血浆总同型半胱氨酸测定及其临床意义
作者：孟昭亨 郝玲 姜宁 朱蓉 李竹 汤健
单位：孟昭亨 郝玲 朱蓉 李竹 北京医科大学生育健康研究室；姜宁 汤健 心血管基础研究所，北京 100083
关键词：半胱氨酸；血液；冠状动脉硬化；诊断；畸形；诊断；出生性缺陷☆
北京医科大学学报990503 摘 要 目的: 建立血浆总同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)的检测方法，测定正常人和冠状动脉硬化及先天性心脏病核心家庭血浆同型半胱氨酸水平的变化。方法：应用柱前衍生化-HPLC方法, 测定了49例正常人，74例冠状动脉硬化患者及7个先天性心脏病核心家庭中的19个成员的血浆总Hcy水平。结果: 衍生化-HPLC测定血浆总Hcy浓度的方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。正常成年血浆总Hcy浓度为(8.4±0.8) μmol.L-1 (n=42,
±s
,下同)；冠状动脉硬化和出生性缺陷家庭成员平均血浆总Hcy水平分别为(16.9±1.7)及(28.4±1.2) μmol.L-1，与正常人比较差异具有显著性 (P<0.05， P<0.001)。结论：高同型半胱氨酸是动脉硬化和先天性心脏病的一个危险因素。测定血浆Hcy可作为动脉硬化和先天性心脏病的一个辅助诊断指标。
, 百拇医药
中国图书资料分类分类法 R449
Homocysteine measurement and its clinical significances
MENG Zhao-Heng#, HAO Ling, JIANG Ning, ZHU Rong, LI Zhu, TANG Jian
(# Laboratory for Reproductive Health Research, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Cysteine/blood Coronary arteriosclerosis/diag Abnormalities/diag Birth defect☆
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: Homocysteine has been identified as an independent risk factor for atherosclerosis(As) and birth defective disease. Objective: To establish a method for determining total plasma homocysteine (Hcy), to inspect the changes of Hcy level for healthy individuals, pateints with coronary atherosclerosis, and kernel families with congenital heart disease(CHD). Methods: Using the method of precolumn derivatization-HPLC were measured the total plasma Hcy for 49 healthy individuals, 74 patients with coronary atherosclerosis (CAs), and 7 families having a child with congenital heart disease (n=19). Results: The method is sensitive (detection limit 0.125 μmol.L-1), specific, and has a high reproducibility (CV<2.86%). Its recovery is 101.89%.In the groups of healthy individuals, the mean level of plasma Hcy were significantly higher in men than that in women and children, which were (9.2±1.0) (±s, the same below); (5.8±0.6), and (5.9±0.4) μmol.L-1 respectively (P<0.05). In the pateines with CAs and the kernel families with CHD the Hcy level were (16.9±1.7) and (28.4±1.2) μmol.L-1 separately, which were significantly higher than the control (P<0.001). Conclusion: homocysteine is a risk factor for As and CHD. the total level of plasma homocysteine may be a subsidiary indicator for the diagnosis of atherosclerosis and congenital heart disease.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:391-394)
