 primary nasopharyngeal tumors, 1/8 primary case was EBER negative due to RNA degradation but was LMP1 positive. However, all the 11 secondary nasopharyngeal tumors were EBER negative whilst ISH for β-actin mRNA was positive for all these cases. Using ISH for EBER combined with immunohistochemistry for LMP1 and CD markers, the predominant lineage of EBV+ cells was identified as CD20+CD45RO- in one EBER+ case and one LMP1 case. Our results revealed that EBV was present in the tumor cells of 4/8 primary nasal B-cell lymphomas but not in those of secondary nasopharyngeal tumors. Conclusion:Our findings suggest that EBV is associated with the pathogenesis of primary, but not secondary nasopharyngeal B-cell lymphoma.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:418-421)
EB病毒可以导致传染性单核细胞增生症和组织细胞坏死性淋巴结炎，与鼻咽癌和一部分胃癌也有较强的相关性[1]。而且EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与某些类型的淋巴造血系统恶性肿瘤有关。在地方性Burkitt淋巴瘤的发病中100%病例EBV阳性，在非地方性Burkitt淋巴瘤中EBV的表达仅为5%～20%。近年来由于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的感染，艾滋病病人伴有淋巴瘤时EBV的检出率为40%。在西方国家霍奇金病的R-S细胞中50%的病例EBV阳性[2]，在我国成人检出率约40%，而在儿童将近100%[3，4]。近来的研究证实鼻咽部T/NK型淋巴瘤与EBV有很高的相关性[5]。
不同的研究结果显示T/NK型淋巴瘤与EBV几乎有100%的相关性[5]，然而EBV与鼻咽B细胞恶性淋巴瘤的相关性一直不清，报告的研究结果从1例/10例到2例/3例[6]。我们研究了19例鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与EBV感染的情况，显示原发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与继发性有显著的不同。
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1 材料与方法
1.1 病例收集
我们选择了香港大学病理系存档的1985～1994年10年间的鼻腔、鼻咽部和鼻窦部位的19例鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤(表1)。全部病例按照Kiel分型分类。例1和例3以前曾报道过[5]。所有病例均有石蜡包埋组织块，4个病例同时有冰冻组织。
表1 临床特点、肿瘤部位和EBV原位杂交
Table 1 Summary of clinical feature,site of involvement and in situ hybridization for EBV Case no.
Sex/Age
Site of tumor
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Diagnosis
Neoplastic cells
EBER+
β-actin
Primary
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@，biopsy site； *，case with RNA degradation but LMP-1(+)； %，refers to total tumor cells； +，positive； -，negtive， F，female； M，male； N，nose； NP，nesopharynx； T，tosil； LN，lymph node； NS，nasal sinus； S，spleen； ML，malignant lymphoma； IB，immunoblastic； LB，lymphoblastic； CB，centroblastic； B，Burkitt's； BL，Burkitt like； CC，centrocytic； LC，lymphocytic； P，plasmacytoma； LP，lymphoplasmacytic； ND，not done。1.2 原位杂交(in situ hybridization, ISH)
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EBV编码的RNA(EBV encorded RNA, EBER)(YO17，Dako)和BHLF-1(Y018)为氢化荧光素异硫氰浓盐(fluorescein isothiocyanates, FITC)标记的寡核苷酸探针。EBER阴性病例用β-actin mRNA(X3302,Dako)检测组织RNA的存在情况。ISH方法参照Dako提供的方法进行，用3 mg.L-1的蛋白酶K200 μl消化切片，在37℃下杂交2 h，BCIP/NBT显色，阳性信号为细胞核呈蓝紫色，每组实验设EBV感染的细胞系B95-8为阳性对照，阴性为TBS(tris-NaCl buffer solution)取代探针。甲基绿复染核。
1.3 免疫组化
应用单克隆抗体CSI-4 检测LMP-1[体积比(下同)1∶10]、PE2检测EBNA2(1∶5)和BZ1检测ZEBRA(1∶10)。抗体为M. Rowe(Birmingham UK)馈赠。用SABC法在石蜡切片上检测EBV蛋白产物，DAB显色。APAAP法进行冰冻切片免疫组化染色。石蜡切片进行潜在膜蛋白(Latent memberane protein 1,LMP-1)检测需经过0.01 mol.L-1的枸橼酸三钠的微波预处理。
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1.4 双标记染色
