自然排卵与注射人绒毛膜促性腺激素促排卵时阴道脱落细胞雌、孕激素受体的研究
作者：焦丽雅 杨京京 刘 斌
单位：北京医科大学组织学与胚胎学系，北京 100083
关键词：排卵；药物作用；促性腺素类；绒毛膜；药理学；受体；雌激素；分析；受体；孕酮；分析 阴道；细胞学
北京医科大学学报990509 摘 要 目的：研究排卵期阴道脱落细胞的雌、孕激素受体。方法：自然排卵妇女、注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)促排卵妇女排卵期阴道脱落细胞，应用免疫组织化学ABC法和图像分析技术进行雌激素受体(estrogen receptor, ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)的定位和定量研究。结果：两组组内排卵前、后阴道脱落细胞ER比较均无差异；注射hCG后阴道脱落细胞的ER在排卵前和排卵后均较自然排卵组有明显增高；自然排卵组PR在排卵后较之排卵前明显升高。结论：排卵前后阴道上皮细胞ER无明显变化； hCG可提高阴道上皮细胞ER水平；排卵后阴道上皮细胞PR增加。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R339.22
Study of estrogen receptors and progesterone receptors in epithelial cells of vagina in natural ovulation and ovulation by injection of human chorionic gonadotropin
JIAO Li-Ya； YANG Jin-Jin； LIU Bin
(Department of Embryology and Histology, Beijin Medical University, Beijing 100083 China)
MeSH Ovulation/drug eff Gonadotropins, chorionic/pharmacol Receptors, estrogen/anal Receptors, progesterone/anal Vagina/cytol
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To study the estrogen receptors(ER) and progesterone receptors(PR) in vagina epithelial cells during ovulation phase. Methods: Immunohistochemical ABC method and Q-500 image analysis system were used to locate and quantitative determinate of ER and PR in vagina epithelial cells in the nature ovulation women and injection of human chorionic gonadotropin (hCG) to induce ovulation women. Results: ER and PR positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells . ER level in vagina epithelial cells within the two groups had no difference in pre-ovulation and post-ovulation respectively; the ER level in the vagina epithelial cells in of hCG injection group was higher than that in natural ovulation group no matter which was in pre-ovulation or post-ovulation. The PR level in the vagina epithelial cells increased in post-ovulation. Conclusion: hCG could increase the ER level in the vagina epithelial cells; After ovulation, the PR level in vagina epithelial cells increased.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:415-417)
生育期妇女阴道上皮的生长、发育、成熟直接受性激素的影响。通过对阴道脱落细胞的检测，可间接反映卵巢功能。以往人们常采用阴道脱落细胞巴氏染色或绍氏染色来了解体内性激素水平。但近年来，免疫组织化学方法被用来检测组织中雌激素受体(estrogen receptors, ER)和孕激素受体(progesterone receptors, PR)水平[1]，具有方便、快捷，定位准确的特点，且方法成熟。本实验对自然排卵妇女注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)促排卵妇女排卵期阴道脱落细胞，应用免疫组织化学方法和图像分析技术进行ER与PR的定位和定量研究，旨在揭示排卵前、后阴道上皮细胞中ER和PR的变化，及hCG对阴道上皮的ER的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 试剂
鼠抗人ER抗体、鼠抗人PR抗体由孙素莲教授惠赠(我校临床肿瘤学院自制，经检验抗体效价符合标准)；ABC药盒系美国Vector 公司产品。