同型半胱氨酸是一种含硫的氨基酸，它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物。早在60年代末，已有学者注意到遗传性高胱氨酸尿症的病人多数同时伴有亚临床期心血管病。Wilcken等[1]通过流行病学调查最先提出同型半胱氨酸是心血管病的一个独立的危险因素。近年的研究进一步证明，高同型半胱氨酸血症不仅是动脉硬化的一个新的独立的危险因素，亦是出生性缺陷的一个危险因子[2，3]。因此，测定血浆总同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)对心血管病和出生性缺陷的诊断、预防和治疗具有重要的意义。但是，目前国内尚很少见报告。本工作应用NaBH4 将含硫氨基酸还原成硫氢基的化合物使其衍生化，再标记以荧光物质monobromobimane，最后进行反相高压色谱分析测定同型半胱氨酸[4，5]，该方法灵敏、特异、重复性好。并测定了正常人、冠状动脉硬化患者和先天性心脏病患儿及父母血浆Hcy的变化。
, 百拇医药
1 材料及方法
1.1 材料
标准品L-同型胱氨酸和L-胱氨酸，N-乙基吗啡啉、二硫苏糖醇(dithioerythritol, DTE)、DMSO、正辛醇 (1-octanol)、monobromobimane购于美国Sigma Chemical Co.,硝酸铵、甲酸铵、冰醋酸、乙腈等均为市售试剂。
高压液相分析仪是Shimadzu LC-4A (岛津,日本)。 荧光检测器型号为 FL-3000 (Thermo Separation，美国) 激发波长366 nm, 发射波长476 nm。HPLC反相分析柱为 ODS-3，150 mm×4.6 mm, 5 μm颗粒 (GL Sciences Inc.,日本)。预柱2.5 mm×4.6 mm，购自北京潮声技术公司。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 研究对象
包括正常人、冠状动脉硬化和先天性心脏病核心家庭成员共142例，分为3组。
正常对照组：49例，其中成年人42例(男性24例女性18例)，年龄为26～70岁，均无冠状动脉狭窄及动脉硬化表现，亦无出生性缺陷及先天性心脏病生育史，临床生化，胸部X线和腹部B超检查，肺、肾、肝功能均未发现异常。其中19例(33～70岁)经冠状动脉造影检查除外冠状动脉硬化。另外有7例正常婴幼儿，年龄6～20个月。
冠状动脉硬化组：74例，其中男性59例，女性15例，年龄38～72岁，均进行冠状动脉造影确诊至少有一支冠状动脉狭窄，其程度达70%以上，而肺、肝、肾功能，血脂，心电图，胸部X线和腹部B超检查均未见明显病变，诊为冠状动脉硬化(coronary atherosclerosis, CAs)者。
先天性心脏病组：7个先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)核心家庭共19例。其中患儿6例，年龄6个月～1岁6个月，室间隔缺损5例，法洛四联症1例；13例双亲，其中父亲6例，母亲7例，年龄26～36岁，其中患室间隔缺损3例。其余经体检、心电图、胸部X线及B超检查未发现异常。
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1.2.2 样品收集及贮存 清晨空腹，用Vacutainer管(becton dickinson, rutherford, NJ)取静脉血，EDTA抗凝，立即离心(3000 r.min-1,40 ℃，5 min)，分离血浆，贮存在-20 ℃备用。
1.2.3 样品衍生化 30 μl 测定样品, 30 μl 4 mol.L-1 NaBH4/0.066 mol.L-1 NaOH/333 ml.L-1 DMSO, 10 μl 1.65 mmol.L-1 DTE/2 mmol.L-1 EDTA, 10 μl 1-octanol, 20 μl 1.8 mol.L-1 HCl，反应3 min后，加入100 μl 1.5 mol.L-1N-乙基吗啡啉, 400 μl H2O 和 20 μl 25 mmol.L-1 monobromobimane/乙腈进行荧光标记, 混合后放置3 min，再加冰醋酸 40 μl终止反应，用0.45 μm 玻璃纤维膜滤过，立即进行色谱分析。