先用SABC法进行UCHL-1(DaKo 1∶100)和L26(DaKo 1∶100)的染色，进行瘤细胞的克隆标记，然后进行EBV-ISH双染，但不需复染核。
2 结果
2.1 临床特点和组织学分型
我们将全部病例根据肿瘤部位分成2组，即原发瘤组(例1～8)和继发瘤(例9～19)组。原发瘤组的定义是鼻咽部为肿瘤的首先累及部位，而继发性者是指鼻咽部为转移部位(原发瘤位于淋巴结或其他淋巴器官，转移至鼻咽部)。
临床情况见表1，其中14例男性，5例女性，平均年龄59岁(3～88岁)，性别和年龄有明显差异。19例病例有8例原发于鼻咽部(占42%)，累及部位有鼻腔(3例)和咽部(5例)，其中3例伴有颈部淋巴结的转移(第2、6、8例)，11例为继发性鼻咽部淋巴瘤，除1例位于鼻窦外，其余都位于鼻咽部，其中6例伴有其他淋巴器官和淋巴结的累及。
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19例中13例为高度恶性淋巴瘤，包括有免疫母细胞性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、中心母细胞性淋巴瘤、伯基特和伯基特样淋巴瘤。6例是低度恶性，包括有淋巴浆细胞样淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤(图1)。
图1 原发性浆细胞瘤 显示肿瘤细胞单一性，有浆细胞的分化，核偏位，中等量嗜硷性胞浆。细胞有轻到中度异型性。 HE×400
Figure 1 A case of nasal primary plasmacytoma showing monotonous population of cells with plasmacytic differentiation, eccentric nuclei, perinuclear hof and moderate amount of basophilic cytoplasm,the cells show mild to moderate degree of pleomorphism. HE×40
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2.2 原位杂交
在8例原发性鼻咽B细胞恶性淋巴瘤中3例肿瘤细胞EBER阳性(图2)，而所有继发性者均为阴性。所有阴性病例用β-actin探针进行原位杂交，除1例外均为阳性，证实石蜡包埋组织中RNA足以用原位杂交检测。在EBER+病例中，阳性信号位于胞核，约70%～95%的瘤细胞为阳性。EBER阳性细胞为中等到大细胞，单形或多形性核。并可见少数EBER阳性的小淋巴细胞(每个组织切片5个以下)。在2例原发性和5例继发性鼻咽B细胞恶性淋巴瘤瘤细胞EBER-，少数反应性淋巴细胞EBER+。所有病例BHLF1阴性。
图2 原发性浆细胞瘤 EBER原位杂交90%以上的肿瘤细胞核阳性。 ISH×200
Figure 2 ISH for EBER RNA in nasal primary plasmacytoma ，over 90% neoplastic cells show positive. ISH×200
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2.3 EBV蛋白表达
LMP-1单染在4例EBV阳性原发鼻咽部B细胞恶性淋巴瘤中1例阳性(例1)，继发性组均为阴性。阳性对照为已知LMP-1+的HD病例，R-S细胞为阳性细胞。EBNA2和ZEBRA两组病例均无表达，EBNA2阳性对照为Raji细胞系，ZEBRA阳性对照为B95-8细胞系。
2.4 EBV阳性病例的双标记结果
EBER原位杂交阳性病例进行了CD标记物(CD 20,CD 45RO)的免疫组化染色，绝大多数EBER阳性细胞CD20阳性(图3)，CD 45RO阴性。也可见少数EBER阳性细胞CD 20阴性(图4)，CD 45RO阳性，形态学上可以辨认出来是背景的小淋巴细胞，1例浆细胞瘤EBER阳性细胞CD 20阴性。
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图3 伯基特淋巴瘤 EBV-ISH和L 26免疫组织化学双染，EBV+/L26+阳性的肿瘤细胞占95%以上。 (ISH+IH)×400
Figure 3 ISH and IH double staining for Burkitt's lymphoma,showing more than 95% tumor cells EBV+/L26+. (ISH+IH)×400
图4 继发性中心母细胞性淋巴瘤 EBV-ISH和L 26免疫组织化学双染，L26阳性的肿瘤细胞EBER-, EBER+的小淋巴细胞是反应性T 淋巴细胞。 (ISH+IH)×400
Figure 4 ISH and IH double staining for secondary nasal B cell Lymphoma,showing L26+ tumor cells EBV(-),only a few EBV (+) small cells are reactive T lymhpomacyte. (ISH+IH)×40
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双染结果显示，几乎所有LMP-1+细胞均为CD20+，CD45RO-(表2)。
表2 原发性EBV阳性鼻咽B细胞淋巴瘤肿瘤细胞EBV基因表达和双标记结果
Table 2 EBV gene expression and double-staining identify the lineag of EBV+ tumor cells in primary EBV+ nasal B lymphoma Case no
ISH
IH
Double staining
EBER+cell
BHLF1
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LMP-1
ZEBRA
EBNA2
L26/EBV
UCHL1/EBV
1
-*
-
+
NS
NS
+/LMP+
-/LMP+
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2
70%--
-
-
NS
NS
3
95%
-
-
-
-
+/EBER+
-/EBER+
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4
90%
-
-
-
-
-/EBER+
-/EBER+
*，case with RNA degradation； +，positive； -，negative； %，refer to total tumor cells； NS，not satisfactory.