1.2 材料
收集1994～1997年来我室进行人工授精的育龄妇女(年龄25～42岁)44例，其中自然排卵妇女36例、注射hCG 5 000 IU促排卵妇女8例分别进行ER测定，自然排卵组8例进行了PR测定。用刮片法采集阴道脱落细胞，均匀涂布于载玻片上。
1.3 免疫组织化学反应程序
阴道脱落细胞涂片即刻放入4 ℃丙酮固定30 min后，再入体积分数为0.3%的H2O2甲醇，室温，30 min，然后按ABC法进行免疫组织化学反应[1]。第一抗体为鼠抗人ER或鼠抗人PR单克隆抗体(ER体积比1∶100稀释；PR为原液)，DAB显色。每张涂片均设阴性对照，用磷酸缓冲液(phosphatic balance solution, PBS)代替一抗。
, 百拇医药
1.4 阴道脱落细胞ER及PR原位定量
自然排卵组、注射hCG促排卵组ER测定病例，及自然排卵组PR测定病例各取6例，经上述免疫组织化学染色后，用Q500图像分析系统(Leica公司)测定每例ER或PR 的灰度值。光镜下(100×)每张涂片随机测量8个单位面积，每组排卵前后分别测48个单位面积。各组灰度值
+s
组间和组内各以48个样本数，采用ANOVA继以Newman-Keuls检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 ER和PR的定位
光镜下观察，ER或PR阳性细胞，其胞质内或胞核内有黄色或棕黄色颗粒，强度明显高于底色。对照及阴性细胞胞质内或胞核内无黄色颗粒，呈均一淡黄色或与背景相同(图1～3)。
, 百拇医药
图1 自然排卵组排卵前阴道脱落细胞ER免疫组化反应。胞质和胞核内见棕黄色阳性颗粒。 免疫组化ABC法 ×330
Figure 1 ER positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells preovulation in nature ovulation group. Immunohislochemical ABC method ×330
图2 注射hCG促排卵组排卵前阴道脱落细胞ER免疫组化反应。胞质和胞核内见棕黄色阳性颗粒,左上及右下为阳性细胞 ，右上为阴性细胞。 免疫组化ABC法×330
Figure 2 ER positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells preovulation in injection hCG ovulation group. top left corner and right lower is positive cell, top right corner is negative cell. Immunohislochemical ABC method ×330
, 百拇医药
图3 自然排卵组排卵后阴道脱落细胞PR免疫组化反应。胞质和胞核内见棕黄色阳性颗粒，左侧为阳性细胞，右侧为阴性细胞。 免疫组化ABC法 ×330
Figure 3 PR positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells preovulation in nature ovulation group. left cell is positive cell, right cell is negative cell. Immunohislochemical ABC method ×330
2.2 ER和PR的相对含量
自然排卵组、hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER，和自然排卵组PR的免疫组织化学定量见表1。自然排卵组的阴道脱落细胞的ER排卵前与排卵后比较无差异；hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER在排卵前与排卵后也无差异；与自然排卵组排卵前的阴道脱落细胞的ER比较，hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER在排卵前有明显增高(P<0.05)；与自然排卵组的排卵后的阴道脱落细胞的ER比较，hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER在排卵后亦有明显增高(P<0.05)；自然排卵组阴道脱落细胞PR在排卵后较之排卵前明显升高(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 各组排卵前后阴道脱落细胞ER及PR免疫反应阳性物质灰度值(+s)
Table 1 The immunopositive substance value of grey degree of ER and PR in vagina epithelial cells (+s) Group
Number of
case
Number of
, 百拇医药
measured
field
ER
PR
Before
After
Before
After
Nature
6
48
188.0+1.8
193.2+1.8
, 百拇医药
207.3+1.2*
217.6+5.3
hGG
6
48
201.2+1.9*
201.0+2.9*
Before, pre-ovulation; after, after-ovulation; nature, nature ovulation; hCG, hCG ovulation, *P<0.05, **P<0.001, compared with nature ovulation.3 讨论
, 百拇医药