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标准液：50 μmol.L-1 L-同型胱氨酸, 600 μmol.L-1胱氨酸溶于100 μmol.L-1 DTE 的0.1 mol.L-1 HCl 中，作为原液分装贮存于-20 ℃。应用时将原液稀释成不同浓度，同样进行衍生化。
以上试剂除盐酸、乙基吗啡啉缓冲液和水放在室温，样品及其他试剂均置于冰浴中。
1.2.4 色谱分析 取上述衍生化的样品20 μl 注入 150 mm×4.5 mm ODS-3 柱中。于进样前将分析柱用 30 mmol.L-1硝酸铵和 40 mmol.L-1甲酸铵缓冲液 ( pH 3.65 )平衡，进样后以5.0%～11.0%(体积分数)乙腈进行梯度流洗，流速 2.0 ml.min-1。共洗脱20 min，以366 nm 和476 nm荧光波长检测其密度。
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2 结果
2.1 特异性测定
取50 μmol.L-1 L-同型胱氨酸和20 μmol.L-1 L-胱氨酸 各15 μl 进行衍生化及色谱分析，结果见图1。L-胱氨酸和L-同型胱氨酸的保留时间分别为8.0及10.5 min。
1，cysteine;2,homocysteine
图1 同型半胱氨酸的特异性
Figure 1 Specificity of homocysteine
2.2 标准曲线
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分别以0、0.25、0.5、1、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0 μmol.L-1的标准Hcy进行HPLC测定，作标准曲线，结果见图2。由图2可以看出Hcy浓度在0.25～50 μmol.L-1之间，呈剂量线性关系，其相关系数r=0.99。最小检出量为0.125 μmol.L-1。
图2 同型半胱氨酸测定的标准曲线及线性关系
Figure 2 Standard curve, and linearity of the assay for homocysteine
2.3 重复性
, 百拇医药 取同一血样于1周内反复测定6次，其CV<2.62%。同一样品分别于1个月内不同时间重复测定10次，其CV<4.37 %。将15 μl 20、40、60 μmol.L-1的L-同型胱氨酸分别加入15 μl 同一份血浆中，依上述方法衍生化和色谱分析，进行平行试验。其结果亦呈线性关系(图2)。
1， cysteine; 2, homocysteine.
2.4 回收率
将15 μl 25 μmol.L-1 Hcy、15 μl血样和15 μl 25 μmol.L-1 Hcy 加15 μl的血浆，3种样品分别进行衍生化和HPLC测定，计算其回收率为101.89%。
2.5 正常人和冠状动脉硬化患者及先天性心脏病核心家庭血浆总Hcy浓度变化
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正常成人平均Hcy浓度为(8.4±0.6) μmol.L-1，其中男性血浆Hcy浓度为(9.2±1.0) μmol.L-1，18例女性为(5.9±0.6) μmol.L-1，男性高于女性，男女两组比较有统计学差异(P<0.05 )；正常婴幼儿水平为(5.9±0.4) μmol.L-1。冠状动脉硬化患者平均血浆Hcy 浓度为(16.9±1.7) μmol.L-1，明显高于对照组的平均水平 (P<0.05)；其中男性为(18.9±2.0) μmol.L-1，女性为8.7±1.6 μmol.L-1，男女两组比较亦具有统计学差异(P<0.05)。结果见图3。
, 百拇医药
# P<0.05, compared with the control and the patients with CAs respectively，*** P<0.001, compared with adult male of the control and the patient with CAs.
图3 对照组与冠状动脉硬化患者血浆Hcy浓度的变化
Figure 3 The changes of plasma Hcy concentration for the controls and the patients with CAs
生育有先天性心脏病子女的双亲和先天性心脏病婴儿，其血浆Hcy的变化如图4所示。患儿父亲为(25.9±2.5) μmol.L-1，母亲(30.1±3.7) μmol.L-1，患儿(9.6±1.1) μmol.L-1。由图4可以看出，生育先天性心脏病的父母和患儿血浆Hcy水平均明显高于正常对照组(P<0.001，P<0.001及P<0.01)，其中母亲的血浆Hcy升高尤为显著。
, 百拇医药
* P<0.05, *** P<0.001， vs control.