3 讨论
EBER原位杂交是检测肿瘤中EBV感染的很敏感的方法，并可用于福尔马林固定，石蜡包埋的组织，比敏感的PCR方法更具定位的优越性。我们的结果显示，19例鼻咽部B细胞恶性淋巴瘤4例EBER或LMP-1阳性，包括3例弥漫性大细胞淋巴瘤(免疫母细胞性，中心母细胞性和Burkitt淋巴瘤)和1例中等细胞性淋巴瘤(浆细胞瘤)。Weiss[7]报道的鼻窦B细胞性恶性淋巴瘤EBV40%阳性，与我们的报道相似，比John[6]报道的阳性率高。与几乎100%与EBV的相关的鼻咽部T/NK细胞淋巴瘤相比[8，9]，鼻咽部B细胞恶性淋巴瘤与EBV的相关性较低。双标记染色证实了EBV阳性细胞是肿瘤性细胞。3例EBER阳性病例均无LMP-1的表达，与地方性Burkitt淋巴瘤相似，是潜在性I型；1例有LMP-1表达无EBNA2表达是潜在性II型，此组研究与文献报道一致。有趣的是所有EBV阳性的病例均为原发性肿瘤(4/8例，50%)，而所有继发者EBV均为阴性。这个结果显示EBV与原发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤有较强的相关性，而与继发者无相关性，相似结果目前尚无报道。
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双标记染色我们发现大多数EBV阳性细胞显示CD 20阳性证实为肿瘤细胞，并非所有EBV+的细胞CD20表达，EBV+/CD20+的细胞约占EBV+细胞的80%，且所有EBV + 的细胞相似于从形态上辨认的肿瘤细胞，可以理解为EBV阳性的细胞有CD 标记物的丢失。
本文研究中，我们发现4例EBV+的病例中1例为原发于鼻腔的浆细胞瘤并伴有颈部淋巴结转移，但非多发性骨髓瘤。此例EBV+的肿瘤细胞大于70%，尽管EBV+的肿瘤细胞CD20阴性，但典型的组织学形态完全可以分型。复习文献显示6例EBV+的浆细胞瘤中，多数是移植后的、多发性髓外浆细胞瘤或多发性骨髓瘤[10，11]，1例曾经是HD，本次为浆细胞瘤[12]，所有病例均为非鼻咽部。
本文研究结果显示，原发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与EBV有关，但不如鼻咽T/NK与EBV相关性强，更重要的是我们的结果显示继发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤与EBV无相关性。这一结果提示EBV在原发性和继发性鼻咽B细胞性恶性淋巴瘤的发病上作用可能不同。
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注：香港大学Crucher foundation资助课题。
参考文献
1 Tokunaga M, Land CE, Uemura Y, et al. Epstein-Barr virus in gastric carcinoma. AM J Pathol， 1993,143:1 250-1 254
2 Armstrong AA, Weiss LM, Gallagher A, et al. Criterira for the definition of Epstein-Barr virus association in Hodgkin's disease. Leukemia， 1992,6:869-874
3 Zhou XG, Hamilton-Dutoit SJ, Yan QH, et al. The association between Epstein- Barr virus and Chinese Hodgkin's disease. Int J Cancer， 1993,55(3):359-363
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4 李佩娟，周小鸽，刘淑荣，等.82例小儿霍奇金病与EB病毒相关的研究.中华病理学杂志， 1994，23(4)：224-226
5 Tao Q, Ho FCS, Loke SL, et al. Epstein-Barr virus is located in the tumor cells of nasal lymphomas of NK,T or B cell type. Int J Cancer 1995, 60:315-320
6 Chan JKC, Yip TTC, Tsang WYW, et al. Detection of Epstein-Barr virus RNA in malignant lymphomas of the upper aerodigestive tract. AM J Surg Pathol. 1994, 18(90):938-946
7 Weiss LM, Jaffe ES, Liu XF, et al. Detection and localization of Epstein-Barr virus genomes in angioimmunoblastic lymphadenopathy and angioimmunoblastic lymphadenopathy-like lymphoma. Blood， 1992, 79:1 789-1 795
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8 Arber DA, Weiss LM, Albujar PF, et al. Nasal lymphomas in Peru. High incidence of T-cell immunophenotype and Epstein-Barr virus infection. AM J Surg Pathol， 1993,17(4):392-399
9 Zhou XG, Hamilton-Dutoit SJ, Yan QH, et al. High frequency of Epstein-Barr virus in Chinese peripheral T-cell lymphoma. Histopathol， 1994, 24:115-122
10 Joseph G, Barler GL, Ruan B, et al. Posttransplantation plasma cell dyscrasias. Cancer， 1994,74:1 959-1 964
, http://www.100md.com
11 Schemankewitz E, Hammami A, Stahl R, et al. Multiple extramedullary plasmacytomas following orthotopic liver transplantation in a pateint on cyclosporine therapy. Transplantation， 1990,49:1 019-1 022
12 Kingma DW, Medeiros LJ, Barletta J, et al. Epstein-Barr virus is infrequently identified in non-Hodgkin's lymphomas associated with Hodgkin's disease. AM J Surg Pathol， 1994,18(1):48-61
(1998-11-02收稿), 百拇医药