正常月经周期中，生殖道上皮受性激素的调节而呈现周期性的变化。性激素通过其靶器官上的受体发挥作用。关于ER和PR的分布，报道的资料各不相同。根据甾体激素受体的“二步模式”学说[2]，甾体激素受体在胞质内与激素结合后，移入胞核，因此细胞质和胞核内均分布有激素受体。彭文明等[1]的研究与此一致，本实验也有同样的结果。但有多篇报道显示ER和PR主要或仅存在于胞核内[3～5]。在Brenner[3]等的研究中还发现，ER和PR仅存在于阴道的基质细胞中，而非上皮细胞内。他认为性激素在阴道上皮上的雌激素和孕激素作用是由邻近的基质细胞通过旁分泌作用介导的。而McClelian等[5]的研究显示阴道的复层鳞状上皮中，只有基底层上皮的细胞核中见到阳性颗粒。但本实验用刮片法取得的阴道表层细胞中，可清楚地看见ER和PR阳性细胞中存在棕黄色颗粒。关于这个问题，尚有待于进一步研究。雌激素具有刺激生殖道ER和PR合成的作用[2]。本实验两组组内排卵前、后ER均没有明显变化，推测尽管排卵后雌激素迅即下降，但可能还未能立即反映在ER水平上。在注射hCG(外源性黄体生成素)促排卵组，阴道脱落细胞的ER，不论在排卵前还是排卵后均较自然排卵组明显升高，表明促性腺激素黄体生成素在FSH的协同作用下，刺激雌激素大量分泌，从而刺激依赖雌激素的ER含量增加。PR的合成依赖胞核ER维持在一个较高水平[2]，Ohta等[4]的研究中显示，切除大鼠的卵巢20 d后，阴道上皮PR为阴性，给予雌二醇治疗后阴道上皮PR迅速升高，再给予P并不能继续增加PR水平[3]。本实验自然排卵组阴道上皮PR在排卵后较之排卵前明显升高，表明从增生晚期到分泌初期，阴道脱落细胞中的 PR处于一个动态增高状态。应用免疫组化方法测定阴道脱落细胞的ER和PR可在一定程度上反映体内性激素的变化。
, 百拇医药
参考文献
1 彭文明，郑秀玲，周敏能，等. 90例大肠癌雌、孕激素受体免疫组化检测研究. 癌症, 1996，(5)： 335-337
2 吕宝璋，田 英.受体学概论. 北京： 科学出版社，1991.239
3 Brenner RM, West NB, McClellan MC. Estrogen and progensterone receptors in the reproductive tract of male and female primates. Bio Reprod， 1990,42：11-19
4 Ohta Y, Sato T, Iguchi T. Immunocytochemical location of progensterone receptors in the reproductive tract of adult female rats. Bio Reprod， 1993,48：205-213
5 McClellan MC, West NB, Tacha DE. Immunocytochemical location of estrogen receptors in the macaque reproductive tract with monoclonal antiestrophilins. Endocrinology， 1984, 114： 2 002-2 014
(1998-11-09收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学组织学与胚胎学系，北京 100083
关键词：排卵；药物作用；促性腺素类；绒毛膜；药理学；受体；雌激素；分析；受体；孕酮；分析 阴道；细胞学
北京医科大学学报990509 摘 要 目的：研究排卵期阴道脱落细胞的雌、孕激素受体。方法：自然排卵妇女、注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)促排卵妇女排卵期阴道脱落细胞，应用免疫组织化学ABC法和图像分析技术进行雌激素受体(estrogen receptor, ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)的定位和定量研究。结果：两组组内排卵前、后阴道脱落细胞ER比较均无差异；注射hCG后阴道脱落细胞的ER在排卵前和排卵后均较自然排卵组有明显增高；自然排卵组PR在排卵后较之排卵前明显升高。结论：排卵前后阴道上皮细胞ER无明显变化； hCG可提高阴道上皮细胞ER水平；排卵后阴道上皮细胞PR增加。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R339.22
Study of estrogen receptors and progesterone receptors in epithelial cells of vagina in natural ovulation and ovulation by injection of human chorionic gonadotropin
JIAO Li-Ya； YANG Jin-Jin； LIU Bin
(Department of Embryology and Histology, Beijin Medical University, Beijing 100083 China)
MeSH Ovulation/drug eff Gonadotropins, chorionic/pharmacol Receptors, estrogen/anal Receptors, progesterone/anal Vagina/cytol