图4 对照组与先天性心脏病核心家庭血浆Hcy浓度的变化
Figure 4 The changes Hcy concentration in plasma for the control,parents and child with congenital heart disease
3 讨论
血浆总同型半胱氨酸测定法有放射性酶测定、气相色谱、氨基酸分析柱后衍生 (amino acid analyzer, postcolumn derivatization)、衍生化-HPLC-荧光检测 (precolumn derivatization, HPLC, and fluorescence)和HPLC 电化学测定 (HPLC and electrochemical detection)等方法。当前应用较普遍的为后两种[5]。其特异性强、灵敏度高、重复性好。本工作应用HPLC柱前衍生化方法测定Hcy的最小检测量为0.125 μmol.L-1, 批内差异为CV<2.62%, 批间差异为4.37%，回收率为101.89%。说明应用柱前衍生化-HPLC测定血浆总Hcy是一个较好的方法。
, 百拇医药
本文报告正常人血浆总Hcy浓度平均为(8.4±0.8) μmol.L-1，男性高于女性，该结果与国外报告一致[5，6]。一般认为血浆总Hcy正常范围为5～15 μmol.L-1,高于14 μmol.L-1时即可诊断为高同型半胱氨酸血症。
高同型半胱氨酸血症是动脉硬化和出生性缺陷的一个新的独立危险因子[1～3]。本工作亦证明冠状动脉硬化患者和先天性心脏病的婴儿和双亲，血浆同型半胱氨酸的平均水平明显高于正常人。因此，测定血浆Hcy水平，可以作为动脉硬化和先天性心脏病诊断的一个辅助指标。但是，在本组74例冠状动脉硬化和7个出生性缺陷核心家庭中的19个成员，并非所有患者血浆Hcy均升高，冠状动脉硬化患者血浆Hcy升高只有28例，约占37.8%。在先天性心脏病的家族成员中血浆Hcy升高者，13例父母亲有10例，占76.9%，6例患儿中有1例，占16.7%。因此，高同型半胱氨酸血症是动脉硬化和先天性心脏病的一个危险因素，但是并不是唯一因素。在出生性缺陷核心家庭中以母亲Hcy水平升为主，父亲Hcy水平不如母亲升高明显，因此，孕妇高Hcy水平可能在先天性心脏病的发生中，更具有重要意义。
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关于Hcy诱发动脉硬化和出生性缺陷的机制尚不十分了解。我们和一些实验室报告，高Hcy不仅可以诱发内皮细胞的损伤[6，7]，而且还可以引起血管平滑肌增殖[8，9]，给鸡胚注射Hcy不仅可以诱导先天性心脏病，而且还可以诱导产生神经管畸形。最近，我们应用差异分析的方法，从大鼠血管平滑肌细胞中克隆到一个Hcy诱导的基因，其全长cDNA为2 014 bp，可编码142个氨基酸的蛋白质，它可能是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的新成员，与细胞死亡蛋白及TNF诱导凋亡基因有高度同源性[10]。它在动脉硬化和出生性缺陷发生中的意义正在研究中。
注：国家863计划及国家自然科学基金(2230522517， 2231548517)资助课题；
☆自由词。
参考文献
1 Refsum H, Ueland PM. Clinical significance of pharmacological modulation of homocysteine metabolism. TIPS,1990,11:411-416
, 百拇医药
2 Kochame K, Kato H, Miyata T. Homocysteine-respondent gene in vascularendotheilal cells. J Biol Chem, 1996, 371:29 659-29 665
3 Verhoef P, Stampfer MJ, Buring JE. Prospective studies of homocysteine and cardiovascular diseases. Nutr Rev,1995, 53:283-288
4 Fiskerstrand T, Refsum H, Kvalheiro G, et al. Homocysteine and others thiols in plasma and urine: automated determination and sample stability. Clin Chem,1993, 39(2):263-271
, 百拇医药
5 Ueland PM, Refsum H, Stabler SP, et al. Total homocysteine in plasma or serum: Methods and Clinical aplications. Clin Chem, 1993, 39(9):1 764-1 779
6 Stamler JS, Osborne JA, Jaraki O, et al. Adverse vascular effects of homocysteine are modulated by endothelium-derived relaxing factor and related oxides of nitrogen. J Clin Invest,1995, 75:132-136
7 Tsai JC, Perrella MA, Yoshizumi M, et al. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6 369-6 373
8 田学军，周爱儒，汤 健. 同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用. 中国生物化学与分子生物学报， 1998，14(1):108-112
9 陈光慧，朱燕青，高 炜，等. 同型半胱氨酸/半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞中的新cDNA. 中国生物化学与分子生物学报， 1998，14(1):8-14
(1998-12-02收稿), 百拇医药
单位：孟昭亨 郝玲 朱蓉 李竹 北京医科大学生育健康研究室；姜宁 汤健 心血管基础研究所，北京 100083
关键词：半胱氨酸；血液；冠状动脉硬化；诊断；畸形；诊断；出生性缺陷☆
北京医科大学学报990503 摘 要 目的: 建立血浆总同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)的检测方法，测定正常人和冠状动脉硬化及先天性心脏病核心家庭血浆同型半胱氨酸水平的变化。方法：应用柱前衍生化-HPLC方法, 测定了49例正常人，74例冠状动脉硬化患者及7个先天性心脏病核心家庭中的19个成员的血浆总Hcy水平。结果: 衍生化-HPLC测定血浆总Hcy浓度的方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。正常成年血浆总Hcy浓度为(8.4±0.8) μmol.L-1 (n=42,
±s,下同)；冠状动脉硬化和出生性缺陷家庭成员平均血浆总Hcy水平分别为(16.9±1.7)及(28.4±1.2) μmol.L-1，与正常人比较差异具有显著性 (P<0.05， P<0.001)。结论：高同型半胱氨酸是动脉硬化和先天性心脏病的一个危险因素。测定血浆Hcy可作为动脉硬化和先天性心脏病的一个辅助诊断指标。, 百拇医药
中国图书资料分类分类法 R449
Homocysteine measurement and its clinical significances
MENG Zhao-Heng#, HAO Ling, JIANG Ning, ZHU Rong, LI Zhu, TANG Jian
(# Laboratory for Reproductive Health Research, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Cysteine/blood Coronary arteriosclerosis/diag Abnormalities/diag Birth defect☆
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ABSTRACT Objective: Homocysteine has been identified as an independent risk factor for atherosclerosis(As) and birth defective disease. Objective: To establish a method for determining total plasma homocysteine (Hcy), to inspect the changes of Hcy level for healthy individuals, pateints with coronary atherosclerosis, and kernel families with congenital heart disease(CHD). Methods: Using the method of precolumn derivatization-HPLC were measured the total plasma Hcy for 49 healthy individuals, 74 patients with coronary atherosclerosis (CAs), and 7 families having a child with congenital heart disease (n=19). Results: The method is sensitive (detection limit 0.125 μmol.L-1), specific, and has a high reproducibility (CV<2.86%). Its recovery is 101.89%.In the groups of healthy individuals, the mean level of plasma Hcy were significantly higher in men than that in women and children, which were (9.2±1.0) (