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To study the estrogen receptors(ER) and progesterone receptors(PR) in vagina epithelial cells during ovulation phase. Methods: Immunohistochemical ABC method and Q-500 image analysis system were used to locate and quantitative determinate of ER and PR in vagina epithelial cells in the nature ovulation women and injection of human chorionic gonadotropin (hCG) to induce ovulation women. Results: ER and PR positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells . ER level in vagina epithelial cells within the two groups had no difference in pre-ovulation and post-ovulation respectively; the ER level in the vagina epithelial cells in of hCG injection group was higher than that in natural ovulation group no matter which was in pre-ovulation or post-ovulation. The PR level in the vagina epithelial cells increased in post-ovulation. Conclusion: hCG could increase the ER level in the vagina epithelial cells; After ovulation, the PR level in vagina epithelial cells increased.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:415-417)
生育期妇女阴道上皮的生长、发育、成熟直接受性激素的影响。通过对阴道脱落细胞的检测，可间接反映卵巢功能。以往人们常采用阴道脱落细胞巴氏染色或绍氏染色来了解体内性激素水平。但近年来，免疫组织化学方法被用来检测组织中雌激素受体(estrogen receptors, ER)和孕激素受体(progesterone receptors, PR)水平[1]，具有方便、快捷，定位准确的特点，且方法成熟。本实验对自然排卵妇女注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)促排卵妇女排卵期阴道脱落细胞，应用免疫组织化学方法和图像分析技术进行ER与PR的定位和定量研究，旨在揭示排卵前、后阴道上皮细胞中ER和PR的变化，及hCG对阴道上皮的ER的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 试剂
鼠抗人ER抗体、鼠抗人PR抗体由孙素莲教授惠赠(我校临床肿瘤学院自制，经检验抗体效价符合标准)；ABC药盒系美国Vector 公司产品。
1.2 材料
收集1994～1997年来我室进行人工授精的育龄妇女(年龄25～42岁)44例，其中自然排卵妇女36例、注射hCG 5 000 IU促排卵妇女8例分别进行ER测定，自然排卵组8例进行了PR测定。用刮片法采集阴道脱落细胞，均匀涂布于载玻片上。
1.3 免疫组织化学反应程序
阴道脱落细胞涂片即刻放入4 ℃丙酮固定30 min后，再入体积分数为0.3%的H2O2甲醇，室温，30 min，然后按ABC法进行免疫组织化学反应[1]。第一抗体为鼠抗人ER或鼠抗人PR单克隆抗体(ER体积比1∶100稀释；PR为原液)，DAB显色。每张涂片均设阴性对照，用磷酸缓冲液(phosphatic balance solution, PBS)代替一抗。
, 百拇医药
1.4 阴道脱落细胞ER及PR原位定量
自然排卵组、注射hCG促排卵组ER测定病例，及自然排卵组PR测定病例各取6例，经上述免疫组织化学染色后，用Q500图像分析系统(Leica公司)测定每例ER或PR 的灰度值。光镜下(100×)每张涂片随机测量8个单位面积，每组排卵前后分别测48个单位面积。各组灰度值
+s组间和组内各以48个样本数，采用ANOVA继以Newman-Keuls检验进行统计学处理。2 结果
2.1 ER和PR的定位
光镜下观察，ER或PR阳性细胞，其胞质内或胞核内有黄色或棕黄色颗粒，强度明显高于底色。对照及阴性细胞胞质内或胞核内无黄色颗粒，呈均一淡黄色或与背景相同(图1～3)。
, 百拇医药
图1 自然排卵组排卵前阴道脱落细胞ER免疫组化反应。胞质和胞核内见棕黄色阳性颗粒。 免疫组化ABC法 ×330
Figure 1 ER positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells preovulation in nature ovulation group. Immunohislochemical ABC method ×330
图2 注射hCG促排卵组排卵前阴道脱落细胞ER免疫组化反应。胞质和胞核内见棕黄色阳性颗粒,左上及右下为阳性细胞 ，右上为阴性细胞。 免疫组化ABC法×330
Figure 2 ER positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells preovulation in injection hCG ovulation group. top left corner and right lower is positive cell, top right corner is negative cell. Immunohislochemical ABC method ×330
, 百拇医药
图3 自然排卵组排卵后阴道脱落细胞PR免疫组化反应。胞质和胞核内见棕黄色阳性颗粒，左侧为阳性细胞，右侧为阴性细胞。 免疫组化ABC法 ×330