±s, the same below); (5.8±0.6), and (5.9±0.4) μmol.L-1 respectively (P<0.05). In the pateines with CAs and the kernel families with CHD the Hcy level were (16.9±1.7) and (28.4±1.2) μmol.L-1 separately, which were significantly higher than the control (P<0.001). Conclusion: homocysteine is a risk factor for As and CHD. the total level of plasma homocysteine may be a subsidiary indicator for the diagnosis of atherosclerosis and congenital heart disease., http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:391-394)
同型半胱氨酸是一种含硫的氨基酸，它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物。早在60年代末，已有学者注意到遗传性高胱氨酸尿症的病人多数同时伴有亚临床期心血管病。Wilcken等[1]通过流行病学调查最先提出同型半胱氨酸是心血管病的一个独立的危险因素。近年的研究进一步证明，高同型半胱氨酸血症不仅是动脉硬化的一个新的独立的危险因素，亦是出生性缺陷的一个危险因子[2，3]。因此，测定血浆总同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)对心血管病和出生性缺陷的诊断、预防和治疗具有重要的意义。但是，目前国内尚很少见报告。本工作应用NaBH4 将含硫氨基酸还原成硫氢基的化合物使其衍生化，再标记以荧光物质monobromobimane，最后进行反相高压色谱分析测定同型半胱氨酸[4，5]，该方法灵敏、特异、重复性好。并测定了正常人、冠状动脉硬化患者和先天性心脏病患儿及父母血浆Hcy的变化。
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1 材料及方法
1.1 材料
标准品L-同型胱氨酸和L-胱氨酸，N-乙基吗啡啉、二硫苏糖醇(dithioerythritol, DTE)、DMSO、正辛醇 (1-octanol)、monobromobimane购于美国Sigma Chemical Co.,硝酸铵、甲酸铵、冰醋酸、乙腈等均为市售试剂。
高压液相分析仪是Shimadzu LC-4A (岛津,日本)。 荧光检测器型号为 FL-3000 (Thermo Separation，美国) 激发波长366 nm, 发射波长476 nm。HPLC反相分析柱为 ODS-3，150 mm×4.6 mm, 5 μm颗粒 (GL Sciences Inc.,日本)。预柱2.5 mm×4.6 mm，购自北京潮声技术公司。
1.2 方法
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1.2.1 研究对象
包括正常人、冠状动脉硬化和先天性心脏病核心家庭成员共142例，分为3组。
正常对照组：49例，其中成年人42例(男性24例女性18例)，年龄为26～70岁，均无冠状动脉狭窄及动脉硬化表现，亦无出生性缺陷及先天性心脏病生育史，临床生化，胸部X线和腹部B超检查，肺、肾、肝功能均未发现异常。其中19例(33～70岁)经冠状动脉造影检查除外冠状动脉硬化。另外有7例正常婴幼儿，年龄6～20个月。
冠状动脉硬化组：74例，其中男性59例，女性15例，年龄38～72岁，均进行冠状动脉造影确诊至少有一支冠状动脉狭窄，其程度达70%以上，而肺、肝、肾功能，血脂，心电图，胸部X线和腹部B超检查均未见明显病变，诊为冠状动脉硬化(coronary atherosclerosis, CAs)者。
先天性心脏病组：7个先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)核心家庭共19例。其中患儿6例，年龄6个月～1岁6个月，室间隔缺损5例，法洛四联症1例；13例双亲，其中父亲6例，母亲7例，年龄26～36岁，其中患室间隔缺损3例。其余经体检、心电图、胸部X线及B超检查未发现异常。
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1.2.2 样品收集及贮存 清晨空腹，用Vacutainer管(becton dickinson, rutherford, NJ)取静脉血，EDTA抗凝，立即离心(3000 r.min-1,40 ℃，5 min)，分离血浆，贮存在-20 ℃备用。
1.2.3 样品衍生化 30 μl 测定样品, 30 μl 4 mol.L-1 NaBH4/0.066 mol.L-1 NaOH/333 ml.L-1 DMSO, 10 μl 1.65 mmol.L-1 DTE/2 mmol.L-1 EDTA, 10 μl 1-octanol, 20 μl 1.8 mol.L-1 HCl，反应3 min后，加入100 μl 1.5 mol.L-1N-乙基吗啡啉, 400 μl H2O 和 20 μl 25 mmol.L-1 monobromobimane/乙腈进行荧光标记, 混合后放置3 min，再加冰醋酸 40 μl终止反应，用0.45 μm 玻璃纤维膜滤过，立即进行色谱分析。
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标准液：50 μmol.L-1 L-同型胱氨酸, 600 μmol.L-1胱氨酸溶于100 μmol.L-1 DTE 的0.1 mol.L-1 HCl 中，作为原液分装贮存于-20 ℃。应用时将原液稀释成不同浓度，同样进行衍生化。
以上试剂除盐酸、乙基吗啡啉缓冲液和水放在室温，样品及其他试剂均置于冰浴中。
1.2.4 色谱分析 取上述衍生化的样品20 μl 注入 150 mm×4.5 mm ODS-3 柱中。于进样前将分析柱用 30 mmol.L-1硝酸铵和 40 mmol.L-1甲酸铵缓冲液 ( pH 3.65 )平衡，进样后以5.0%～11.0%(体积分数)乙腈进行梯度流洗，流速 2.0 ml.min-1。共洗脱20 min，以366 nm 和476 nm荧光波长检测其密度。
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2 结果
2.1 特异性测定
取50 μmol.L-1 L-同型胱氨酸和20 μmol.L-1 L-胱氨酸 各15 μl 进行衍生化及色谱分析，结果见图1。L-胱氨酸和L-同型胱氨酸的保留时间分别为8.0及10.5 min。
1，cysteine;2,homocysteine
图1 同型半胱氨酸的特异性
Figure 1 Specificity of homocysteine
2.2 标准曲线
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分别以0、0.25、0.5、1、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0 μmol.L-1的标准Hcy进行HPLC测定，作标准曲线，结果见图2。由图2可以看出Hcy浓度在0.25～50 μmol.L-1之间，呈剂量线性关系，其相关系数r=0.99。最小检出量为0.125 μmol.L-1。
图2 同型半胱氨酸测定的标准曲线及线性关系
Figure 2 Standard curve, and linearity of the assay for homocysteine
2.3 重复性
, 百拇医药 取同一血样于1周内反复测定6次，其CV<2.62%。同一样品分别于1个月内不同时间重复测定10次，其CV<4.37 %。将15 μl 20、40、60 μmol.L-1的L-同型胱氨酸分别加入15 μl 同一份血浆中，依上述方法衍生化和色谱分析，进行平行试验。其结果亦呈线性关系(图2)。
1， cysteine; 2, homocysteine.
2.4 回收率
将15 μl 25 μmol.L-1 Hcy、15 μl血样和15 μl 25 μmol.L-1 Hcy 加15 μl的血浆，3种样品分别进行衍生化和HPLC测定，计算其回收率为101.89%。
2.5 正常人和冠状动脉硬化患者及先天性心脏病核心家庭血浆总Hcy浓度变化
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正常成人平均Hcy浓度为(8.4±0.6) μmol.L-1，其中男性血浆Hcy浓度为(9.2±1.0) μmol.L-1，18例女性为(5.9±0.6) μmol.L-1，男性高于女性，男女两组比较有统计学差异(P<0.05 )；正常婴幼儿水平为(5.9±0.4) μmol.L-1。冠状动脉硬化患者平均血浆Hcy 浓度为(16.9±1.7) μmol.L-1，明显高于对照组的平均水平 (P<0.05)；其中男性为(18.9±2.0) μmol.L-1，女性为8.7±1.6 μmol.L-1，男女两组比较亦具有统计学差异(P<0.05)。结果见图3。
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# P<0.05, compared with the control and the patients with CAs respectively，*** P<0.001, compared with adult male of the control and the patient with CAs.
图3 对照组与冠状动脉硬化患者血浆Hcy浓度的变化
Figure 3 The changes of plasma Hcy concentration for the controls and the patients with CAs
生育有先天性心脏病子女的双亲和先天性心脏病婴儿，其血浆Hcy的变化如图4所示。患儿父亲为(25.9±2.5) μmol.L-1，母亲(30.1±3.7) μmol.L-1，患儿(9.6±1.1) μmol.L-1。由图4可以看出，生育先天性心脏病的父母和患儿血浆Hcy水平均明显高于正常对照组(P<0.001，P<0.001及P<0.01)，其中母亲的血浆Hcy升高尤为显著。
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* P<0.05, *** P<0.001， vs control.