Figure 3 PR positive immunostaining was found in the cytoplasm and nuclei of the vagina epithelial cells preovulation in nature ovulation group. left cell is positive cell, right cell is negative cell. Immunohislochemical ABC method ×330
2.2 ER和PR的相对含量
自然排卵组、hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER，和自然排卵组PR的免疫组织化学定量见表1。自然排卵组的阴道脱落细胞的ER排卵前与排卵后比较无差异；hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER在排卵前与排卵后也无差异；与自然排卵组排卵前的阴道脱落细胞的ER比较，hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER在排卵前有明显增高(P<0.05)；与自然排卵组的排卵后的阴道脱落细胞的ER比较，hCG促排卵组阴道脱落细胞的ER在排卵后亦有明显增高(P<0.05)；自然排卵组阴道脱落细胞PR在排卵后较之排卵前明显升高(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 各组排卵前后阴道脱落细胞ER及PR免疫反应阳性物质灰度值(
+s)Table 1 The immunopositive substance value of grey degree of ER and PR in vagina epithelial cells (
+s) GroupNumber of
case
Number of
, 百拇医药
measured
field
ER
PR
Before
After
Before
After
Nature
6
48
188.0+1.8
193.2+1.8
, 百拇医药
207.3+1.2*
217.6+5.3
hGG
6
48
201.2+1.9*
201.0+2.9*
Before, pre-ovulation; after, after-ovulation; nature, nature ovulation; hCG, hCG ovulation, *P<0.05, **P<0.001, compared with nature ovulation.3 讨论
, 百拇医药
正常月经周期中，生殖道上皮受性激素的调节而呈现周期性的变化。性激素通过其靶器官上的受体发挥作用。关于ER和PR的分布，报道的资料各不相同。根据甾体激素受体的“二步模式”学说[2]，甾体激素受体在胞质内与激素结合后，移入胞核，因此细胞质和胞核内均分布有激素受体。彭文明等[1]的研究与此一致，本实验也有同样的结果。但有多篇报道显示ER和PR主要或仅存在于胞核内[3～5]。在Brenner[3]等的研究中还发现，ER和PR仅存在于阴道的基质细胞中，而非上皮细胞内。他认为性激素在阴道上皮上的雌激素和孕激素作用是由邻近的基质细胞通过旁分泌作用介导的。而McClelian等[5]的研究显示阴道的复层鳞状上皮中，只有基底层上皮的细胞核中见到阳性颗粒。但本实验用刮片法取得的阴道表层细胞中，可清楚地看见ER和PR阳性细胞中存在棕黄色颗粒。关于这个问题，尚有待于进一步研究。雌激素具有刺激生殖道ER和PR合成的作用[2]。本实验两组组内排卵前、后ER均没有明显变化，推测尽管排卵后雌激素迅即下降，但可能还未能立即反映在ER水平上。在注射hCG(外源性黄体生成素)促排卵组，阴道脱落细胞的ER，不论在排卵前还是排卵后均较自然排卵组明显升高，表明促性腺激素黄体生成素在FSH的协同作用下，刺激雌激素大量分泌，从而刺激依赖雌激素的ER含量增加。PR的合成依赖胞核ER维持在一个较高水平[2]，Ohta等[4]的研究中显示，切除大鼠的卵巢20 d后，阴道上皮PR为阴性，给予雌二醇治疗后阴道上皮PR迅速升高，再给予P并不能继续增加PR水平[3]。本实验自然排卵组阴道上皮PR在排卵后较之排卵前明显升高，表明从增生晚期到分泌初期，阴道脱落细胞中的 PR处于一个动态增高状态。应用免疫组化方法测定阴道脱落细胞的ER和PR可在一定程度上反映体内性激素的变化。
, 百拇医药
参考文献
1 彭文明，郑秀玲，周敏能，等. 90例大肠癌雌、孕激素受体免疫组化检测研究. 癌症, 1996，(5)： 335-337
2 吕宝璋，田 英.受体学概论. 北京： 科学出版社，1991.239
3 Brenner RM, West NB, McClellan MC. Estrogen and progensterone receptors in the reproductive tract of male and female primates. Bio Reprod， 1990,42：11-19
4 Ohta Y, Sato T, Iguchi T. Immunocytochemical location of progensterone receptors in the reproductive tract of adult female rats. Bio Reprod， 1993,48：205-213
5 McClellan MC, West NB, Tacha DE. Immunocytochemical location of estrogen receptors in the macaque reproductive tract with monoclonal antiestrophilins. Endocrinology， 1984, 114： 2 002-2 014
(1998-11-09收稿), 百拇医药