图4 对照组与先天性心脏病核心家庭血浆Hcy浓度的变化
Figure 4 The changes Hcy concentration in plasma for the control,parents and child with congenital heart disease
3 讨论
血浆总同型半胱氨酸测定法有放射性酶测定、气相色谱、氨基酸分析柱后衍生 (amino acid analyzer, postcolumn derivatization)、衍生化-HPLC-荧光检测 (precolumn derivatization, HPLC, and fluorescence)和HPLC 电化学测定 (HPLC and electrochemical detection)等方法。当前应用较普遍的为后两种[5]。其特异性强、灵敏度高、重复性好。本工作应用HPLC柱前衍生化方法测定Hcy的最小检测量为0.125 μmol.L-1, 批内差异为CV<2.62%, 批间差异为4.37%，回收率为101.89%。说明应用柱前衍生化-HPLC测定血浆总Hcy是一个较好的方法。
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本文报告正常人血浆总Hcy浓度平均为(8.4±0.8) μmol.L-1，男性高于女性，该结果与国外报告一致[5，6]。一般认为血浆总Hcy正常范围为5～15 μmol.L-1,高于14 μmol.L-1时即可诊断为高同型半胱氨酸血症。
高同型半胱氨酸血症是动脉硬化和出生性缺陷的一个新的独立危险因子[1～3]。本工作亦证明冠状动脉硬化患者和先天性心脏病的婴儿和双亲，血浆同型半胱氨酸的平均水平明显高于正常人。因此，测定血浆Hcy水平，可以作为动脉硬化和先天性心脏病诊断的一个辅助指标。但是，在本组74例冠状动脉硬化和7个出生性缺陷核心家庭中的19个成员，并非所有患者血浆Hcy均升高，冠状动脉硬化患者血浆Hcy升高只有28例，约占37.8%。在先天性心脏病的家族成员中血浆Hcy升高者，13例父母亲有10例，占76.9%，6例患儿中有1例，占16.7%。因此，高同型半胱氨酸血症是动脉硬化和先天性心脏病的一个危险因素，但是并不是唯一因素。在出生性缺陷核心家庭中以母亲Hcy水平升为主，父亲Hcy水平不如母亲升高明显，因此，孕妇高Hcy水平可能在先天性心脏病的发生中，更具有重要意义。
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关于Hcy诱发动脉硬化和出生性缺陷的机制尚不十分了解。我们和一些实验室报告，高Hcy不仅可以诱发内皮细胞的损伤[6，7]，而且还可以引起血管平滑肌增殖[8，9]，给鸡胚注射Hcy不仅可以诱导先天性心脏病，而且还可以诱导产生神经管畸形。最近，我们应用差异分析的方法，从大鼠血管平滑肌细胞中克隆到一个Hcy诱导的基因，其全长cDNA为2 014 bp，可编码142个氨基酸的蛋白质，它可能是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的新成员，与细胞死亡蛋白及TNF诱导凋亡基因有高度同源性[10]。它在动脉硬化和出生性缺陷发生中的意义正在研究中。
注：国家863计划及国家自然科学基金(2230522517， 2231548517)资助课题；
☆自由词。
参考文献
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5 Ueland PM, Refsum H, Stabler SP, et al. Total homocysteine in plasma or serum: Methods and Clinical aplications. Clin Chem, 1993, 39(9):1 764-1 779
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7 Tsai JC, Perrella MA, Yoshizumi M, et al. Promotion of vascular smooth muscle cell growth by homocysteine: a link to atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:6 369-6 373
8 田学军，周爱儒，汤 健. 同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用. 中国生物化学与分子生物学报， 1998，14(1):108-112
9 陈光慧，朱燕青，高 炜，等. 同型半胱氨酸/半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞中的新cDNA. 中国生物化学与分子生物学报， 1998，14(1):8-14
(1998-12-02收稿), 百拇医药